植物精油[1]是从芳香植物中的器官通过压榨、蒸馏等方法制备而得,最常用的方法为水蒸气蒸馏法[2],该方法适用于水溶性较差精油的提取。植物精油用途广泛,常因为其沁人心脾的香味及广泛的抑菌性而用于化妆品中,桂宇豪等[3]对6种精油的研究表明,精油具有温和性与适当的保鲜作用,从而使化妆品中防腐剂用量及刺激性均有所降低。天然植物中提取出来的有效杀菌成分,其所具有的优点是其他杀菌剂所无法比拟的,即容易分解、毒性较低、安全环保[4]、抗药性产生率低[5]等,其相比于毒性较强、残留量较高的化学合成杀菌剂[6],天然的植物精油更受欢迎,更安全且环保性能更高[7],并且具有能让水果保鲜的特性[8],契合当今人们的需求,具备良好的应用前景和发展优势,是一种极有潜力的生物资源[9]。
肉桂属于樟科植物,其主要成分肉桂醛具有良好的抑菌作用[10];紫苏是唇形科植物,在我国资源丰富,苑佳佳[11]研究表明不同品种的紫苏叶精油对于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均具有抑菌作用;牛至常作为调味品使用,由于酚类及萜烯类的存在使其具有较强的抗菌性[12]。消毒剂是指具有消毒作用的药物,主要作用于细胞壁、细胞膜及核酸[13]。复配精油可缓解单一植物精油的弊端,推动新型消毒剂的研发,进一步优化配比,实现可持续发展[14]。王帆等[15]研究表明,不同精油间的复配有抑菌增效的作用,在保证抑菌作用的前提下可有效降低所需生产成本。
各种肉及肉制品是人类获取蛋白质、维生素等营养成分的重要来源,肉制品品质的好坏直接关系到人类健康,随着人们生活水平的提高,人们对肉制品的质量要求也愈来愈高。肉制品品质的评定指标主要包括感官特征、营养价值、理化性质等,因此,通过测定肉制品水分含量、pH值、蛋白质含量、感官指标以及菌落总数等可以更好地反应肉制品的好坏程度。目前,对鲜切猪肉防腐保鲜的主要方法是使用化学合成防腐保鲜剂,虽然化学合成防腐保鲜剂的防腐保鲜效果较好,但很多市售化学合成保鲜剂通常含有对人体健康存在潜在危害的化学合成类物质,不利于保障食品安全与人类健康。因此,本试验通过研究肉桂精油、紫苏精油和牛至精油复配时的抑菌作用,制备一种以植物精油为主要成分的天然防腐保鲜剂,并对鲜切猪肉的抑菌作用进行研究,以期为新型植物精油抑菌保鲜剂的制备提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
肉桂精油、紫苏精油、牛至精油均由水蒸气蒸馏法提取所得;新鲜猪肉若干,山西省太原市连锁超市;其他试剂均为分析纯试剂,上海麦克林生化科技有限公司。大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC 44568、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CGMCC 26085,中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.2 实验方法
1.2.1 Tween-80浓度确定
植物精油消毒剂制备过程中“油水互溶”是关键技术之一,Tween-80作为一种增溶剂[16],极易吸附到油水界面处[17],从而增加精油在水中的溶解性,进一步促进油水体系的均一性与稳定性,因而,本实验采用Tween-80为增溶剂,设置添加量梯度为5、10、15、20 μL/mL,固定精油含量为10 μL/mL,利用超声波振荡仪振荡2～3 min,使其充分混合均匀。通过观察油水体系的透明度来判断Tween-80的最佳浓度。
1.2.2 三种精油的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)
取无菌96孔板,以无菌水作对照,采用微量二倍稀释法[18],获得精油质量浓度为0～20 mg/L的菌悬液,37 ℃培养24 h。同一菌种同一精油操作重复3次。在小孔内或试管内可完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为MIC[17]。
1.2.3 复配精油分级抑菌浓度(graded bacteriostatic concentration,FIC)指数
根据单一植物精油MIC,采用棋盘稀释法[18],将肉桂精油、紫苏精油及牛至精油进行两两复配。取无菌96孔板,在1～6列依次加入2、1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC一种精油50 μL,在A～F行依次加入2、1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC的另一种精油50 μL,最后加入菌液50 μL,37 ℃培养24 h。每一种复配重复做3次。FIC指数[19]是对两种抗菌药的联合药敏情况的描述,包括协同、相加、无关和拮抗4种情况,其计算如公式(1)所示:
分级抑菌浓度
(1)
式中:A0为A组分联合使用时的MIC值;A为A组分单独使用时的MIC值;B0为B组分联合使用时的MIC值;B为B组分单独使用时的MIC值。当FIC≤0.5时为协同作用,当0.05
1.2.4 复配精油抑菌保鲜剂对鲜切猪肉的保鲜作用
将新鲜猪肉平均分成空白对照组(CK:直接放入密封性良好的保鲜)和实验组(放入密封性良好的保鲜盒后,将最优比例复配精油抑菌保鲜剂浸泡过的活性炭置于培养皿中,并放入保鲜盒),每天取样测定鲜切猪肉的生化指标。参考GB/T 5009.3—2016《食品中水分的测定》,采用直接干燥法测定水分含量;参考GB/T 5009.237—2016《食品pH值的测定》测定猪肉pH值;采用高盐法提取蛋白质[20],考马斯亮蓝法测定猪肉中蛋白质含量[16];参考GB/T 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》及平板计数法测定猪肉中微生物总量;用色差仪对猪肉糜的L*值、c*值、h*值进行测定并记录,每个试样取3个点进行测量。
1.3 数据处理与统计分析
实验数据均为3次重复试验结果的平均值,采用Origin 2019软件进行作图,采用SPSS 17.0软件进行差异性分析,P<0.05表示具有显著的统计学差异,P<0.01表示具有极显著统计学差异。
2 结果与分析
2.1 Tween-80浓度
通过比对,当Tween-80含量为15 μL/mL时,总体系开始清澈透明,且静置一段时间后仍呈现为透明均一的单相液体,因此,本次实验操作所用Tween-80含量为15 μL/mL。
2.2 三种精油对两种供试菌的MIC
通过微量二倍稀释法测定3种精油对两种供试菌的MIC,结果如图1所示,肉桂精油、紫苏精油、牛至精油对于E.coli和S.aureus均具有抑菌作用,3种精油对E.coli和S.aureus的抑菌效果均表现为肉桂精油>紫苏精油>牛至精油。
图1 植物精油的MIC
Fig.1 MIC of essential oils
2.3 复配精油FIC指数
2.3.1 肉桂精油-紫苏精油的联合抗菌效果
表1为肉桂精油与紫苏精油复配物对E.coli和S.aureus的抑制效果。在体积比为1：1时,肉桂精油与紫苏精油的联合作用对E.coli的MIC为1/2 MICCEO～1/8 MICPEO,对S.aureus的MIC为1/2 MICCEO～1/4 MICPEO。其FIC值如表2所示,结合FIC指数的判定标准可知,肉桂-紫苏精油复配物对E.coli和S.aureus的FIC值均>0.5且≤1,2种精油的联合作用比单一作用均表现为相加作用,复配精油的MIC值较一种精油单独使用时的MIC值都有显著的降低,复配精油对E.coli的MIC值为2种精油单独使用的1/2和1/8倍;对S.aureus的MIC值为2种精油单独使用的1/2和1/4倍。
表1 肉桂-紫苏精油复配物对E.coli和S.aureus的抑制效果
Table 1 Antibacterial effect of cinnamon-perilla essential oil complex on E.coli and S.aureus
紫苏精油肉桂精油2 MICCEO1 MICCEO1/2 MICCEO1/4 MICCEO1/8 MICCEO1/16 MICCEOESESESESESES2 MICPEO————————————1 MICPEO———————+—+++1/2 MICPEO———————+++++1/4 MICPEO——————++++++1/8 MICPEO—————+++++++1/16 MICPEO————++++++++
注:E为E.coli,S为S.aureus,“—”、“+”为菌落生长情况,分别代表“无菌”、“有菌”(下同)。
表2 肉桂-紫苏精油复配FIC指数
Table 2 FIC index of cinnamon-perilla essential oil complex
菌名肉桂精油MIC/(mg/L)紫苏精油MIC/(mg/L)单用联合单用联合FIC指数E.coliMIC(0.312 5)1/2 MICMIC(0.625)1/8 MIC0.625S.auresMIC(0.625)1/2 MICMIC(1.25)1/4 MIC0.75
2.3.2 肉桂精油与牛至精油的联合抗菌效果
表3为肉桂精油与牛至精油复配物对E.coli和S.aureus的抑制效果。在体积比为1：1的前提下,肉桂精油与牛至精油的联合作用对E.coil的MIC为1/8 MICCEO～1/2 MICOEO,对S.aureus的MIC为1/4 MICCEO～1/4 MICOEO。其FIC值如表4所示,肉桂精油与牛至精油复配后对于E.coli的FIC值>0.5且≤1,2种精油的联合作用效果表现为相加作用,对E.coli的抑制作用显著增强,其MIC值为2种精油单独使用的1/8和1/2倍;肉桂精油与牛至精油复配后对于S.aureus的FIC值为0.5,2种精油的联合作用比单一作用表现为协同作用,其MIC值为两种精油单独使用的1/4倍。
表3 肉桂-牛至精油的复配物对E.coli和S.aureus的抑制效果
Table 3 Antibacterial effect of cinnamon-oregano essential oil complex on E.coli and S.aureus
牛至精油肉桂精油2 MICCEO1 MICCEO1/2 MICCEO1/4 MICCEO1/8 MICCEO1/16 MICCEOESESESESESES2 MICOEO————————————1 MICOEO————————————1/2 MICOEO——————————++1/4 MICOEO——————+—++++1/8 MICOEO————+—++++++1/16 MICOEO————++++++++
表4 肉桂-牛至精油复配FIC指数
Table 4 FIC index of cinnamon-oregano essential oil complex
菌名肉桂精油MIC/(mg/L)牛至精油MIC/(mg/L)单用联合单用联合FIC指数E.coilMIC(0.312 5)1/8 MICMIC(5)1/2 MIC0.625S.aureuMIC(0.625)1/4 MICMIC(5)1/4 MIC0.5
2.3.3 紫苏精油与牛至精油的联合抗菌效果
表5为紫苏精油与牛至精油复配物对E.coli和S.aureus的抑制效果。在体积比为1：1的前提下,紫苏精油与牛至精油的联合作用对E.coli的MIC为1/2 MICPEO～1/2 MICOEO,对S.aureus的MIC为1/8 MICPEO～1/2 MICOEO。其FIC值如表6所示,紫苏-牛至精油复配物对于E.coli和S.aureus的FIC值均>0.5且≤1,2种精油的联合抑菌作用均表现为相加作用,联合抑菌作用显著高于单一精油的单独抑菌作用。
表5 紫苏-牛至精油的复配物对E.coli和S.aureus的抑制效果
Table 5 Antibacterial effect of perilla-oregano essential oil complex on E.coli and S.aureus
牛至精油紫苏精油2 MICPEO1 MICPEO1/2 MICPEO1/4 MICPEO1/8 MICPEO1/16 MICPEOESESESESESES2 MICOEO————————————1 MICOEO——————+—+—++1/2 MICOEO——————+—+—++1/4 MICOEO——+—++++++++1/8 MICOEO+—++++++++++1/16 MICOEO++++++++++++
表6 紫苏-牛至精油复配FIC指数
Table 6 FIC index of perilla-oregano essential oil complex
菌名紫苏精油MIC/(mg/L)牛至精油MIC/(mg/L)单用联合单用联合FIC指数E.coliMIC(0.625)1/2 MICMIC(5)1/2 MIC1S.aureusMIC(1.25)1/8 MICMIC(5)1/2 MIC0.625
2.3.4 复配精油FIC值对应浓度的抑菌效果
LB固体培养基表面对照组菌落致密,甚至多数呈菌苔状;实验组中菌落稀疏,其菌落数如图2所示,3种复配组合中肉桂-紫苏精油复配物的抑菌效果显著优于其他2种复配精油。
图2 复配精油的菌落数
Fig.2 Colony number of essential oils complex
注:**表示P<0.01。
2.4 肉桂-紫苏精油复配抑菌保鲜剂对鲜切猪肉的保鲜效果
2.4.1 复配抑菌保鲜剂处理对鲜切猪肉水分含量的影响
鲜切猪肉中占比最大的是水分,鲜切猪肉在贮藏期间,由于外界环境的变化等因素,鲜肉中的水分会发生蒸腾作用,导致水分迅速流失,表面松弛,弹性丧失,质地下降。由图3可知,随着贮藏时间的延长,鲜猪肉的含水量不断下降,呈现出持续的失重现象。但在贮藏1～4 d,空白对照组含水量从23%下降到5%,而实验组含水量从23%上升到18%,实验组水分含量在贮藏期间显著高于对照组。因此肉桂-紫苏精油复配抑菌保鲜剂处理可以一定程度的防止鲜切猪肉水分过快的损失,从而延缓猪肉的萎缩与品质的下降。
图3 复配抑菌保鲜剂处理对鲜切猪肉水分含量的影响
Fig.3 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on water content of freshly cut pork in storage
2.4.2 复配抑菌保鲜剂处理对贮藏中鲜切猪肉pH值的影响
由图4可知,随着贮藏时间的延长,鲜切猪肉pH值呈现逐渐增大的趋势,且空白对照组pH值增幅较实验组大。在贮藏1 d后,空白对照组猪肉pH值已经超过7.00,而实验组对pH值的平衡作用在1～3 d较为显著,且实验组pH值始终低于空白组。这可能是由于蛋白质的降解所致,蛋白质是一种高分子的两性化合物,是影响肌肉pH的重要因素,随贮藏时间的延长,在微生物及其分泌的酶的作用下,肌肉蛋白被降解为多肽和氨基酸,并释放碱性基团,从而使肉的pH值逐渐升高,同时加热处理对pH值也有影响[21-22]。
图4 复配抑菌保鲜剂处理对贮藏中鲜切猪肉pH的影响
Fig.4 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on pH of freshly cut pork in storage
2.4.3 复配抑菌保鲜剂处理对贮藏中鲜切猪肉蛋白质含量的影响
猪肉中除水分以外的主要组分是蛋白质和脂质,肌肉中蛋白质大致分为四类,其中,肌原纤维蛋白也称为盐溶性蛋白,约占总蛋白含量的50%[23],在鲜肉贮藏过程中,微生物会对其蛋白质进行分解,导致蛋白质含量下降。由图5可知,虽然蛋白质含量都在下降,但空白对照组蛋白质含量都在实验组之下,证明肉桂-紫苏精油复配抑菌保鲜剂可有效抑制蛋白质的分解。
图5 复配精油抑菌剂处理对贮藏中蛋白质含量的影响
Fig.5 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on protein content of freshly cut pork in storage
2.4.4 复配抑菌保鲜剂处理对贮藏中鲜切猪肉微生物数的影响
肉类食品中腐败微生物的来源十分广泛,污染的主要微生物有肠杆菌属、莫拉氏菌属、假单胞菌、气单胞菌等[24]。菌落总数是评价食品安全时的重要指标,可以用来预测食品的保质期,同时可以作为食品细菌污染指标,是判定肉类被污染指数的主要依据之一[25]。由图6可知,空白对照组猪肉在贮藏5 d后,其细菌数已超过5.0×106 CFU/g,成为变质肉,而实验组第8天仍未变质,且空白对照组菌落增长速度比实验组快,证明肉桂-紫苏精油复配抑菌保鲜剂对细菌有抑制作用。
图6 复配抑菌保鲜剂处理对贮藏中鲜切猪肉微生物菌数的影响
Fig.6 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on number of bacterial of freshly cut pork in storage
2.4.5 复配抑菌保鲜剂处理对贮藏中鲜切猪肉色泽的影响
肉桂-紫苏精油复配抑菌保鲜剂处理对猪肉L*(亮度)、C*(色度值)、H*(色调值)的影响如图7所示。随着贮藏时间的延长,实验组与空白对照组牛肉亮度与色度均呈现降低的趋势,但实验组牛肉亮度显著高于空白对照组,说明肉桂-紫苏精油复配抑菌保鲜剂处理可有效保持牛肉的亮度;随着贮藏时间的延长,猪肉色调值变化呈现逐渐增大的趋势,且空白对照组均高于实验组。色泽是消费者购买肉类时最直观的指标,决定牛肉颜色的主要是肌红蛋白和血红蛋白。因此,肉桂-紫苏精油复配抑菌保鲜剂可能是通过影响牛肉中肌红蛋白和血红蛋白的含量从而达到保鲜猪肉的作用。
A-亮度;B-色度;C-色调
图7 复配抑菌保鲜剂处理对贮藏中猪肉亮度、色度和色调的影响
Fig.7 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on L*, C*, H* value of freshly cut pork in storage
3 结论与讨论
本研究所选取的肉桂精油、紫苏精油、牛至精油均是天然可食用植物的代谢产物,与化学合成物相比,都是绿色、安全、广谱且可食用原料,均具有较好的抑菌作用。对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌而言,肉桂精油的抑菌作用最强,紫苏精油次之,牛至精油的抑菌作用最差;将3种精油两两复配,除肉桂-紫苏精油复配物对金黄色葡萄球菌的联合抗菌作用表现为协同作用外,其余精油间的复配组合对于2种不同供试菌的联合抗菌效果均表现为相加作用,其中,肉桂-紫苏精油复配物对两种供试菌种的抗菌效果最佳,且复配植物精油相比单一精油具有更加芳香、愉悦的香气,作为天然抗菌剂在食品领域具有广阔的应用前景。随着人们生活水平的提高及对肉类食品的青睐,色泽均匀、鲜嫩多汁且营养丰富的鲜肉成为货架上的宠儿,然而,鲜肉在生产及销售的过程中极易受到微生物的污染,从而使鲜肉的品质下降,货架期缩短,目前,对鲜肉微生物的控制措施主要集中在化学抑菌剂的应用,如添加一定浓度的山梨酸钾或者柠檬酸可抑制微生物的生长,防止鲜肉变质和营养成分的损失[26];虽然化学抑菌剂抑菌效果良好,但是植物源抑菌剂,尤其是辛香料植物精油由于具有广谱的抗氧化和抑菌作用,往往更受人们青睐,常被优先选作天然的抑菌原料。根据栅栏技术原理[27],将不同的植物精油进行复配,既可以发挥其协同或相加作用,增强抑菌效应,又可以减少单一精油的使用量,使每种精油的使用量保持在较低的浓度范围内,节约成本。因此,使用复配精油对鲜切肉进行保鲜抑菌已成为肉类保鲜的必然趋势,本研究中肉桂-紫苏精油复配物在一定程度上可以抑制鲜切猪肉水份和蛋白质含量的损失、有效抑制大肠杆菌等微生物的生长和pH值的升高,保持鲜切猪肉的色泽和亮度,从而延长鲜切猪肉的货架寿命。植物精油在防腐保鲜剂产业发展过程中,有着巨大的潜力,安全高效的防腐保鲜剂已经逐渐融入到我们所现有的生产中,同时还被嵌入形成腐烂后进行精准控制的技术中,这些都可以取代或减少有害的传统化学防腐保鲜剂的使用,本次实验可为植物精油抑菌保鲜剂的制备以及鲜切肉的抑菌保鲜提供一定理论参考。
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