随着我国居民生活水平的提高，消费观念转变，消费者对饮料的健康属性也愈发关注。各式茶饮料是近年来增长最为迅速的品类之一，其富含茶多酚、氨基酸、维生素等有益成分，具有抗氧化、防辐射、抗癌、抗衰老等功能[1-2]。另一方面，茶饮料中富含咖啡碱，适量的摄入咖啡因能提高中枢神经兴奋[3]，有效缓解疲劳[4]，但是有医学研究表明，长期摄入咖啡碱对心血管系统、神经系统造成损伤，对儿童、孕妇的损害作用尤为显著[5]。鉴于现代年轻人群对健康生活理念的追求，若能有效除去茶饮料中的咖啡碱，且尽可能减少茶多酚等有益成分的损失，这种饮料将适应更多的人群，拥有更广阔的市场前景[6]。
除去茶叶中咖啡碱的方法有很多种，包括超临界萃取法[7]、吸附法[8]、水溶液洗脱法[9]、有机溶剂萃取法等[10]。综合考虑安全性和工艺便捷性，吸附法是目前最经济高效的方法，吸附材料主要包括离子交换树脂、活性炭、蒙脱石等。蒙脱石具有高效的咖啡碱选择性吸附能力，但是吸附过程会使茶汤色泽变暗，影响茶饮料品质。壳聚糖是天然甲壳素脱除部分乙酰基的产物，具有出色的抗菌性[11]、金属离子螯合能力[12]，被作为潜在的功能性材料，广泛应用于医药生物[13]、食品添加剂[14]、农业[15]等领域。
本研究在前期蒙脱石吸附咖啡碱机理研究的基础上[8]，利用壳聚糖对蒙脱石进行改性处理，研究蒙脱石负载壳聚糖后脱咖啡碱处理对茶汤品质的影响，弥补单一蒙脱石吸附工艺的不足，以期为开发优质脱咖啡碱茶饮料提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
绿茶、红茶、乌龙茶，浙江茶乾坤食品股份有限公司；蒙脱石，石家庄飞吉矿产品有限公司；壳聚糖(脱乙酰度>85%)，浙江金壳药业有限公司；维生素C，帝斯曼(中国)有限公司；咖啡碱、铁标准溶液，国药集团；乙腈、冰乙酸、甲醇，均为市售色谱纯；没食子酸、碳酸钠、福林酚、硝酸等，均为市售化学纯。
1.2 仪器与设备
磁力搅拌器，德国IKA仪器有限公司；Agilent 1260型HPLC高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；UV1800型紫外分光光度计，日本岛津仪器有限公司；XS403S型电子分析天平，梅特勒-托力多仪器有限公司；PHS-3C型pH计，上海雷磁仪器有限公司；ST16型高速离心机，赛默飞世尔科技有限公司；Sigma 300型扫描电镜，卡尔蔡司股份有限公司；X′Pert3 Powder X射线衍射仪，马尔文帕纳科公司；UltraScan PRO色差仪，美国Hunterlab公司；AFS-930原子荧光光度计，北京吉天仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 壳聚糖改性蒙脱石的制备
壳聚糖改性蒙脱石的制备参考胡超等[16]的方法。将1 g壳聚糖溶解到1 L 1%(体积分数)HCl中，用0.1 mol/L NaOH调节壳聚糖溶液pH到5.0。室温搅拌下，称取一定量的蒙脱石，以m(蒙脱石)∶m(壳聚糖)分别为1∶0.005(B1)、1∶0.01(B2)、1∶0.02(B3)、1∶0.04(B4)的比例添加到壳聚糖溶液中，持续搅拌12 h，分散液在9 000 r/min离心30 min。弃去上清液，50 ℃减压烘干至恒重，磨细备用。
将制备好的改性蒙脱石分别投入绿茶提取液，添加量为茶提取液质量的2%，通过测定咖啡碱的脱除率、茶多酚保留率以及溶液中铁元素的含量确定蒙脱石与壳聚糖复合的最佳质量比。
1.3.2 茶提取液制备
取50 g茶叶，0.15 g维生素C，投入到1 500 g纯净水中，80 ℃搅拌提取15 min后经冷却，过滤，调配制得茶提取液，按相同方法分别制备红茶、绿茶、乌龙茶茶提取液。
1.3.3 壳聚糖改性蒙脱石在茶饮料中的应用
各取1.3.2中的100 g茶提取液，分别投入2 g蒙脱石或壳聚糖改性蒙脱石，25 ℃水浴搅拌10 min，8 000 r/min离心6 min，取上清液分析茶多酚、咖啡碱、铁元素含量以及色差，另取部分上清液稀释配制成纯茶饮料，进行感官分析。
1.4 检验分析方法
1.4.1 扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)分析
分别取适量蒙脱石、壳聚糖改性蒙脱石样品，经喷金预处理后在Sigma 300型扫描电镜下观察样品的微观表面形态，并拍摄照片[17]。
1.4.2 X射线衍射分析
分别取适量蒙脱石、壳聚糖改性蒙脱石样品，用X'Pert3 Powder X射线衍射仪对改性前后的蒙脱石进行X射线衍射(X-ray diffraction, XRD)分析，分析其晶体结构[18]。工作参数：扫描电压40 kV，扫描电流40 mA，扫描速度2°/min，测试范围5°～60°。
1.4.3 茶多酚的测定
茶提取液中茶多酚含量的测定参考GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》。以没食子酸为标准品制作标准曲线。分别取纯水和测试液各1 mL于25 mL容量瓶中，每个容量瓶内加入5.0 mL福林酚试剂，摇匀，反应5 min，加入4.0 mL 7.5%(质量分数)Na2CO3溶液，加水定容至刻度，摇匀静置60 min。用1 cm比色皿在765 nm下测定吸光度(A、A0)。
1.4.4 咖啡碱的测定
茶提取液中咖啡碱的测定方法参考GB/T 8312—2013《茶 咖啡碱测定》中高效液相色谱法。以咖啡碱的质量浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
HPLC测定条件：紫外检测器；SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：V(水)∶V(甲醇)=7∶3；流速1 mL/min；进样量20 μL；检测波长280 nm；柱温40 ℃。
1.4.5 铁元素的测定
茶提取液中铁元素的测定参考GB 5009.90—2016《食品安全国家标准 食品中铁的测定》中的火焰原子吸收光谱法。
1.4.6 感官评定
感官评定小组由10位经过培训的专业研究人员组成，以整体喜好度对茶饮料进行打分[19]。“0～3”分表示差，难以接受；“4～7”分表示合格，可以接受；“8～10”分表示优秀，非常喜欢。
1.4.7 色差分析
取适量样品，用UltraScan PRO色差仪分析色差[20]。色差计算如公式(1)所示：
(1)
式中：ΔE表示色差综合评定指标，值越小表示颜色越接近；ΔL为正表示样品偏亮，为负表示样品偏暗；Δa为正表示样品偏红，为负值表示样品偏绿；Δb为正值，表示样品偏黄，为负值表示样品偏蓝。
1.5 数据分析
每个样品设3组平行，采用Oringin 9.0和SPSS 19.0软件进行数据分析，数据结果进行ANOVA方差分析，并以“平均值±标准偏差”表示。
2 结果与分析
2.1 壳聚糖和蒙脱石质量比的确定
通过考察壳聚糖和蒙脱石复合的质量比对茶汤中咖啡碱脱除率的影响，以及处理后溶液中铁元素的含量，来确定壳聚糖和蒙脱石复合的最佳质量比，结果如图1所示。由图1可知，负载了壳聚糖的蒙脱石对咖啡碱的吸附效率降低，并且随着壳聚糖负载量的增加，吸附效率降低越明显。由表1可知，蒙脱石处理后茶饮料中铁离子含量明显增高，负载壳聚糖的蒙脱石处理后，溶液中铁离子浓度明显降低，当壳聚糖负载量≥1%(B2组)，蒙脱石层间铁离子无法通过离子交换进入溶液中。前期的研究表明，蒙脱石对咖啡碱的吸附过程受化学吸附控制，包括外部膜扩散、表面吸附、颗粒内部扩散多个过程，负载在表面的壳聚糖颗粒可能占据了部分吸附位点，导致吸附效率下降。另一方面，壳聚糖对金属离子有明显的螯合作用，负载在蒙脱石表面的壳聚糖也可能导致孔道堵塞[21]，有效抑制蒙脱石插层中Fe3+、Fe2+等金属离子的溶出和交换能力，避免引起茶饮料的颜色劣变。
表1 壳聚糖负载量对铁离子溶出率的影响
Table 1 The effect of chitosan loading on the dissolution rate of iron ions
组别原样蒙脱石B1B2B3B4Fe/(mg·kg-1)<0.866.81.3<0.86<0.86<0.86
注：<0.86表示铁元素含量小于检测限
图1 壳聚糖负载量对咖啡碱去除率的影响
Fig.1 The effect of chitosan loading on the removal rate of caffeine 注：不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)
2.2 SEM图分析
本研究利用SEM分析蒙脱石和壳聚糖改性蒙脱石的形貌变化。由图2可知，壳聚糖改性前后蒙脱石的表面结构发生了很大的变化，蒙脱石表面结构致密，壳聚糖改性后表面结构变得疏松，表面颗粒明显增多，形成剥离型结构，表明壳聚糖附着在蒙脱石表面。
a-蒙脱石；b-壳聚糖改性蒙脱石
图2 蒙脱石和壳聚糖改性蒙脱石的SEM图
Fig.2 SEM images of montmorillonite and chitosan modified montmorillonite
2.3 XRD分析
图3为蒙脱石改性前后的XRD图，由图3可知，经壳聚糖改性后的蒙脱石的2θ角度基本不变，在2θ=5.99°有明显尖锐的001峰，根据布拉格定律λ=2·d·sinθ(λ为入射波波长，d为平行原子平面的间距，θ为入射光与晶面之夹角)，说明蒙脱石的结晶骨架延c轴d(001)之间没有扩大，即壳聚糖没有插入蒙脱石的夹层中，只吸附在蒙脱石表面，形成复合吸附剂。这可能是因为壳聚糖的分子质量太大，不易插入蒙脱石层间。另一方面，由于蒙脱石晶包层状结构中间存在诸多阳离子，例如Cu2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Ni2+等，使层间产生较弱的负电荷，而壳聚糖分子含有较多的—NH2基团，溶于酸性溶液后产生正电荷，两者通过正负电荷的相互作用结合在一起，形成复合吸附剂。
a-蒙脱石；b-壳聚糖改性蒙脱石
图3 XRD图
Fig.3 XRD pattern
2.4 蒙脱石改性前后对茶饮料品质的影响
表2显示了蒙脱石和壳聚糖改性蒙脱石在不同茶饮料中的应用结果。与蒙脱石相比，壳聚糖改性蒙脱石对咖啡碱的吸附效果基本不变，但对茶多酚的吸附效果加强，说明壳聚糖改性蒙脱石对咖啡碱和茶多酚的选择性吸附性能下降。可能是因为壳聚糖吸附在蒙脱石表面，引起表面电荷或者结构的变化，对咖啡碱的特异吸附点减少。感官评定显示蒙脱石进行脱咖啡碱处理的茶饮料得分较低，是因为蒙脱石的层间金属阳离子通过离子交换溶入茶饮料中，导致色泽、口感发生改变[22]。当蒙脱石负载壳聚糖后，由于壳聚糖对金属离子的络合作用，减少了离子交换，茶饮料口感得到明显改善，整体与原样更接近。
表2 壳聚糖改性蒙脱石对茶饮料品质的影响
Table 2 Effect of chitosan modified montmorillonite on the quality of tea beverage
茶叶组别咖啡碱脱除率/%茶多酚保留率/%感官评分原样//9.43±1.33绿茶A86.84±0.6888.51±0.713.42±0.87B86.01±1.8084.52±1.017.35±1.04原样//9.12±0.95乌龙茶A92.13±1.3986.93±0.762.88±0.83B91.44±0.8881.56±0.498.06±0.55原样//8.97±0.74红茶A92.73±1.0375.23±0.483.75±0.89B91.77±1.1174.45±1.216.99±1.06
注：A组为蒙脱石处理；B组为壳聚糖改性蒙脱石处理(下同)
经脱咖啡碱处理后茶饮料的色差分析结果如表3所示，蒙脱石处理样品ΔL均为负值，表明茶饮料颜色明显偏暗，这是由于蒙脱石夹层中的铁离子溶出引起的[8]，有研究表明，0.01%的铁离子就能使绿茶茶汤明显变暗[23]。负载壳聚糖后抑制了铁离子溶出，B组的茶饮料ΔL均为正值，并且B组的整体色差ΔE值均小于A组，说明相同条件下，壳聚糖改性蒙脱石作为吸附剂用于茶饮料脱咖啡碱处理对茶饮料原有色泽影响更小，能更有效地保持茶饮料的品质。
表3 脱咖处理后茶饮料的色差分析
Table 3 Analysis of the color difference of tea beverages after coffee removal
茶叶组别ΔLΔaΔbΔE乌龙茶A-8.34±0.9712.55±1.1014.69±1.0421.05±1.73B11.75±0.98-1.63±0.61-9.00±0.8114.97±0.35绿茶A-4.00±1.2014.82±0.9511.35±0.7319.57±0.68B5.80±0.97-5.34±1.19-13.9±0.8216.02±1.30红茶A-8.05±1.006.39±1.0413.79±2.3117.43±1.43B13.54±1.21-4.64±0.323.50±0.3214.75±1.16
3 结论
本实验通过将壳聚糖吸附在蒙脱石表面制备复合吸附剂，用于选择性去除茶饮料中的咖啡碱，制备高品质脱咖啡碱茶饮料。结果表明，以质量比1∶0.01负载壳聚糖的蒙脱石，对茶饮料中的咖啡碱脱除率与改性前相似，但是茶多酚的保留率略有下降，可见负载壳聚糖后，蒙脱石对咖啡碱的选择性吸附性能下降。此外，之前的研究表明在蒙脱石吸附咖啡碱的过程中，层间阳离子会通过离子交换溶入到茶饮料体系中，引起风味色泽变化。而经壳聚糖改性后能有效遏制层间铁离子溶出，铁离子不仅能引起茶汤褐变，同时也是自动氧化的催化剂，遏制铁离子的溶出，能有效提高茶饮料的感官品质。本文在蒙脱石吸附咖啡碱的研究基础上，对吸附剂材料进行了优化，为工业生产风味更佳的脱咖啡碱茶饮料提供试验依据。
[1] HAN C Y, LIU C Y, GENG J S, et al.Black and green tea supplements ameliorate male infertility in a murine model of obesity [J].Journal of Medicinal Food, 2020, 23(12):1 303-1 311.
[2] 谭冬明, 罗星晔, 陈全斌.广西甜茶水提取物中不同分离部位的抗氧化性研究[J].中国食品添加剂, 2016(6):125-129.TAN D M, LUO X Y, CHEN Q B.Study on the antioxidant activity of different separated parts in water extracts from Rubus savissimus S.Lee[J].China Food Additives, 2016(6):125-129.
[3] GUEST N S, VANDUSSELDORP T A, NELSON M T, et al.International society of sports nutrition position stand:Caffeine and exercise performance [J].Journal of the International Society of Sports Nutrition, 2021, 18(1):1.
[4] 李淑翠, 张敏, 陈向明,等.咖啡因抗运动性疲劳作用的实验研究[J].中国食品添加剂, 2012(3):120-124.
LI S C, ZHANG M, CHEN X M, et al.The effects of caffeine on exercise-induced fatigue in mice[J].China Food Additives, 2012(3):120-124.
[5] HERING-HANIT R, GADOTH N.Caffeine-induced headache in children and adolescents[J].Cephalalgia:an Interational Journal of Headeche, 2003, 23(5):332-335.
[6] AKHUNDOVA J, KAYA C T, GEREDE 
D M.Acute effects of consumption of low-caffeine energy drinks on endothelial functions in healthy volunteers[J].The Anatolian Journal of Cardiology, 2021, 25(10):678-683.
[7] 苗笑雨, 谷大海, 程志斌, 等.超临界流体萃取技术及其在食品工业中的应用[J].食品研究与开发, 2018, 39(5):209-218.
MIAO X Y, GU D H, CHENG Z B, et al.Applying the technology of supercritical fluid extraction in food industry[J].Food Research and Development, 2018, 39(5):209-218.
[8] SHIONO T, YAMAMOTO K, YOTSUMOTO Y, et al.Selective decaffeination of tea extracts by montmorillonite[J].Journal of Food Engineering, 2017, 200:13-21.
[9] YE J H, LIANG Y R, JIN J, et al.Preparation of partially decaffeinated instant green tea[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(9):3 498-3 502.
[10] 尔朝娟. 茶叶咖啡碱脱除技术研究[D].无锡:江南大学, 2012.
ER C J.Study on the technology of decaffeination of tea[D].Wuxi:Jiangnan University, 2012.
[11] CHEN J X, FAN L B, YANG C L, et al.Facile synthesis of Ag nanoparticles-loaded chitosan antibacterial nanocomposite and its application in polypropylene [J].International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 161:1 286-1 295.
[12] LIU X Q, ZHAO X X, LIU Y, et al.Review on preparation and adsorption properties of chitosan and chitosan composites[J].Polymer Bulletin, 2022, 79(4)：2 633-2 665.
[13] JIA Z F, ZHU F Y, LI X F, et al.Repair of osteochondral defects using injectable chitosan-based hydrogel encapsulated synovial fluid-derived mesenchymal stem cells in a rabbit model[J].Materials Science & Engineering:C, 2019, 99:541-551.
[14] SHAHIDI F, ARACHCHI J K V, JEON Y J.Food applications of chitin and chitosans[J].Trends in Food Science & Technology, 1999, 10(2):37-51.
[15] HASEENA P V, PADMAVATHY K S, KRISHNAN P R, et al.Adsorption of ammonium nitrogen from aqueous systems using chitosan-bentonite film composite[J].Procedia Technology, 2016, 24:733-740.
[16] 胡超, 王有宁,郑足红,等.蒙脱石-壳聚糖复合物对磷吸附性能的研究[J]．农业环境科学学报，2017，36(10):2 086-2 091.
HU C, WANG Y N, ZHENG Z H, et al.Phosphate adsorption by composites of chitosan-saturated montmorillonite[J].Journal of Agro-Environment Science, 2017, 36(10):2 086-2 091.
[17] SURYA L, SHEILATIN, PRAJA P V, et al.Preparation and characterization of titania/bentonite composite application on the degradation of naphthol blue black dye [J].Research Journal of Chemistry and Environment, 2018, 22(2):48-53.
[18] 程华丽, 李瑾, 王涵, 等.壳聚糖/蒙脱土插层复合物对活性红染料的吸附热力学研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版)，2014, 44(6):90-96.
CHENG H L, LI J, WANG H, et al.Thermodynamic analysis of chitosan/montmorillonite intercalation composites as adsorbents for reactive red[J].Periodical of Ocean University of China, 2014, 44(6):90-96.
[19] 梁俐俊. 茶叶感官审评的评分方法 [J].福建茶叶, 1999, 21(4):14-15.
LIANG L J.Scoring method for sensory evaluation of tea [J].Tea in Fujian, 1999, 21(4):14-15.
[20] 王家勤, 姚月凤, 袁海波, 等.基于色差系统的工夫红茶茶汤亮度的量化评价方法研究[J].茶叶科学, 2020, 40(2):259-268.
WANG J Q, YAO Y F, YUAN H B, et al.A quantitative method for brightness evaluation of congou black tea infusions based on color difference analysis[J].Journal of Tea Science, 2020, 40(2):259-268.
[21] ABOLLINO O, ACETO M, MALANDRINO M, et al．Adsorption of heavy metals on Na-montmorillonite.Effect of pH and organic substances[J].Water Research, 2003, 37(7):1 619-1 627
[22] 尹军峰, 许勇泉, 陈建新,等.主要金属离子对冷溶性速溶绿茶复水后品质的影响[J].食品科学, 2009,30 (7):99-105.
YIN J F, XU Y Q, CHEN J X, et al.Effects of main metal ions on the quality of cold-soluble instant green tea after rehydration [J].Food Science, 2009,30 (7):99-105.
[23] 杨晓萍, 郭大勇, 周家刚.绿茶饮料汤色的稳定性[J].食品工业, 2003, 24(2):19-20.
YANG X P, GUO D Y, ZHOU J G.Studies on infusion color stability of green tea drink[J].The Food Industry, 2003, 24(2):19-20.