原料乳质量是乳制品加工业可持续发展的关键影响因素。目前，各牧场和乳制品加工企业广泛使用低温来贮藏原料乳。低温是控制原料乳贮藏过程中细菌生长繁殖的有效措施。然而，冷藏虽能抑制大多数嗜温微生物，但随着贮藏时间的延长，嗜冷菌仍可持续生长，其产生的蛋白酶和脂肪酶分解蛋白质和脂肪，会使原料乳质量发生变化，进而导致加工特性发生改变[1-2]。
不同学者关于原料乳冷藏时间对原料乳和干酪理化特性的影响已有研究。ALI等[3]研究了原料乳贮存对酪蛋白在胶束和可溶性相之间分布的影响，得出原料乳贮藏时间越长，酪蛋白胶束越不稳定；BAGLINIÉRE等[4]从低温贮存的原料乳中分离出高蛋白水解菌株，可以使其酪蛋白不稳定从而出现蛋白质凝胶、乳清析出的现象。MANKAI等[5]对4 ℃条件下贮藏12～96 h原料乳及所制作的干酪品质变化进行研究，发现冷藏96 h制成的干酪脂肪含量最低，蛋白水解水平最高。YUAN等[6]研究发现低温贮藏下的原料乳，相应的乳制品会出现苦味等非正常风味；综上，原料乳冷藏时间对原料乳和干酪理化特性产生影响。牦牛乳硬质干酪以牦牛乳为原料，经发酵、凝乳等环节制作而成，出品率高、营养价值高以及风味浓郁[7]，然而，鲜有不同冷藏时间牦牛乳制作的硬质干酪的理化性质研究。
牦牛乳营养全面，蛋白质含量、脂肪含量平均高出荷斯坦牛乳1倍以上，以天然的浓缩奶相称[8]，然而，牦牛大多分布在青藏高原地区，奶源分布零散，产奶量低、收集时间较长，因此，牦牛乳在加工前一般需要较长时间的低温贮藏。因此，本实验以冷藏不同时间的牦牛乳为原料，制作成牦牛乳硬质干酪，通过测定干酪成熟期间的理化性质、蛋白水解程度来揭示不同冷藏时间的牦牛乳制作成的硬质干酪之间的差异性，进而判断对其牦牛乳硬质干酪成熟过程中理化性质的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜牦牛乳采自甘南藏族自治州卓尼县木耳乡大峪沟，置于冰盒中迅速转移至实验室；凝乳酶、发酵剂(嗜温发酵剂和嗜热发酵剂1∶1混合而成)，北京多爱特生物科技有限公司。
氯化钙、氯化钠、醋酸、三氯乙酸、水合茚三酮、盐酸、氯化镉、L-亮氨酸、氢氧化钠、硝酸银、浓硫酸等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
干酪槽，自制；TGL-20 M高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；PHS-3 C精密pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；723型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；HWS 26-电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；真空包装机，温州市大江真空包装机械有限公司；K 9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 牦牛乳前处理
将新鲜牦牛乳分成3份置于无菌瓶中，于4 ℃冰箱中分别冷藏24、48、72 h，然后用于牦牛乳硬质干酪制作。
1.3.2 干酪制作与取样
参考刘兴龙等[9]方法，制作牦牛乳硬质干酪。将检验合格的原料乳进行巴氏杀菌(63 ℃， 30 min)后冷却至35 ℃，添加已活化的发酵剂(0.006 25 g/L)，搅拌均匀，35 ℃发酵约60 min后测其pH值，待pH值降至6.2时一边缓慢加入CaCL2(0.3 g/L)一边慢速搅拌，防止起泡。10 min后加入凝乳酶(1 g/1.5L)，待2 h后测定pH值使其降至5.6。当乳凝固后将其切割成约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm的小方块，排乳清，45 ℃下加入2%食盐并不断搅拌，堆酿约2 h后加压成型，真空包装后置于4 ℃条件下分别成熟0、1、2、3、4、5、6个月，将成熟后的干酪贮藏在-80 ℃，用于后续试验指标测定。
1.3.3 干酪理化指标的测定
1.3.3.1 水分含量测定
采用GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中第一法直接干燥法进行各成熟期干酪水分含量的测定。
1.3.3.2 pH值测定
参考宋雪梅等[10]方法，稍作修改。称取5 g干酪于10 mL去离子水中研磨匀浆后，用精密pH计进行测定。
1.3.3.3 NaCl含量测定
参照GB 5009.44—2016《食品安全国家标准食品中氯化物的测定》第三法银量法(摩尔法或直接滴定法)，根据硝酸银标准滴定溶液的消耗量来计算各成熟期干酪中氯的含量。
1.3.3.4 脂肪含量测定
根据GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第三法碱水解法进行各成熟期干酪脂肪含量的测定。
1.3.4 干酪蛋白水解程度的测定
1.3.4.1 pH 4.6可溶性氮(pH 4.6 soluble nitrogen, pH 4.6-SN)含量测定
参考穆硕等[11]方法。准确称取0.75 g干酪于研钵中，加入25 mL pH 4.6醋酸盐缓冲液中充分研磨后装于50 mL离心管中，再用25 mL醋酸盐缓冲液冲洗。将悬浮液在4 ℃、4 000 r/min条件下离心20 min。取上清液20 mL于消化管中进行消化处理，待消化管中的液体为绿色透明状后进行凯氏定氮测定，并以SN/TN来表示。
1.3.4.2 12%三氯乙酸可溶性氮(12% trichloroacetic acid-soluble nitrogen, 12% TCA-SN)含量测定
参考AGBOOLA等[12]方法，并加以改进后测定。准确称取1.50 g干酪于研钵中，加入25 mL 12% TCA溶液中进行研磨，磨碎后移入50 mL离心管中，再用25 mL溶液冲洗。所得的悬浮液以4 ℃ 4 000 r/min离心20 min。取离心后的上清液20 mL进行消化处理，待消化管中的液体呈绿色透明状后进行凯氏定氮，并以SN/TN来表示。
1.3.4.3 总游离氨基酸含量测定
参考FOLKERTSMA等[13]方法，以亮氨酸为标准物，采用镉-茚三酮法进行总游离氨基酸测定。
1.3.5 数据分析
各项试验指标的结果均3次重复。采用Excel 2010软件对其数据进行处理，数据结果均以平均值标准差来表示，采用SPSS 22.0软件进行方差和显著性分析(Duncan法)，利用Origin 2019软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 牦牛乳硬质干酪成熟期间理化指标的变化
2.1.1 牦牛乳硬质干酪成熟期间水分含量的变化
水分含量通过影响溶质浓度，进而影响到水分活度，从而对微生物繁殖代谢和生长产生影响。不同冷藏时间原料乳制作的牦牛乳硬质干酪在0～6个月成熟过程中水分含量变化见图1。
图1 牦牛乳硬质干酪成熟期间水分含量的变化
Fig.1 Changes of moisture content in yak hard cheese during ripening 注：样品间用大写字母表示差异显著，不同成熟时间用小写字母 表示差异显著(P<0.05)(下同)
由图1可知，在成熟过程中，3组硬质干酪的水分含量随着成熟时间的延长都呈缓慢下降的趋势。在整个成熟期内，冷藏24、48、72 h原料乳制成的硬质干酪中水分含量分别下降了1.7%、1.5%、2.4%，冷藏72 h制成的硬质干酪中水分含量下降程度最大。成熟初期，水分降低是因为乳清未彻底排出，真空包装后部分水分随乳清析出，残留在包装袋。成熟后期，由于蛋白质分解，酪蛋白网络减弱并逐渐解体，干酪中游离的水分在贮存过程中以渗出物的形式释放出来[14]。整个成熟过程中，3组牦牛乳硬质干酪中水分含量始终为冷藏72 h组>冷藏48 h组>冷藏24 h组，这与CHAPMAN等[15]研究结果一致。原料乳冷藏过程中可能发生酪蛋白和磷酸钙的解体，从而影响干酪的保水性和干酪结构，进而影响干酪中的水分含量[15]。
2.1.2 牦牛乳硬质干酪成熟期间pH值的变化
pH通过影响硬质干酪中微生物环境、酶的活性，进而对干酪成熟期间一系列复杂的生化反应产生影响。表1反映了牦牛乳硬质干酪成熟期间pH的变化。
表1 牦牛乳硬质干酪成熟期间pH值的变化
Table 1 Changes of pH value of yak hard cheese during ripening
成熟时间/月冷藏时间/h24487205.427±0.018Ac5.177±0.011Cc5.327±0.018Bb14.993±0.018Af4.787±0.004Cf4.920±0.019Be25.157±0.015Ae4.837±0.016Ce5.003±0.016Bd35.177±0.008Ae4.943±0.015Bd5.143±0.020Ac45.257±0.025Ad4.977±0.039Cd5.173±0.015Bc55.480±0.019Ab5.280±0.012Cb5.367±0.020Bb65.727±0.015Aa5.663±0.023Ba5.740±0.008Aa
注：样品间用大写字母表示差异显著，成熟时间用小写字母表示差异显著(P<0.05)
由表1可知，3组硬质干酪在成熟初期都呈现下降趋势，而在后期都呈现升高趋势，即有着先降低后增加的变化，与MANKAI等[5]结论一致。新鲜牦牛乳硬质干酪的pH值分别为5.427、5.177、5.327，成熟1个月时，pH分别降低到4.993、4.787、4.920。成熟初期，硬质干酪中乳糖被分解而产生乳酸，从而使干酪pH降低[16]。成熟1个月后，pH分别升高到5.727、5.663、5.740。成熟后期，乳糖被消耗完后，由于蛋白质降解作用，可溶性氮含量增加，使得pH又不断升高[17]。另外，也有研究表明，NaCl含量的增加也影响pH值变化[18]。整个成熟过程中，3组牦牛乳硬质干酪中pH始终为冷藏24 h组>冷藏72 h组>冷藏48 h组，TAVARIA等[19]研究表明，原料乳冷藏时间的延长总体上降低了pH值，因此有利于某些氨基酸残基的释放。
2.1.3 牦牛乳硬质干酪成熟期间NaCl含量的变化
干酪中盐的添加有利于促进乳清的进一步排放，改善风味，控制干酪含水量及最终硬度，NaCl含量直接影响干酪成熟[20]。3组牦牛乳硬质干酪成熟期间NaCl含量如图2所示。
图2 牦牛乳硬质干酪成熟期间NaCl含量的变化
Fig.2 Changes of NaCl content in yak hard cheese during ripening
由图2可知，干酪中NaCl含量随着成熟时间的延长呈增长趋势。在0～6个月成熟过程中，冷藏24、48、72 h牦牛乳制成的硬质干酪中NaCl含量分别上升了0.22%、0.25%、0.29%，干酪中NaCl含量越高，则越快排出乳清，排出乳清的同时会消失更多的盐分和水分，这与牦牛乳硬质干酪中水分含量变化趋势一致。KATSIARI等[21]发现NaCl含量上升程度与水分降低程度基本一致，干酪中NaCl添加量与水分含量呈显著负相关。整个成熟过程中，3组牦牛乳硬质干酪中NaCl含量始终为冷藏24 h组>冷藏48 h组>冷藏72 h组。有研究表明，同一成熟期内，原料乳冷藏时间越短，所制作的硬质干酪中NaCl含量越高[22]。
2.1.4 牦牛乳硬质干酪成熟期间脂肪含量的变化
牦牛乳硬质干酪成熟期间脂肪含量的变化结果见图3。
图3 牦牛乳硬质干酪成熟期间脂肪含量的变化
Fig.3 Changes in fat content in yak hard cheeses during ripening
由图3可知，3组硬质干酪的脂肪含量在0个月时都在27%～31%，成熟6个月时降低到23%～26%。3组硬质干酪的脂肪含量分别下降了5.34%、4.45%、3.33%，冷藏24 h原料乳制成的硬质干酪脂肪含量下降程度最大。脂肪含量降低主要是因为脂肪在牦牛乳自身和微生物代谢产生的脂肪酶作用下分解，导致其脂肪含量减少。脂肪是干酪中重要的组成之一，脂肪含量的降低，可能会对干酪质地、风味特征以及功能特性产生不利影响[23]。整个成熟期内，3组牦牛乳硬质干酪中脂肪含量始终为冷藏24 h组>冷藏48 h组>冷藏72 h组，且24 h硬质干酪脂肪含量显著高于48 h和72 h硬质干酪(P<0.05)。这可能是由于随着原料乳冷藏时间的延长，嗜冷菌数量越多，因而脂肪被降解所致，这与LAW等[24]研究结果相一致。
2.2 牦牛乳硬质干酪成熟期间蛋白水解程度的变化
2.2.1 牦牛乳硬质干酪成熟期间pH 4.6-SN的变化
pH 4.6-SN是蛋白质次级降解产物，其高低表明了蛋白质水解程度的高低，表示干酪蛋白质降解的广度，是干酪成熟程度的标志[25]。本实验测定pH 4.6-SN含量的目的是了解成熟过程中多肽的含量及其降解程度[26]。牦牛乳硬质干酪成熟期间pH 4.6-SN含量的变化见图4。
图4 牦牛乳硬质干酪成熟期间pH 4.6-SN/TN的变化
Fig.4 Changes of pH 4.6-SN/TN during yak hard cheese ripening
由图4可知，3组硬质干酪随着时间的延长pH 4.6-SN含量均呈现持续上升趋势。这与曹瑛瑛等[27]的研究结果一致。3组新鲜牦牛乳硬质干酪中pH4.6-SN含量分别为13.95%、14.07%、14.50%，成熟6个月时，3组干酪中pH 4.6-SN含量分别增加了8.02%、8.53%、10.07%，说明了成熟时间对牦牛乳硬质干酪中pH 4.6-SN含量影响显著(P<0.05)。在整个成熟期内，4 ℃冷藏72 h原料乳制成的干酪pH 4.6-SN含量最高，冷藏48 h原料乳制成的干酪次之，冷藏24 h原料乳制成的干酪最低。这可能是因为冷藏72 h原料乳中存在大量微生物，蛋白水解细菌水解酪蛋白，并可能利用这种蛋白质来源生长。WITING[28]研究表明，冷藏原料乳的凝固时间延长，这会使产生的凝固物不坚硬，并促进嗜冷菌(产耐热蛋白酶)的生长。
2.2.2 牦牛乳硬质干酪成熟期间12% TCA-SN的变化
TCA-SN是反映蛋白质二次降解后的提取物，主要包括小肽、游离氨基酸和一些小的含氮化合物，其主要是在硬质干酪加工过程中加入的凝乳酶和发酵剂肽酶共同催化产生的，体现了干酪蛋白质降解的深度[29]。牦牛乳硬质干酪成熟期间12% TCA-SN含量的变化见图5。
图5 牦牛乳硬质干酪成熟期间12% TCA-SN/TN的变化
Fig.5 Changes of 12%TCA-SN/TN during yak hard cheese ripening
由图5可知，随着成熟期的延长，3组硬质干酪中的12% TCA-SN含量都呈上升趋势，这与宋雪梅[30]的研究结果一致。在整个成熟过程中，3组牦牛乳硬质干酪中12% TCA-SN含量分别上升了11.84%、11.54%、13.65%。12% TCA-SN含量取决于蛋白酶、肽酶将酪蛋白水解成小肽和氨基酸。在成熟过程中，蛋白质不断水解，可溶性氮含量增加[17]。整个成熟期内，3组牦牛乳硬质干酪中12%TCA-SN含量始终为冷藏72 h组>冷藏48 h组>冷藏24 h组。原料乳冷藏时间越长，硬质干酪中12% TCA-SN含量越高，说明了不同冷藏时间的原料乳制成的硬质干酪中蛋白水解水平不同，冷藏72 h原料乳制成的硬质干酪的蛋白水解能力强。
2.2.3 牦牛乳硬质干酪成熟期间总游离氨基酸的变化
在硬质干酪成熟过程中，酪蛋白分子先分解成多肽，再分解成游离氨基酸。其游离氨基酸对硬质干酪风味形成起着重要的作用[31]。牦牛乳硬质干酪成熟期间游离氨基酸总量的变化见图6。
由图6可知，3组硬质干酪在整个成熟期间，游离氨基酸总量均呈增加趋势。3组新鲜牦牛乳硬质干酪中游离氨基酸总量分别为0.245、0.274、0.402 mg/g，24 h组和48 h组游离氨基酸总量不存在显著差异(P>0.05)，含量相当。随着成熟时间的延长，游离氨基酸总量几乎直线上升，成熟6个月时，3组干酪中游离氨基酸总量分别到达3.656、4.224、4.482 mg/g。这说明随着成熟时间的延长，蛋白质不断被降解。在整个成熟期内，冷藏72 h组游离氨基酸总量高于冷藏48 h组和冷藏24 h组。这说明原料乳冷藏时间延长，提高了牦牛乳硬质干酪中的总游离氨基酸含量。游离氨基酸的增多，一方面，有利于增加干酪风味，另一方面，如存在产胺微生物时，这表明存在生物胺增多的风险[32]。
图6 牦牛乳硬质干酪成熟期间游离氨基酸总量的变化
Fig.6 Changes of total free amino acids during yak hard cheese ripening
3 结论
本实验以不同冷藏时间的牦牛乳为原料制作成牦牛乳硬质干酪，比较了3组牦牛乳硬质干酪在成熟期间水分含量、pH值、盐含量和脂肪含量及其蛋白质水解程度，研究了原料乳冷藏时间对牦牛乳硬质干酪理化指标的影响。结果表明在成熟过程中，3组牦牛乳硬质干酪pH有着先降低后升高的变化趋势，冷藏72 h原料乳制成的干酪中水分含量最高，冷藏48 h组次之，冷藏24 h组最低。NaCl含量、脂肪含量变化趋势则与前面水分含量相反。冷藏时间越长的原料乳，制成的硬质干酪在成熟过程中pH 4.6-SN、12%TCA-SN、总游离氨基酸含量越高，说明蛋白质不断被水解，蛋白水解程度深。本研究可为原料乳和牦牛乳硬质干酪品质控制提供理论依据。
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