母乳中胆固醇及胆固醇酯分布规律研究

母乳中含有蛋白质、脂类、乳糖、矿物质和维生素等各种营养素，其中母乳脂以脂肪球的形式稳定存在于乳中，甘油三酯和胆固醇酯等中性脂被包裹在其核芯，胆固醇则嵌入在乳脂肪球膜的磷脂膜中以稳定乳脂肪球的外层双层膜[1]。胆固醇不仅对乳脂肪球膜起稳定作用，对所有细胞膜结构都发挥重要作用，尤其是对大脑生长至关重要的神经系统中的髓磷脂膜[2]。胆固醇还作为乳糜微粒和脂蛋白的重要结构部分，促进婴儿体内长链脂肪酸的吸收和运输[3]。因此，胆固醇对于婴儿器官的生长发育，尤其对大脑和神经系统的发育是不可或缺的。另一方面，胆固醇作为胆汁酸、脂蛋白、维生素D、激素和氧化甾醇等重要调节剂的前体物质[4]，也满足了婴儿的生长发育需要。此外有研究表明，婴儿从母乳中获得的胆固醇将会影响其成年后血液中的胆固醇浓度，减少成年后患高胆固醇血症的概率[5]。

母乳中含有以棕榈酸为主的饱和脂肪酸、以油酸为主的单不饱和脂肪酸和以亚油酸和亚麻酸为主的多不饱和脂肪酸[6-7]，部分母乳胆固醇则会与这些脂肪酸结合形成胆固醇酯。虽然母乳脂中胆固醇含量和胆固醇酯含量占比较少(分别仅占0.34%和0.02%)[8]，但是对于婴儿营养吸收及代谢十分重要。母乳是婴儿胆固醇的丰富来源，含量远高于婴儿配方奶粉[4]。目前，我国对不同泌乳期母乳胆固醇和胆固醇酯的定性定量分析研究还较少。

我国和世界卫生组织(World Health Organization, WHO)均推荐0～6个月婴儿采用纯母乳喂养，婴幼儿配方奶粉是不能纯母乳喂养时的无奈选择。母乳可以满足初生婴儿健康生长发育的全部需要，与婴儿配方奶粉喂养的婴儿相比，母乳喂养会带来更好的健康结果。但是在世界范围内，纯母乳喂养率不到40%[9]，可见大部分母亲还是会选择购买婴幼儿配方奶粉，而婴幼儿配方奶粉也总是在竭尽全力模仿母乳成分。

据此，本研究利用超高效液相色谱-高分辨质谱(ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS)技术对母乳中胆固醇和胆固醇酯进行系统性定性定量分析，分析不同泌乳阶段(初乳1～7 d、过渡乳8～15 d、成熟乳16 d以后)胆固醇及胆固醇酯组成和含量差异。胆固醇作为母乳中不可或缺的成分，了解和掌握母乳中胆固醇及其衍生的胆固醇酯的构成和分布规律，对于相关婴幼儿配方奶粉的生产和配方改良具有重要意义。除胆固醇外，本研究还对胆固醇酯进行分析，掌握胆固醇酯的分布规律，可以为相关脂类代谢和生产添加提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

母乳样品，重庆医科大学附属第一医院产科(伦理审查批号：2020-548)，共收集150位年龄在22～43岁的乳母乳汁，分别是50份初乳样品(1～7 d)、50份过渡乳样品(8～15 d)和50份成熟乳样品(16 d以后)，每份样品约20 mL，收集后立即分装(2 mL)贮于-80 ℃条件下备用。

胆固醇(CAS:57-88-5)、棕榈酸胆固醇酯(CAS:601-34-3)、硬脂酸胆固醇酯(CAS:35602-69-8)、乙酸铵、高效液相色谱纯丙酮和甲醇，Sigma-Aldrich(中国，上海)；甲醇(分析纯)，上海麦克林生化有限公司；氯仿(分析纯)，重庆万盛川东化工有限公司；氯化钠、无水硫酸钠，成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290 infinity Ⅱ超高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Bruker Impact Ⅱ四级杆-飞行时间质谱仪，德国Bruker公司；Vortex-2涡旋混匀仪，上海沪析实业有限公司；离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；BSA124S分析天平，德国Sartorious公司。

1.3 实验方法

1.3.1 母乳胆固醇提取

采用改良的Folch法[7]：取1 mL母乳于50 mL离心管中，向其中加入5 mL甲醇，混合溶液经过5 min超声处理后冷却至室温，再用涡旋混匀仪旋混5 min。之后向混合体系中加入10 mL氯仿，超声处理10 min后冷却至室温，旋混10 min。继续向混合体系中加入3 mL质量分数为0.9%的氯化钠溶液，超声处理5 min后冷却至室温，旋混5 min。

经过4 ℃条件下放置过夜的混合体系在8 000 r/min条件下离心5 min，静置，分层后将下层有机相留置离心管中待用，上层水相转移至另一50 mL离心管中进行复提。之后再向水相中加入5 mL氯仿，超声处理5 min后冷却至室温，旋混5 min，在8 000 r/min条件下离心5 min，弃上层水相。合并两次提取的下层有机相，利用无水硫酸钠过滤，再减压旋转除去有机溶剂后在-20 ℃条件下保存备用。用300 μL V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1的混合溶剂复溶，过滤膜(0.22 μm)后上机检测。

1.3.2 超高效液相色谱质谱条件

胆固醇及其酯类的检测采用UPLC-HRMS进行，UPLC型号为Agilent 1290，配有自动进样系统和二极管阵列检测器(diode array detector，DAD)。分析柱为C18柱(Poroshell 120, 1.9 μm)，2.1 mm×100 mm，并配有同等材质的保护柱。超高效液相分析方法参考实验室脂溶性化合物分析方法[10]。UPLC流速为0.2 mL/min，流动相A为V(甲醇)∶V(水)=8∶2，流动相B为V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1，流动相中均加入10 mmol/L乙酸铵。采用梯度洗脱程序：0～15 min，25%～100% B；15～20 min，100% B；20～25 min，25% B。HRMS采用大气压化学电离源(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)分析胆固醇及其酯类，正离子模式(APCI+)，质量范围 150～3 000 m/z，APCI加热温度450 ℃，雾化气流速为3 Bar，干燥气流速为5 L/min，干燥气温度为200 ℃，雾化气和干燥气均为高纯氮气。毛细管电压为4 000 V，末端平板电压为500 V，裂解能量10 eV，质谱数据在Bruker Compass Data Analysis 4.4软件上分析处理。

1.3.3 定性测定方法

采用UPLC-HRMS定性测定胆固醇及胆固醇酯，即在UPLC方法下，分离样品中各物质并获得相应的色谱峰，然后根据HRMS测定未知物质的分子质量，再对比标准品的相应信息对相关色谱峰物质定性。

1.3.4 标准溶液的配制

胆固醇标准溶液：取胆固醇标准品10 mg，用V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1混合溶剂溶解并定容于10 mL容量瓶中，配制成1 000 mg/L的标准溶液，将此溶液连续稀释配成质量浓度为10～1 000 mg/L的系列标准溶液。

混合胆固醇酯标准溶液[11]：采用已经定性确定的、可以购买到的商用高纯度棕榈酸胆固醇酯、硬脂酸胆固醇酯2种标准品，以质量比1∶1混合，该混和胆固醇酯作为各种胆固醇酯定量所用的标准品。分别称取棕榈酸胆固醇酯、硬脂酸胆固醇酯2种标准品各5 mg，用V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1混合溶剂溶解并共同定容于10 mL容量瓶中，配制成1 000 mg/L的混合标准溶液，将此溶液连续稀释配成质量浓度为10～1 000 mg/L的系列混合标准溶液。

1.3.5 标准曲线的绘制

在色谱条件下，将1.3.4中的一系列不同浓度的胆固醇标准溶液和混合胆固醇酯标准溶液UPLC进样分析。以胆固醇标准品峰面积为横坐标，对应质量浓度(mg/L)为纵坐标绘制标准曲线，得到胆固醇标准品的回归方程和相关系数；以2种胆固醇酯标准品的峰面积之和为横坐标，对应质量浓度(mg/L)为纵坐标绘制标准曲线，得到混和胆固醇酯标准品的回归方程和相关系数。

1.3.6 定量测定方法

每个母乳样品分析2次，胆固醇根据所获标准曲线对其进行定量测定，而对胆固醇酯的定量测定则为相对定量测定，各种胆固醇酯统一采用混合胆固醇酯标准曲线进行定量。

1.4 数据统计分析

本研究利用Bruker Compass Data Analysis 4.4软件对胆固醇和胆固醇酯进行定性，胆固醇化学结构式运用ChemDraw 19.0软件绘图。实验数据采用Origin 2018软件绘图，采用SPSS 26.0统计分析软件进行单因素方差分析[Duncan法和least-significant difference(LSD)法检验]、主成分分析和相关性分析，P<0.05表示具有显著性差异，结合OmicShare平台进行相关性分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 胆固醇及胆固醇酯的定性分析

胆固醇结构如图1所示，其分子含有一个羟基，可与脂肪酸酯化形成各种胆固醇酯。本实验采用UPLC-HRMS在APCI+模式下对采集的150份母乳样品中的胆固醇和胆固醇酯进行检测分析。本研究对母乳中胆固醇和胆固醇酯的检测结果见表1，根据各种物质在色谱柱中的保留时间不同，除检测到丰富的胆固醇外，还检测到13种胆固醇酯。其中只检测到丁酸胆固醇酯(C4∶0)这一种短链脂肪酸胆固醇酯，其余均为与长链脂肪酸结合的胆固醇酯。检测到初乳中胆固醇酯种类最多，达到13种，过渡乳中含有11种，成熟乳中只有7种，3个泌乳期均检测到α-亚麻酸胆固醇酯(C18∶3)、丁酸胆固醇酯(C4∶0)、二十二酸胆固醇酯(C22∶0)、二十四碳烯酸胆固醇酯(C24∶1)、二十四酸胆固醇酯(C24∶0)、十七酸胆固醇酯(C17∶0)和硬脂酸胆固醇酯(C18∶0)。

目前国内外对母乳中胆固醇酯的组成和分布的研究较少，人体血清中胆固醇酯研究较多[11]。并且，EMKEN等[12]发现母乳中棕榈酸胆固醇酯(C18∶1)的含量明显高于血浆。值得注意的是，我们还在母乳中额外检测到丁酸胆固醇酯(C4∶0)和二十二酸胆固醇酯(C22∶0)。

2.2 胆固醇及胆固醇酯的定量分析

2.2.1 不同泌乳期的胆固醇及胆固醇酯

根据信噪比(S/N)为3确定检出限(limits of detection, LOD)以及信噪比(S/N)为10确定定量限(limits of quantification, LOQ)。胆固醇标准曲线y=0.000 05x-8.935 2[y为胆固醇质量浓度(mg/L)，x为峰面积]，在10～650 mg/L线性关系良好，相关系数R2=0.999 7，LOD为0.01 mg/L，LOQ为0.03 mg/L；混合胆固醇酯标准曲线y=0.000 036x-0.056 73[y为胆固醇酯浓度(mg/L)，x为峰面积]，在0.07～8.0 mg/L线性关系良好，相关系数R2=0.999 2，LOD为0.017 mg/L，LOQ为0.055 mg/L。不同泌乳期中的胆固醇及胆固醇酯含量分析结果见图2。

由图2可知，初乳中胆固醇含量最高，平均含量高达176.33 mg/L；过渡乳中胆固醇平均含量为115.44 mg/L；成熟乳中胆固醇含量仅为97.12 mg/L。运用SPSS 26.0进行单因素方差分析，在95%的置信度下不同泌乳期的胆固醇含量有显著差异(P<0.05)。并采用Duncan法和LSD法多重比较检验结果，其中过渡乳和成熟乳间的胆固醇平均含量差异并不显著，而胆固醇含量在初乳与过渡乳、初乳与成熟乳间存在显著差异。由初乳到过渡乳和成熟乳，随着泌乳期的延长，母乳中胆固醇含量逐渐降低，这与曹宇彤[13]的研究结果是一致的。初乳中胆固醇含量最高，可能表明刚出生的婴儿需要较高的胆固醇水平以加快器官的形成，特别是脑部发育中脑细胞的构成。

研究发现，母乳中的胆固醇酯含量甚微，在一部分母乳样品中甚至未检测到胆固醇酯，且不同个体中胆固醇酯含量差异较大。初乳中胆固醇酯平均含量可达0.59 mg/L；过渡乳中胆固醇酯平均含量为0.51 mg/L；成熟乳中胆固醇酯平均含量仅为0.16 mg/L。由胆固醇酯在不同泌乳期的平均含量可初步判断，初乳中胆固醇酯含量最高，从初乳和过渡乳到成熟乳，胆固醇酯含量也逐渐降低，这与VILLASE width=11,height=14,dpi=110

OR等[14]的研究结果也是一致的。在母乳脂中，甘油三酯含量达到脂肪总量的98%左右[8]，由此可见母乳中的脂肪酸大多以游离形式或甘油三酯形式存在，仅少量脂肪酸与胆固醇结合而成胆固醇酯。

母乳的主要特点就是其独特性，母乳脂存在着巨大的个体内差异和个体间差异。即使是同一位乳母，其母乳成分也会随泌乳期不断改变，并且在一日中乳脂的含量变异最大，左右乳也显著不同[15]。由图2可知，不同个体中的胆固醇及胆固醇酯含量均存在较大差异，可能与乳母间的饮食情况、健康状态以及生活方式等因素的差异和婴儿需求差异有关。但也有研究表明，乳胆固醇含量不受乳母膳食的影响，而与乳脂含量有关，可能原因是乳胆固醇因参与甘油三酯的运输而与乳甘油三酯的分泌有联系[16]。胆固醇酯的形成是防止游离胆固醇积累的重要方式，所以母乳中胆固醇酯含量可能会因个体间胆固醇的差异而有所不同[17]。并且不同个体的母乳中胆固醇酰基转移酶(acyl-coenzyme A∶cholesterol acyltransferase, ACAT)和胆盐刺激性脂酶(bile salt-stimulated lipase, BSSL)的含量也存在一定差异[18-19]，使得母乳中胆固醇酯在各种因素的叠加影响下而呈现出较大的个体差异。

2.2.2 母乳中的胆固醇酯类型分布

不同泌乳期中主要的胆固醇酯组成和含量也不同，如图3所示。初乳中检测到的13种胆固醇酯中，α-亚麻酸胆固醇酯(C18∶3)、二十二酸胆固醇酯(C22∶0)、二十四酸胆固醇酯(C24∶0)、二十碳烯酸胆固醇酯(C20∶1)和十七酸胆固醇酯(C17∶0)含量相对较高。过渡乳中检测到的11种胆固醇酯中，二十四酸胆固醇酯(C24∶0)和棕榈酸胆固醇酯(C16∶0)含量相对较高，同时也是整个泌乳期含量最高的2种胆固醇酯。成熟乳中检测到的7种胆固醇酯中，二十四酸胆固醇酯(C24∶0)和十七酸胆固醇酯(C17∶0)含量相对较高。

母乳中70%的棕榈酸、油酸、亚油酸会选择性地结合甘油sn-2位的羟基[20]，这种分布可促进人体对脂肪、矿物质的吸收和利用。所以即使母乳中这几种脂肪酸含量较高，但本次实验并未检出亚油酸胆固醇酯(C18∶2)，油酸胆固醇酯(C18∶1)也仅在初乳中检出且含量较少。此外，硬脂酸胆固醇酯(C18∶0)在3个泌乳期的含量也普遍较低。虽然棕榈酸胆固醇酯(C16∶0)是母乳中浓度最高的胆固醇酯，但本次实验仅在个别过渡乳样品中检出。杨广花等[21]在催化胆固醇合成胆固醇棕榈酸酯(C16∶0)的研究中也发现，胆固醇的最终酯化率并没有因为棕榈酸含量的增加而提高。所以，母乳中含量较高的棕榈酸、油酸、亚油酸和硬脂酸其对应的胆固醇酯含量不一定高。

虽然母乳中常见的短链脂肪酸有丁酸、己酸和辛酸[22]，但丁酸胆固醇酯是(C4∶0)母乳中检测到的唯一一个短链脂肪酸胆固醇酯。由于乳脂几乎是人类饮食中丁酸的唯一来源，所以丁酸仍会以游离或丁酸酯的形式存在于母乳中[23]。可能为了利于婴儿更好地消化吸收短链脂肪酸，母乳脂中短链脂肪酸更倾向于分布在甘油sn-1位和sn-3位[24]。母乳中的丁酸含量随泌乳期延长而逐渐增加[22]，而丁酸胆固醇酯(C4∶0)的含量逐渐减少，以适应婴儿对短链脂肪酸的需要和提高短链脂肪酸的吸收率。

胆固醇酯以及甘油酯的脂肪酸组成在很大程度上决定了母乳脂的营养和物理化学性质。α-亚麻酸可促进婴儿视力发育、增强智力和预防过敏性反应，花生四烯酸对婴儿的大脑、神经系统以及视力的发育至关重要[20]。这类必需脂肪酸所对应的α-亚麻酸胆固醇酯(C18∶3)和花生四烯酸胆固醇酯(C20∶4)均在初乳中含量最高，可见此类胆固醇酯在初乳中尤为重要，可能表明刚出生的婴儿需要较高水平α-亚麻酸胆固醇酯(C18∶3)和花生四烯酸胆固醇酯(C20∶4)以满足其视力、大脑以及神经系统发育的需求。二十二碳烯酸胆固醇酯(C20∶1)和花生酸胆固醇酯(C20∶0)都是仅在初乳和过渡乳中少量存在，在成熟乳中未检出，这可能与母乳中二十二碳烯酸和花生酸本身含量较低有关[22]。

2.3 主成分分析

将3段泌乳期的13种胆固醇酯指标转换为13个成分，进行主成分分析，在KMO和巴特利特检验中，KMO=0.645>0.5、球形度检验P=0.000<0.05，因此适合主成分分析。如表2所示，根据各主成分的特征值和贡献率进行主成分提取，最终提取6个主成分，6个主成分的方差贡献率累计达到76.32%，能够代表所有指标的绝大部分信息，从原来的13个指标减少为6个新指标，从而起到了降维的作用。

因子载荷值反映母乳中各种胆固醇酯对主成分载荷的相对大小和影响的方向，载荷值分析结果见表3，由表3可知PC1主要综合了硬脂酸胆固醇酯(C18∶0)、二十二碳烯酸胆固醇酯(C22∶1)、花生酸胆固醇酯(C20∶0)、丁酸胆固醇酯(C4∶0)、二十四碳烯酸胆固醇酯(C24∶1)、二十二酸胆固醇酯(C22∶0)，方差累积贡献率为31.137%，是最主要的主成分；PC2综合了二十四酸胆固醇酯(C24∶0)、棕榈酸胆固醇酯(C16∶0)；PC4综合了花生四烯酸胆固醇酯(C20∶4)、十七酸胆固醇酯(C17∶0)；PC3、PC5 和PC6分别与二十碳烯酸胆固醇酯(C20∶1)、α-亚麻酸胆固醇酯(C18∶3)、油酸胆固醇酯(C18∶1)相关。

2.4 相关性分析

2.4.1 胆固醇与总胆固醇酯的相关性分析

由于母乳中胆固醇酯是由胆固醇与脂肪酸酯化形成，推测胆固醇酯含量可能与胆固醇含量具有一定相关性，对此利用SPSS 26.0软件对150份母乳中的胆固醇含量与胆固醇酯含量的相关性进行分析，其分析数据如表4所示，显著性概率值P<0.01，表示在0.01的显著性水平上(99.0%的置信度)极显著。胆固醇与胆固醇酯含量之间的皮尔逊相关系数为0.357，可见两者之间仅存在较弱的正相关性，说明母乳中胆固醇酯的调节机制不是简单的浓度依赖关系。形成胆固醇酯部分的特定的脂肪酸要么由乳腺内源性合成，要么从母体血浆中摄取，这2种脂肪酸来源都受母体饮食的影响[25]，所以母乳中胆固醇酯的含量可能不仅受胆固醇含量的影响，还可能间接受母亲饮食情况的影响，该方面还有待进一步研究。

2.4.2 各种胆固醇酯之间的相关性分析

采用皮尔逊相关系数分析母乳中各种胆固醇酯之间的相关性，可了解胆固醇酯差异中潜在的代谢关联性，为更为深入的代谢组的研究提供分析依据。分析结果见图4，可将母乳中的13种胆固醇酯聚为两类。

一类以饱和脂肪酸胆固醇酯为主，且该类中的6种胆固醇酯与前面主成分分析所得PC1中的6种胆固醇酯是一致的。丁酸胆固醇酯(C4∶0)、二十四碳烯酸胆固醇酯(C24∶1)、二十二碳烯酸胆固醇酯(C22∶1)、硬脂酸胆固醇酯(C18∶0)、花生酸胆固醇酯(C20∶0)和二十二酸胆固醇酯(C22∶0)这6种胆固醇酯两两之间均呈十分显著正相关(P≤0.001)，尤其是二十二碳烯酸胆固醇酯(C22∶1)与硬脂酸胆固醇酯(C18∶0)具有极强的相关性(皮尔逊相关系数为0.88)，这表明母乳中二十二碳烯酸胆固醇酯(C22∶1)含量高的，其硬脂酸胆固醇酯(C18∶0)含量也相对较高，二者关联性依据还需要进一步研究。另一类以不饱和脂肪酸胆固醇酯为主，而这7种胆固醇酯与母乳中其他胆固醇酯大多呈极弱的相关性或无相关性。

3 结论与讨论

本研究利用UPLC-HRMS同时检测母乳中的胆固醇及胆固醇酯，其中初乳、过渡乳和成熟乳中除胆固醇外分别检出13、11、7种微量胆固醇酯，母乳中的脂肪酸大多以游离形式或甘油三酯形式存在，仅少量脂肪酸与胆固醇结合而成胆固醇酯。母乳中胆固醇及胆固醇酯含量存在较大的个体差异，但总体上胆固醇及胆固醇酯含量均在初乳中含量最高，其含量随泌乳期延长而逐渐降低。在整个泌乳期中，过渡乳中的二十四酸胆固醇酯(C24∶0)和棕榈酸胆固醇酯(C16∶0)含量最高。母乳中含量较高的脂肪酸如油酸、亚油酸和硬脂酸所对应的亚油酸胆固醇酯(C18∶2)，油酸胆固醇酯(C18∶1)和硬脂酸胆固醇酯(C18∶0)在3个泌乳阶段里的含量普遍较低甚至没有，母乳中的必需脂肪酸如α-亚麻酸和花生四烯酸所对应的α-亚麻酸胆固醇酯(C18∶3)和花生四烯酸胆固醇酯(C20∶4)在初乳中的含量最高，以满足刚出生婴儿的视力、大脑以及神经系统发育的需求，而丁酸胆固醇酯是(C4∶0)是母乳中唯一一个短链脂肪酸胆固醇酯。

可能母乳中胆固醇酯含量与母体的饮食情况等因素也有关，所以母乳中的胆固醇含量与总胆固醇酯含量仅具有较弱的正相关性(皮尔逊相关系数为0.357)，但不同的胆固醇酯之间表现出一定的相关性，尤其是二十二碳烯酸胆固醇酯(C22∶1)与硬脂酸胆固醇酯(C18∶0)具有极强的相关性(皮尔逊相关系数为0.88)，二者关联性依据还需要进一步研究。通过聚类分析可将13种胆固醇酯划分为两类，一类以饱和脂肪酸胆固醇酯为主，且与PC1中的6种胆固醇酯一致，另一类以不饱和脂肪酸胆固醇酯为主。

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