1 牛奶β-酪蛋白简介
牛奶是人类饮食的重要组成部分,牛奶为人体提供能量和营养,并有助于儿童的成长,对人的心理发育也很重要。牛奶主要由蛋白质、脂肪、碳水化合物、无机盐和水组成[1]。酪蛋白约占牛奶蛋白的80%,含有人体必需的8种氨基酸。酪蛋白又可以进一步分为α、β、γ等不同类型,其中β-酪蛋白大约占酪蛋白的30%。牛β-酪蛋白基因分别以A1、A2、A3、B、C等 13种遗传变异体形式存在,其中A1型和A2型最为常见[2],主要差别是在一级结构的第67位氨基酸上,前者是组氨酸,后者是脯氨酸。不同种类牛乳中A1和A2β-酪蛋白的相对浓度不同。一般来说,A1β-酪蛋白浓度高于A2β-酪蛋白的牛奶被称为A1牛奶,而A2牛奶通常指仅含有A2β-酪蛋白的牛奶。
2 β-酪蛋白水解产物与生理健康
2.1 β-酪蛋白水解产物β-酪啡肽
蛋白酶分解出的很多具有生物功能和生理作用的肽被称为生物活性肽。具有阿片样活性的生物活性肽,被称为阿片肽。阿片肽根据其来源可分为内源性肽和外源性肽:内源性阿片肽是由机体自身产生,外源性阿片肽是由机体酶消化食物蛋白质后摄取食物产生,它们的结构与内源性阿片肽相似,因此膳食蛋白质被认为是阿片肽的重要来源之一,如母乳中的酪蛋白、牛奶中的β-酪蛋白和α-酪蛋白被认为是外源性阿片肽的良好来源。μ阿片受体可以识别来自食物蛋白质酶解的肽[3]。一些阿片肽在表现出阿片活性的同时还表现出生理活性。在吗啡样激动剂(如酪蛋白类吗啡肽,又称酪啡肽,大多由β酪蛋白获得,也称为β酪啡肽)激活阿片受体后可控制不同的细胞内效应。这些受体分布于中枢神经系统、胃肠道和一些免疫细胞,它们可以控制阿片肽的运动、分泌以及对其消化、吸收和免疫调节功能,所以可以影响许多生理过程。在蛋白酶的水解下,A1β-酪蛋白(B或C亚型β-酪蛋白)被水解生成多肽β-酪啡肽-7(β-casomorphin-7,BCM-7)和相关的短β-酪啡肽(BCM-5、BCM-4和BCM-3),其中活性最高的是BCM-7和BCM-5,而A2β-酪蛋白水解不会产生此类多肽物质。
1979年,牛奶被证明具有类阿片活性[4]。β-酪啡肽(β-casomorphin,BCM)像大多数外源性阿片肽一样,在胃肠道产生,在血液中吸收,能穿过血脑屏障与阿片受体相互作用。因此,BCM可能影响多个器官或系统的活动,尤其消化系统和免疫系统。它被认为是一把双刃剑既可以作为“战士”参与对有害制剂的防御,增加先天免疫,也被认为是“牛奶里的魔鬼”,与许多疾病有关。2014年,世界卫生组织的数据表明BCM与中枢神经的μ阿片受体结合从而会导致身体出现镇痛、血压轻微地降低、恶心、肠胃蠕动减少等不良现象[5]。这些肽的存在可增加慢性疾病的风险,因此需要进一步的研究[6]。
BCM-7作为牛乳中主要的阿片肽,被认为是与A1β-酪蛋白牛奶相关潜在不良后果有关。许多综述和流行病学研究报告了A1牛奶分解出的BCM-7对人类健康的负面影响,如Ⅰ型糖尿病和呼吸功能障碍,影响中枢神经系统活动。BCM-5由BCM-7经外肽酶形成,BCM-5对生理功能有许多积极的影响。BCM-5参与妊娠内分泌,使妊娠和哺乳期哺乳动物的心血管系统均呈下降趋势。BCM-5具有抗心律失常和保护心脏作用。
BCM的给药方式影响其作用效果。类似全身给药BCM-7对Y迷宫中小鼠的主动交替行为(与空间有关的短期记忆)和被动回避反应(与空间无关的长期记忆)的影响,全身给药BCM-5借助于μ阿片受体调控改善胆碱紊乱引起的学习和记忆障碍。向小鼠脑室内注射牛BCM-5,高剂量BCM-5诱导失忆症,低剂量BCM-5改善东莨菪碱诱导的失忆症[5]。另一项研究发现小鼠腹腔注射0.1～20 mg/kg 的BCM-5不能显著影响小鼠的主动交替行为和被动回避反应,但是低剂量腹腔注射1 mg/kg BCM-5可以显著改善东莨菪碱造成的主动交替行为和被动回避反应损伤。研究人员进一步用μ阿片受体拮抗剂预处理小鼠,证实BCM-5是通过μ阿片受体发挥其作用[7]。
2.2 β-酪啡肽与疾病
2.2.1 黏液分泌和先天免疫
杯状细胞分布于肠道和呼吸道的上皮内层,其唯一功能是分泌黏液、形成黏液和发展先天免疫。2006年,CVETANOVIC等[6]发现BCM-7也可能通过增加黏蛋白基因的表达直接作用于肠杯状细胞,导致黏蛋白分泌增加。如果BCM与胃肠壁的肠神经系统上的μ阿片受体结合,会促进空肠内的黏蛋白分泌和先天免疫。对MUC2基因(结肠黏液的主要黏液蛋白——黏糖蛋白的编码基因)缺陷小鼠的研究证明,牢固结合的黏液层对动物健康极其重要。小鼠的细菌会与上皮层直接接触,将导致炎症和癌症的发生。因此,含有BCM-7的牛乳制品可以改善肠道保护,支持先天免疫。BCM-7吸收后可调节肠道黏液排出,但是如果黏蛋白产生过多,可能会导致某些个体的保护屏障功能被破坏,并干扰微生物群体。因此,BCM一方面参与对有害制剂的防御增加先天免疫,另一方面会导致黏蛋白生产过多扰乱微生物群体导致个体保护屏障功能遭到破坏。
2.2.2 牛奶蛋白过敏
食物过敏是指人体接触某特定食物后,引发的不良免疫反应。牛奶是联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)认定的八大类主要过敏食物之一。据调查显示,对牛奶过敏的学龄前儿童占 0.6%～2.5%,5～16岁人群占0.3%,成年人<0.5%[8]。牛乳蛋白种类较多,酪蛋白和乳清蛋白中许多成分都具有潜在致敏性[9]。目前普遍认为酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白被认为是牛乳中最主要的过敏原,其中约82%的牛乳过敏病人都对β-乳球蛋白过敏;牛血清蛋白、免疫球蛋白及乳铁球蛋白是次要过敏原。此外,有研究进一步表明,牛乳酪蛋白中αs1酪蛋白的致敏性明显高于其他几种酪蛋白,所以它被认为是牛乳酪蛋白中最为关键的过敏原[10-11]。
牛奶蛋白过敏可以是免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)介导的或非IgE介导的。IgE介导I型超敏反应是由肥大细胞、嗜酸性粒细胞释放组胺、前列腺素等生物活性物质引发的速发型超敏反应,表现为毛细血管扩张、血管通透性增强、平滑肌收缩以及腺体分泌,以口腔综合征、皮肤及呼吸道症状多见。而非IgE介导的牛奶蛋白过敏是Ⅳ型超敏反应即迟发型超敏反应,其表现为消化系统病变,过敏原通过胃肠道刺激T细胞活化,致敏的T细胞分泌肿瘤坏死因子α等致炎因子,这些炎性细胞因子增加胃肠道黏膜通透性,使大量过敏原和液体进入胃肠道黏膜下层和管腔,激活特异性淋巴细胞,加剧破坏胃肠道黏膜,引起腹泻及呕吐等消化道病变[12]。
如上所述,牛乳蛋白致敏性主要来自其蛋白质高级结构中一些构象的特定抗原表位与人体免疫球蛋白(IgE或非IgE)的结合,而β-酪蛋白参与过敏反应的部分机制是其特异水解产物BCM的负面作用。早在1990年,就有研究发现摄入A1酪蛋白减缓胃肠道转运,其水解物BCM-7有促炎作用,并诱导T细胞介导的免疫反应导致牛奶蛋白过敏,引起腹胀感、腹部绞痛和腹泻不良反应。BCM在过敏反应中的作用来自于吗啡和其他阿片生物碱诱导肥大细胞在体内外选择性释放组胺从而导致过敏。1999年,又有研究发现BCM-7能从致敏豚鼠的腹膜细胞中释放组胺,并能诱导形成风疹和支气管阻塞[13]。BCM-7在健康儿童中也能引起皮肤风疹块反应,类似于组胺和可待因的作用效果。应用阿片受体拮抗剂——纳洛酮(烯丙羟吗啡酮),可以抑制体外组胺释放以及皮肤反应[14]。这些实验结果表明,BCM-7可以被认为是一种无细胞毒性的,能够引起牛奶蛋白过敏的多肽。
2.2.3 乳糖不耐症
大多数食物反应可能不是过敏性的,而是不耐受。牛奶不耐受通常是由于乳糖酶缺乏。在人体中由于乳糖酶活性的降低,乳制品中的双糖乳糖无法被消化。由于渗透作用,肠道内未消化的乳糖促使过多的水分排泄到肠腔内,膨胀的肠管刺激肠蠕动,促进肠管内容物的运动性增加[15]。有研究显示,部分β-酪蛋白基因变体,如A1、B 和C,可能导致人体患有牛乳不耐症和一些其他疾病,这是由于BCM-7的存在[5,16],而含A2β-酪蛋白的牛奶则可以减轻牛乳不耐症患者的急性肠胃道症状[17]。2016年,SUN等[18]设计了随机双盲交叉实验,选取了45名牛奶不耐受的中国汉族成年人随机分为2组,一组牛奶含有A2β-酪蛋白,另一组牛奶含有A1/A2混合牛奶(常规牛奶),但根据布里斯托尔粪便量表,A2牛奶与消化不适、大便频率和大便柔软等自我报告标记物(以血清炎症生物标志物为特征)的增加无关。用OMOM全息胶囊胃肠内窥镜测得的全胃肠运输时间,A1/A2牛奶明显比A2牛奶运行时间长。饮用含有A1、A2β-酪蛋白的牛奶会加重胃肠道症状,增加胃肠道转运时间,增加血清炎症标志物,降低粪便总短链脂肪酸含量,减缓认知处理速度,降低处理准确性。食用仅含A2β-酪蛋白的牛奶不会对这些方面产生不利影响,这表明在含有2种β-酪蛋白牛奶的变化归因于A1β-酪蛋白的存在。2017年,HE等[19]对600名牛奶不耐受的受试者进行实验,来研究食用含有A1或A2β-酪蛋白的牛奶后的胃肠道变化。食用A2β-酪蛋白后1和3 h的所有症状评分均显著低于A1牛奶,持续至12 h,腹胀、腹痛、大便频率和大便一致性仍有显著差异。为了检查乳糖吸收不良对胃肠道症状的影响,将受试者分为乳糖吸收者和乳糖吸收不良者,食用含有A2β-酪蛋白的牛奶后,乳糖吸收者和乳糖吸收不良者的胃肠道症状是相似的[20]。因此,乳糖不耐受的受试者中,胃肠道症状可能与A1β-酪蛋白有关,而不是乳糖本身。
2.2.4 Ⅰ型糖尿病
Ⅰ型糖尿病是由于自身免疫系统紊乱、β细胞被严重破坏、胰岛素分泌绝对不足,从而导致血糖升高[21]。2020年,有研究表明,BCM可能参与破坏糖尿病前期受试者的B细胞,但有研究实验结果反驳了这种观点[22]。这项研究为期2个月,目的是观察在患有Ⅰ型糖尿病的成年雄性 Wistar 大鼠中喂食A1和A2酪蛋白水解物对健康的促进或健康恶化效应[22]。研究选取6周龄成年雄性大鼠,首先分为3组,一个对照组,以及分别以A1和A2酪蛋白水解物作为饲粮饲喂50 d的2个处理组。到第51天每组分为2个亚组,其中1个亚组用链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型。与健康大鼠相比,糖尿病大鼠空腹血糖、血液生化指标显著升高,体重、高密度脂蛋白,以及反应人体胰岛功能的重要指示标志胰岛素和链接肽(C肽)水平显著降低。然而,除了A1酪蛋白+ 链脲佐菌素诱导糖尿病组的胆固醇和低密度脂蛋白水平显著高于对照组+链脲佐菌素诱导糖尿病组外,对照组+链脲佐菌素诱导糖尿病、A1酪蛋白 + 链脲佐菌素诱导糖尿病、A2酪蛋白 + 链脲佐菌素诱导糖尿病的各项生化指标、糖尿病特异性指标和组织病理学检查结果均无显著差异。实验结果表明,无论对健康大鼠还是糖尿病大鼠,饲喂A1酪蛋白和A2酪蛋白对健康指标均无明显影响,2种酪蛋白水解物的饲喂效果相似,因此,关于A1酪蛋白水解物可能导致Ⅰ型糖尿病的这种说法尚存在较大争议。
2.2.5 心血管疾病
BCM-7的摄入与心血管疾病死亡率有关[23]。2003年,TAILFORD等[24]报道,与口服A1β-酪蛋白的兔子相比,注射A2β-酪蛋白的兔子主动脉脂质条纹形成(动脉粥样硬化早期指标)明显减少,喂食A1牛奶的兔子胆固醇水平更高。与之相反,一些研究表明,β-酪蛋白A1/A2的摄入与心血管疾病风险增加之间的关系尚不确定。2013年,有研究发现BCM-7显著降低细胞培养体系中的血管紧张素II,并导致胰岛素释放增加和胰高血糖素的抑制,胰高血糖素是高血糖和糖尿病心脏病的主要调节因子[25]。在比较不同的研究时,必须考虑研究参与者的选择标准。虽然每一项研究设计都综合考虑各种因素,努力在随机化、标准化和控制混杂变量,但限于物种差异等原因很难达到完全一致,包括上述对兔子的研究。
2.3 神经障碍
有实验证据表明BCM-7的抗氧化和甲基化作用导致神经障碍[26]。A1β-酪蛋白释放的BCM-7参与了氧化应激的促进。体外培养系统中,BCM-7能够降低培养人类神经元和肠道上皮细胞对半胱氨酸的摄取。半胱氨酸限制细胞内初级抗氧化剂谷胱甘肽的合成,而BCM-7处理降低了细胞内的谷胱甘肽,及其还原性与氧化性的比例,表明BCM-7促进氧化应激半胱氨酸的充分吸收不仅为胃肠道提供了抗氧化资源,而且也是人体内维持全身谷胱甘肽浓度水平的首个环节。血液中低浓度的半胱氨酸和谷胱甘肽是自闭症的特征,所以,BCM-7限制半胱氨酸吸收对自闭症儿童更为关键,因为与一般人群相比,自闭症儿童的半胱氨酸和谷胱甘肽浓度较低,有发生胃肠道炎症反应的风险[27]。
BCM-7还可以对甲基化反应产生显著影响,这对神经发育尤其重要[28]。BCM-7有助于神经干细胞分化,人BCM-7促进神经发生,而牛BCM-7有利于星形胶质细胞的形成。此外,较高的BCM浓度与行为和精神疾病之间存在显著关联。一些体外研究证明了牛BCM-7通过抑制半胱氨酸摄取和调控DNA甲基化过程调节表观遗传效应的能力。2009年,俄罗斯科学家已经证明,BCM-7会进入喂食配方奶粉的婴儿的血液,并且婴儿对BCM-7的代谢很快[21]。喂食期间,血液中BCM-7水平保持较高的婴儿,其精神运动发育延迟的风险较高。使用高灵敏度ELISA方法来检测自闭症儿童尿液中BCM-7的浓度,其尿液样品中BCM-7的浓度明显高于健康儿童,因此长期食用会产生较高水平牛BCM的牛奶制品可导致儿童早期神经认知发育受损。
断奶年龄前后食用含有A1β-酪蛋白的牛奶,通过肠-脑轴介导机制,对大脑发育和情绪行为有重要影响。在出生后早期摄入含有A1β-酪蛋白,会对婴儿情绪行为产生负面影响,并伴随着大脑区域特异性神经化学和代谢变化以及肠源性代谢谱的改变。因此,断奶后食用含有A1β-酪蛋白的牛奶可能通过一种肠-脑轴机制影响情绪[7]。
3 A2β-酪蛋白的应用
3.1 A2基因型奶牛
最初,所有的牛奶都是A2型的。在5 000～10 000年前开始发生基因突变,导致一部分欧洲品种的奶牛产生了A1β-酪蛋白的变体[29]。与西门塔尔牛和布鲁拉牛等黄色和棕色品种相比,黑色和白色品种的A1β-酪蛋白比例较高。最新的研究表明,人工选择A2酪蛋白基因奶牛对提高乳蛋白产量有利,A2等位基因有较高的牛奶和蛋白质产量和较低的脂肪率,并且A2A2奶牛的日产奶量比A1A1和A1A2奶牛加起来多2.1%[30]。
目前中国最常见的荷斯坦奶牛中,有接近30%的牛只产生A2牛奶,其余70%的荷斯坦奶牛有的只产生A1牛奶,有的产同时含有A1和A2的牛奶。市面上的普通牛奶是A1和A2酪蛋白的混合奶,其A2与A1的比例约为3∶7。此外,牦牛奶、羊奶都是A2酪蛋白[31]。2000年,新西兰成立了首家A2牛奶公司,通过DNA检测识别出那些不含有A1酪蛋白的奶牛,把它们产的牛奶命名为“A2牛奶”。目前,国内已有科研机构、育种公司在公牛选育方面开展相关工作。北京奶牛中心通过血统追溯,对精选的155个公牛进行精细基因分型,定位了53个公牛家系A2纯合血统。山东等地区的育种公司开展了A2基因型荷斯坦种公牛的定向培育,建立了种公牛β-酪蛋白基因型鉴定方法,筛选获得A2型β-酪蛋白奶牛种群,结合奶牛生产性能测定来计划选配,定向培育兼具高产和A2型β-酪蛋白遗传基础的种公牛。由于A2等位基因具有更高的生产潜力,并且A2等位基因没有任何不利影响,因此它是在杂交奶牛中进行更广泛繁殖以提高奶农盈利能力的可靠候选基因。
在A2奶牛的繁育方面也可以选择基因编辑[32]。基于核酸酶的作用,可以利用锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶和CRISPR/Cas9系统等基因编辑工具,实现内源基因的定向修饰和外源基因的定向整合。
3.2 A2β-酪蛋白乳制品
人乳和牛乳无论是在蛋白质的种类和组成上还有乳清蛋白质上都有很大差异。在磷结合量上,酪蛋白与白蛋白和球蛋白的比例上,对于无机盐的凝聚反应都不同。人乳除了不含有β-乳球蛋白也不含有(或含量极低)α酪蛋白,但具有类似牛乳的κ-酪蛋白、β-酪蛋白的性质[33]。酪蛋白的粒子直径也有所差异,人乳要比牛乳的粒子直径小得多[34]。
3.2.1 婴儿奶粉
除了母乳,婴儿配方奶粉是婴儿获得蛋白质的唯一途径,作为特殊膳食用途的食品,可完全或部分替代母乳[35]。婴儿配方奶粉的研发者以牛奶或者豆奶为基础,模拟母乳的营养成分,使配方奶粉满足正常身体生长,人们都更加青睐于在婴儿奶粉中使用益生元和特定乳蛋白组分等成分的创新产品[10,25]。新生儿的肠黏膜对相对较大的肽具有更大的渗透性,这是因为它们不成熟的紧密连接,肽穿过这些连接,从而逃避水解[36]。俄罗斯科学家已经证明,BCM-7会进入婴儿的血液[14],并且能够被婴儿快速代谢,而其成人则代谢缓慢。含有酪蛋白但不含A1酪蛋白的婴儿配方奶粉现在中国和澳大利亚广泛销售,并被商业推广定位于对婴儿消化系统更温和的母乳替代食品。
3.2.2 奶酪和酸奶
牛β-酪蛋白的遗传特征对干酪和酸奶制造的凝乳酶或酸诱导凝胶过程中有重要影响,A2β-酪蛋白是不凝结和凝结不良牛奶的促成因素。因为总酪蛋白特别是κ-酪蛋白的含量较低,以及Ca、Mg和P矿物质的浓度较低,用含有A2酪蛋白的乳制品制成的酸奶和奶酪会有多孔的凝胶结构,含有更短的蛋白质链,并且用含有A2β-酪蛋白制成的乳制品比含有A1β-酪蛋白制成的乳制品凝胶强度低。而且还有研究表明,A2β-酪蛋白的乳制品会导致凝固和凝乳的恶化。所以不建议用A2酪蛋白牛乳用于生产奶酪和酸奶。
随着紫外光谱、质谱、高效液相色谱以及酶联免疫吸附等分子生物学技术被应用于乳制品中的BCM分析,已经在原牛奶和一些奶酪中检测到BCM-7,但是在市售酸奶中未检测出。既然酪蛋白经过多种食品加工程序处理可以在奶酪中产生BCM-7,表明这种多肽也可以在酸奶加工过程中出现,但某些特定的酸奶加工过程可能又将其降解了。BCM-7是否在酸奶中形成,以及在不同处理过程中形成和降解的定量评估还需要进一步研究,这可能与热处理及发酵过程有很大的关联,生产者能否在乳制品加工过程中消除酪啡肽是一个值得探讨的问题[5]。
3.2.3 A2产品市场现状
在不断扩大的健康食品市场中,A2牛奶是一个相对较新的产品。最初由新西兰A2公司开展商业化推广后才逐渐被消费者青睐。在英国、澳大利亚、新西兰以及美国,该公司都推出了自己品牌的A2牛奶,并拥有着A2酪蛋白牛奶以及婴儿配方奶粉等相关产品的知识产权商业化[37]。在不断扩大的健康食品市场中,A2牛奶是一个相对较新的产品。从1955年至今,许多研究比较了仅含A2β-酪蛋白的牛奶与仅含A1β-酪蛋白的牛奶对人类的影响,其中不少研究是A2公司这样的企业主导或资助完成的。
目前,国内市场在液态奶品类方面,A2公司、澳牧、纽仕兰、三元、蒙牛、新希望、完达山等国内外品牌纷纷推出A2型β-酪蛋白鲜牛奶。在奶粉品类方面,A2公司、美赞臣、惠氏、雀巢、完达山等国内外知名品牌相继上市了A2型儿童奶粉、孕产妇奶粉等产品。此外,还有企业推出了A2型β-酪蛋白有机鲜牛奶、A2型β-酪蛋白有机儿童奶粉和有机孕产妇奶粉。在婴幼儿配方奶粉品类上,国外多家知名品牌均已推出A2型β-酪蛋白婴幼儿配方奶粉。在我国国内企业也在加快布局,抢占国内A2型婴幼儿配方奶粉细分市场份额[37]。当下,乳制品行业竞争日益激烈,A2型乳制品无疑是细分领域的刚需拳头产品,其对企业核心竞争力和市场满足度的提升,具有重要的支撑作用。
4 小结与展望
随着消费者对新型高端以及特种奶制品的需求日益增多,关于牛奶中A1和A2酪蛋白与人体健康之间的关联程度的证据也越来越多。本文讨论的部分研究已经表明A1酪蛋白存在促炎作用以及多个方面影响身体健康,包括胃肠道、内分泌、神经。但是,所有的数据都来源于人类流行病学数据,主要是在体外进行的动物实验,并且A1牛奶与心血管系统以及Ⅰ型糖尿病的关联存在争议。长期食用A2型牛奶对一些特定人群是有益的,但是它并不能完全解决牛奶蛋白质致敏的问题,对于食用牛奶制品无不适反应的人群也不是必需品,而且从科学严谨性来说,还需要更多独立研究团队和科研学者来揭示其确切的作用机制。目前,国内外乳企已经或正在布局A2牛奶细分市场,A2型乳制品已逐渐成为面向市场的一种高端细分产品,科研机构及乳制品企业加大了A2型乳制品的科研和开发力度,未来将为消费者提供更具功能性、更优质的乳制品。
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