苹果因具有口味甘甜、便于贮藏,能满足全年供应等特点而备受广大种植户和消费者喜爱[1]。但是苹果因贮藏及运输等原因,会造成大量的经济损失,其中采后贮藏过程中由于侵染真菌导致苹果病害占主要部分,全世界每年大约会有6%～8%的苹果因为被粉红单端孢霉侵染引起苹果腐心病而损失[2]。此病菌主要侵染苹果、梨等水果,其中苹果以红富士苹果最易染病,在适宜病菌生长且苹果贮藏不利的条件下,发病率高达40%[3-4]。
粉红单端孢霉(Trichothecium roseum)作为引起果蔬采后病变的重要病原微生物,在我国分布比较广泛,在谷草、麦草等均有寄生,其可引起苹果腐心病[5]、芒果果霉病[6]、甜瓜黑斑病[7]等。此外,该病毒还会产生单端孢霉烯毒素,此毒素对人和动物均有一定的危害[8-9]。目前,主要运用高效液相色谱法[10-11]、气相色谱法[12]和液相色谱串联质谱法[13]等方法进行果蔬中真菌毒素的检测,应用最广的为液相色谱串联质谱法。本研究将采用固相萃取柱结合超高效液相色谱串联质谱法进行毒素的定性定量检测。
苹果作为我国产量最高的水果,种植区域遍布全国各地[14],为了增加苹果的经济价值,需要将苹果从产地运往主消费区。公路运输作为商业运输的主要方式被大量采用,但是在运输过程中会因为振动等原因产生机械损伤,从而增加苹果腐心病的发生,缩短果实的贮藏期,增加经济损失。到目前为止,国内尚无关于运输及运输包装方式对苹果贮藏期苹果腐心病、接种粉红单端孢霉后发病情况及相关品质影响的研究。因此,本研究以富士苹果为材料,采用固相萃取-超高效液相色谱质谱法对不同运输包装的染病苹果毒素含量进行检测,并测定苹果的生理指标,探究不同运输包装方式对苹果毒素含量及生理指标的影响,为今后通过调控运输包装方式而降低苹果中毒素含量和保持品质提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
市售烟台红富士苹果,购自天津市红旗农贸综合批发市场;聚氯乙烯(polyvinylchlorid,PVC)膜:膜厚度为50 μm,O2渗透率为4 081.0 mL/(m2·d·101 Pa),CO2渗透率为25 902 mL/(m2·d·101 Pa),环境相对湿度为50%时透湿率为13.1 g/(m2·d)。
粉红单端孢霉,北纳创联生物技术有限公司;赭曲霉素A(ochratoxin A,OTA)标准品、T-2毒素标准品、HT-2毒素标准品、镰刀菌烯酮(fusarenon X,Fus-X)标准品、新茄腐镰刀菌烯醇(neosolaniol,NEO)标准品、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)标准品、乙二酰蔍草镰刀菌烯醇-蛇形毒素(diacetoxyscirpenol,DAS)标准品、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol,3-AcDON)标准品、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyl deoxynivalenol,15-AcDON)标准品,美国Romer公司;马铃薯葡萄糖琼脂培养基、乙醇、乙腈(分析纯)、乙腈(质谱纯)、柠檬酸、氯化钠,天津韵尼科技有限公司;氮气(纯度≥99.999%):天津市津西环达化工气体经营部。
1.2 仪器与设备
温湿度记录仪,深圳市速王科技有限公司;DHP-2042BS恒温培养箱,美国赛默飞世尔科技公司;TAISITE数显恒温水浴锅,苏州江东精密仪器有限公司;PAL-2数显糖度计,日本爱拓;PHS-3E数显酸度计,上海雷磁仪器厂;振动记录仪、CA-10呼吸代谢测定仪,美国Stable Systems仪器公司;N-EVAP-112氮吹仪,美国Organomation公司;VORTEX-BE1涡旋混合器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;GC-14C气相色谱仪,日本岛津公司;Acquity TM超高效液相色谱-Xevo TQ-S串联质谱仪,美国Waters公司;DT-178A振动记录仪,美国CEM公司。
1.3 实验方法
1.3.1 实验流程
实验流程如下:
菌种培养→制备孢子悬浮液→接种在苹果上→培养→测定指标
1.3.2 菌种培养
在超净工作台上,将粉红单端孢霉标准菌株转接于事先配制好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上,在25 ℃恒温恒湿培养箱培养好后,采用平板划线法转接到PDA培养皿上,后将培养皿放在25 ℃恒温恒湿培养箱中培养7～8 d,留作备用。
1.3.3 孢子悬浮液制备
将BI等[15]方法稍加修改后进行孢子悬浮液的制备,用血球计数板进行计数,每个样品进行2～3次重复计数,计算出每毫升孢子悬浮液中所含孢子细胞数,并计算出孢子悬浮液浓度,将孢子悬浮液浓度调节至108个/mL。每毫升孢子悬浮液中所含孢子细胞数的计算如公式(1)所示:
(1)
1.3.4 选果与接种
随机选取成熟度和大小一致的苹果,用75%(体积分数)酒精对苹果表面消毒后,放在超净工作台上进行接种,用灭菌打孔器在苹果赤道位置均匀打4个孔,每个孔注入50 μL孢子悬浮液,每个处理组接种35个苹果。
1.3.5 不同包装处理及运输
将PVC膜和带孔包装箱用紫外线和臭氧消毒,后将已接种好的苹果放入到包装箱内,并用PVC膜包装,处理组分别为无PVC膜包装(裸露包装),苹果直接放在已经消毒过的带孔包装箱中敞口放置;PVC膜不密闭包装(敞口包装),苹果放在已经消毒过的带孔包装箱中并用PVC膜包装,PVC膜不进行扎口处理;PVC膜密闭包装(掩口包装),苹果放在已经消毒过的带孔包装箱中并用PVC膜包装,PVC膜用绳子扎口并扎紧,后将温湿度记录仪和振动记录仪固定到包装箱内,后将已接种且包装好的苹果进行运输,运输均在一级、二级公路上完成,运输温度为(18±5) ℃,运输时间为12 h,其中4 h在一级公路上运输,8 h在二级公路上运输,通过振动记录仪测得运输过程中平均振动加速度为1.36 g,将已接种且包装好但未运输的苹果作为对照组,将对照组置于18 ℃恒温恒湿培养箱中培养12 h,后将运输与未运输苹果置于恒温恒湿培养箱中贮藏,每5 d进行1次毒素和生理生化指标测定。
1.4 测定指标及方法
1.4.1 粉红单端孢霉含量测定
1.4.1.1 粉红单端孢霉生长曲线
借助数显游标卡尺,采用十字交叉法测定苹果病斑纵横直径,取平均值作为苹果病斑的腐烂直径,并以培养时间为横坐标,腐烂直径为纵坐标绘制粉红单端孢霉生长曲线,当腐烂直径>60 mm时结束测量。
1.4.1.2 苹果中TeA毒素含量的测定
将刘文静等[16]方法稍加修改后,进行已接种苹果中毒素含量的测定。
1.4.2 生理指标测定
1.4.2.1 可溶性固形物含量的测定
用PLA-2数显糖度计测量已接种苹果中的可溶性固形物含量,随机选取6个苹果进行测量,将每个苹果未发生腐烂部位切块榨汁,纱布过滤后测量,每个苹果测量3次,其结果用百分比表示。
1.4.2.2 可滴定酸含量的测定
用PHS-3E数显酸度计进行已接种苹果中可滴定酸含量的测定,随机选取6个苹果进行测量,将每个苹果未发生腐烂部位切块榨汁,纱布过滤后测量,每个苹果测量3次,其结果用百分比表示。
1.4.2.3 呼吸强度测定
将GAO等[17]的方法稍加修改后进行已接种苹果呼吸强度的测定,随机选取6个苹果进行测量,闷气时间为1 h,每个处理设置3个平行。单位是mg CO2/(kg·h)。
1.4.2.4 乙烯释放量的测定
将白鸽等[18]方法稍加修改后,采用GC-14C型气相色谱仪进行乙烯释放量的测定,单位是(μL/kg·h)。
1.5 数据统计与图形分析
实验所得数据均为平均数±标准差(standard deviation, SD)表示,Origin 2021软件进行作图及统计分析,SPSS 19.0软件进行统计分析,用ANOVE分析数据间显著性,置信水平P<0.05。
2 结果与分析
2.1 不同运输包装方式对接种苹果中粉红单端孢霉产毒的影响
2.1.1 不同运输包装方式对粉红单端孢霉生长曲线的影响
不同运输包装方式的接种苹果贮藏到第28天时,贮藏效果如图1所示,裸露包装运输的接种苹果的菌落直径最大。粉红单端孢霉生长曲线如图2所示,在贮藏后期,采用相同的包装方式时,经过运输的接种苹果的粉红单端孢霉生长情况与未运输的接种苹果的粉红单端孢霉生长情况相比,存在显著性差异(P<0.05),这说明运输过程会加剧苹果腐心病的发病进程。在贮藏期内,各个处理组接种苹果中粉红单端孢霉的生长也会进一步加快。不同的包装方式会使接种苹果中粉红单端孢霉的生长情况产生差别,顺序依次是裸露包装>敞口包装>掩口包装。结果表明接种苹果在运输过程中产生的机械损伤会进一步促进粉红单端孢霉的侵染进程,并且,运输过程中采取的包装方式也会使苹果腐心病的发病情况受到影响。
图1 不同运输包装方式的接种苹果贮藏第28天时的图片
Fig.1 Pictures of inoculated apples with different transportation packaging methods on the 28th day of storage
图2 不同运输包装方式对粉红单端孢霉生长曲线的影响
Fig.2 Effects of different transportation packaging methods on the growth curve of Trichothecium roseum
2.1.2 不同运输包装方式对接种苹果TeA毒素含量的影响
苹果在接种粉红单端孢霉后进行运输过程中,仅会产生TeA毒素。已接种苹果中TeA毒素含量如表1所示,在苹果接种粉红单端孢霉后运输之前,均会有TeA毒素的积累。随着贮藏时间的延长,各组接种苹果中TeA毒素含量显著增加(P<0.05)。在常温运输后,处理组接种苹果中TeA毒素显著高于对照组(P<0.05),这可能是因为接种苹果在运输过程中产生一定程度的机械损伤,从而加快了接种苹果的采后代谢和粉红单端孢霉的侵染,导致毒素积累量增加。3种包装方式中,裸露运输毒素积累量显著高于敞口运输和掩口运输(P<0.05),此结果与接种苹果经运输后粉红单端孢霉的生长情况相对应。
表1 不同运输包装方式对接种苹果TeA毒素含量的影响 单位:μg/L
Table 1 Effects of different transportation packaging methods on the content of TeA toxin in inoculated apples
运输包装贮藏时间/d0510152025裸口未运输n.dn.d59.9±1.1127.5±0.5559.5±0.5904.6±1.9裸口运输n.dn.d72.8±1.3178±0.6759.8±0.81685.4±3.2敞口未运输n.dn.d96.8±0.2113.2±0.8501.2±1.3649.5±0.5敞口运输n.dn.d119.2±0.5169.2±0.4597.9±0.6697.2±0.2掩口未运输n.dn.d74.3±0.298.7±0.6457.8±1.3573.2±0.4掩口运输n.dn.d99.1±0.6157.6±0.6560.7±0.6605.1±0.9
注:“n.d.”表示未检出(低于定量线)。
2.2 不同运输包装方式对接种苹果相关生理指标的影响
2.2.1 不同运输包装方式对接种苹果可溶性固形物含量的影响
苹果中可溶性固形物含量是评价苹果品质的主要指标,不同运输包装方式接种苹果中可溶性固形物含量变化如图3所示。接种苹果在运输过程中会产生一定程度的机械伤,这会使果实的生理代谢紊乱,从而产生不良的生理反应。接种苹果中的可溶性固形物含量在贮藏前期缓慢上升,且在第15 天、第15 天、第5 天、第5 天、第5 天、第5 天时,裸口未运输、裸口运输、敞口未运输、敞口运输、掩口未运输和掩口运输处理组接种苹果中可溶性固形物含量达到峰值,除去裸露包装处理组,其余2个包装处理组运输处理与未运输处理的接种苹果可溶性固形物含量均存在显著性差异(P<0.05)。后随着贮藏时间的延长,各个处理组接种苹果的可溶性固形物含量开始下降,在贮藏结束时,处理组接种苹果可溶性固形物含量均显著低于与其对应的对照组接种苹果可溶性固形物含量(P<0.05)。原因可能是运输过程中产生的振动加快了接种苹果的生理代谢活动,且产生的机械损伤会进一步促进粉红单端孢霉的侵染以及TeA毒素的积累,毒素积累的过程需要大量的碳水化合物提供碳源和氮源,从而导致接种苹果中可溶性固形物含量的降低。
图3 不同运输包装方式对接种苹果可溶性固形物含量的影响
Fig.3 Effects of different transportation packaging methods on the soluble solids content of inoculated apples
2.2.2 不同运输包装方式对接种苹果可滴定酸含量的影响
可滴定酸含量高低可作为评价苹果品质好坏的重要指标。研究表明,振动胁迫能够显著降低水果中的总酸含量,且随着振动时间的延长,果实中总酸含量会大幅下降,这说明运输过程中的振动作用会使果实中风味物质减少[19-20]。接种苹果中可滴定酸含量在不同运输包装方式下变化情况如图4所示,各处理组及其对照组接种苹果中可滴定酸含量呈现先升高后降低再趋于稳定的态势,第5天时接种苹果中可滴定酸含量达到峰值,且运输组与未运输组相比,差异不显著(P>0.05)。
图4 不同运输包装方式对接种苹果可滴定酸含量的影响
Fig.4 Effects of different transportation packaging methods on the titratable acid content of inoculated apples
2.2.3 不同运输包装方式对接种苹果呼吸强度的影响
果蔬的呼吸强度与其生理变化密不可分,不仅如此,呼吸强度还会影响果蔬的品质和抗病性等。果蔬会随着呼吸强度的升高加快生理代谢活动,且耐贮藏性也会随之降低[21]。苹果属于典型的呼吸跃变型果实,在贮藏的过程中会出现呼吸跃变峰,如图5所示,在贮藏期间,接种苹果呼吸强度先升高后降低,并在第10天和第15天时,处理组和对照组相继出现呼吸高峰,此时相同包装处理组中运输处理组接种苹果呼吸强度显著低于未运输处理组接种苹果呼吸强度(P<0.05)。这种现象说明运输在一定程度提前呼吸高峰的出现。呼吸高峰出现后,随着贮藏时间的延长,未运输处理组接种苹果呼吸强度高于运输处理组接种苹果呼吸强度。在3种运输包装方式中,掩口包装的接种苹果呼吸强度较弱于另外2个处理。
图5 不同运输包装方式对接种苹果呼吸强度的影响
Fig.5 Effects of different transportation packaging methods on the respiration intensity of inoculated apples
2.2.4 不同运输包装方式对接种苹果乙烯释放量的影响
接种苹果在运输与未运输过程中乙烯释放量如图6所示。处理组与对照组乙烯释放量整体上呈现先升高后降低的趋势,并在第15天和第10天时,对照组和处理组的乙烯释放量依次达到峰值,且对照组乙烯释放量峰值显著低于所对应的处理组乙烯释放量峰值(P<0.05),这说明运输处理不仅加快乙烯高峰的到来,而且增加乙烯的释放量。在处理组的3个处理方式中,掩口包装显著高于另外2种包装方式(P<0.05)。
图6 不同运输包装方式对接种苹果乙烯释放量的影响
Fig.6 Effects of different transportation packaging methods on the ethylene release of inoculated apples
3 结论与讨论
粉红单端孢霉侵染水果后,会产生诸如T-2毒素、HT-2毒素等单端孢烯族毒素,这些毒素与伏马毒素等均属于镰刀菌毒素,镰刀菌毒素在植物中通过结合或代谢相继转化为其他毒素[22-23]。此实验所检测到的TeA毒素就是粉红单端孢霉形成的镰刀菌毒素转化而来的。但是该毒素产生的途径目前还不清楚,需要进一步研究。
接种苹果在运输过程中会因振动产生机械损伤,这些机械损伤会增加粉红单端孢霉的侵染速度和TeA毒素的积累,因此运输处理组接种苹果的腐烂直径和TeA毒素含量高于未运输处理组;有研究表明,氧气含量与粉红单端孢霉生长情况呈现正相关[24],实验测得粉红单端孢霉菌落直径与TeA毒素含量变化趋势相同,所以,TeA毒素含量可能与包装内氧气含量变化呈现正相关趋势,3种运输包装方式中裸露包装运输方式的接种苹果TeA毒素含量最高也验证了此观点。运输处理会加快接种苹果的生理代谢速度,增加呼吸强度和乙烯释放含量,这与刘春娣[25]研究结果一致,通过振动富士苹果后测量富士苹果的呼吸强度和乙烯释放量发现,相同振动时间和温度下,经过振动的富士苹果呼吸强度和乙烯释放量远远高于未经过振动的富士苹果。经过运输后的接种苹果增加了呼吸强度,从而增加了可溶性固形物的消耗,这与陈豫等[26]研究振动对宜宾茵红李可溶性固形物含量的变化趋势一致,而可滴定酸含量在运输前后差异不显著,这说明接种苹果的可滴定酸含量受振动的影响较小,此结果与田津津等[27]探究振动对草莓中可滴定酸含量变化趋势结果相似。
本文对接种粉红单端孢霉的苹果采取不同的运输和包装方式,探究接种苹果在不同运输和包装情况下,贮藏期间各项指标的变化情况,结果表明,运输处理后的接种苹果腐烂直径和毒素含量显著高于未经过运输的接种苹果(P<0.05),且在运输处理组3种包装方式中,掩口包装方式的接种苹果TeA毒素含量低于另外2个处理;接种苹果经过运输后,可溶性固形物含量显著低于未运输处理组(P<0.05);但可滴定酸含量在运输前后差异不显著(P>0.05);运输处理组接种苹果呼吸强度和乙烯释放含量高于未运输处理组,且经过运输后会提前呼吸高峰和乙烯高峰的到来,这会加快苹果的成熟衰老的速度,使苹果不易贮藏。
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