白酒是中国特有的蒸馏酒产品，与白兰地、苏格兰威士忌、伏特加、朗姆酒和杜松子酒并列为六大世界著名的蒸馏酒。白酒是传统产品，也是满足人们不断进步的物质文化和精神文化需求不可或缺的、具有深厚历史文化底蕴的饮品。
近年来，随着白酒理化分析技术和白酒现代勾调技术的进步，助推了白酒产业高速发展，逐步形成了低端抢份额、中高端赚利润的市场局面，但随之而来的是竞争压力增大，一些不法分子掺入食用酒精冒充固态法白酒的现象禁而不绝，这种“掺杂”“以次充好”等违法行为严重干扰了白酒市场的健康有序发展。国内学者很早就开始了对固态法白酒掺假的鉴别研究，并应用了多种分析检测技术[1-4]，但这些基于理化分析和感官特征的研究都是分析特征物质的成分与含量，随着检测技术的蓬勃发展，白酒中特征物质的成分与含量将逐一破解，制假者可以进行“配方式”造假进而勾兑出与品牌白酒特征相近的白酒，造成上述方法的局限性逐渐增大。
稳定同位素技术是已被证实的可用于食品掺假检测和真实性鉴别的有效技术手段，在葡萄酒[5]、蜂蜜[6-7]、果汁[8]等食品领域已得到成功应用，而在食醋、牛奶、植物油等领域的研究也正在展开[9-14]。在白酒领域，国内研究者也已取得一些关键性突破[15-16]，发现在白酒掺假鉴别领域的应用可行性。但上述研究多是针对白酒产品或科研性样品，而由于稳定同位素的自然分馏特征以及白酒开放式、多粮多菌种混合发酵，钟其顶等[15]曾提出应用同位素数据库进行白酒的真伪鉴别，也有研究[17-18]清晰分析了酒精发酵过程与蒸酒过程的影响，但白酒大生产条件下的同位素分馏特征和变化规律尚不明确。基于此，本文利用该技术研究了白酒生产过程中乙醇稳定碳同位素变化规律，为白酒的真伪鉴别方案制定提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2018年—2021年新生产的基础酒(经发酵、蒸馏而得到的未经勾兑的酒)270个、酒醅23个、成品白酒58个，均由酒厂提供，产品真实性可保障。
丙酮(色谱级)，上海麦克林有限公司；过二硫酸钠、正磷酸(分析级)，国药集团化学试剂有限公司；BCR 656标准品(δ13C=-26.91‰)，欧洲标准局。
1.2 仪器与设备
Trace GC Ultra气相色谱仪、GC Isolink燃烧转化装置、Delta V Advantage稳定同位素比值质谱仪、DIONEX 3000液相色谱仪、LC Isolink转化装置，Thermo Fisher公司。
1.3 测定方法
1.3.1 气相色谱-燃烧-稳定同位素比值质谱(gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry,GC-C-IRMS)测定基础酒乙醇δ13C
色谱条件：Wax毛细管柱(50 m×0.32 mm×0.20 μm)；载气为氦气；柱流速1.2 mL/min；进样口温度 200 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保持5 min，以2 ℃/min升温至50 ℃，然后以25 ℃/min速率升温达到200 ℃，保持2 min。进样体积1 μL；分流比20∶1[17-18]。
燃烧转化装置：配备陶瓷(Al2O3)氧化管(填料为CuO，NiO和Pt)，工作温度为1 000 ℃。
1.3.2 液相色谱-稳定同位素比值质谱(liquid chromatograph-isotope ratio mass spectrometry,LC-co-IRMS)测定酒醅乙醇δ13C[19]
色谱柱为Hyper REZ XP Carbohydrate H+柱(300 mm×7.7 mm，8 μm)；流动相为超纯水，流速350 μL/min；柱温30 ℃，进样体积10 μL。磷酸溶液和过二硫酸钠溶液作为反应助剂，流速0.05 mL/min。
1.4 结果计算
由于自然界中各元素的轻重同位素比值(R)变化程度较小，国际上通常采用相对测量法表示物质的同位素比值，碳元素的稳定同位素特征均以国际基准物质为参照，δ(千分差，‰)的计算如公式(1)所示：
δ13 C/‰=(R样品/R标准-1)×1 000
(1)
式中：R=13C/12C；R样品为被测样品的同位素比值，R标准为国际基准物质的同位素比值。
1.5 数据处理
使用SPSS软件对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 蒸酒过程对稳定同位素特征的影响
MOUSSA等[20]研究Cadiot旋转带蒸馏系统提取溶液中乙醇时发现，回收率不同时乙醇的氢同位素特征是不同的，而是随回收率的提高而偏负；BAUDLER等[21]研究白兰地时发现乙醇的碳同位素特征随着蒸酒过程进行而逐渐偏负，这是由于蒸馏过程中发生了反蒸汽压分馏作用，含13C的、质量数大的乙醇分子优先被气化而存在于气态乙醇中，该部分乙醇最先流出蒸馏器而显示出相对偏正的碳同位素特征；张倩等[18]用不同的发酵液模拟蒸馏过程研究时也发现了上述变化。为研究白酒大生产过程中的乙醇碳同位素变化情况，选取一批酒醅和其蒸酒过程，每1 min取样1次，测定各样品的乙醇δ13C值，结果见图1。其中第0次是酒醅中的乙醇δ13C值，并作为零点。
由图1可知，白酒的蒸酒过程中，第15 min以前的流出液中乙醇δ13C均比酒醅偏正，之后才相对偏负，并且馏分乙醇δ13C呈现出逐渐偏负的趋势，这说明白酒大生产条件下，蒸酒工艺也会使得乙醇碳同位素出现反蒸气压分馏效应。本研究中各馏分乙醇δ13C最大差异可达2‰，与BAUDLER等[21]的研究结果一致。因此，若按照钟其顶等[15]提出的基于真实样品建立白酒数据库的建议，在摘酒过程中取样是不可行的，其不能代表白酒的真实特征。
图1 白酒蒸酒过程中乙醇δ13C的变化
Fig.1 Ethanol δ13C variation during distillation
2.2 酒醅与基础酒的乙醇δ13C对应关系研究
王道兵等[17]和张倩等[18]的研究表明发酵底物是乙醇δ13C分布特征的决定性因素。研究酒醅与基础酒的乙醇δ13C对应关系，分别选择6个窖池进行跟踪研究，分别取上中下层酒醅，并从蒸酒后的混合样中取基础酒样品，分别测定乙醇δ13C值，研究酒醅与基础酒中乙醇δ13C对应关系，结果见表1。
表1 基础酒与酒醅的乙醇δ13C之间的差异分析(Δ13C ‰)
Table 1 Ethanol δ13C difference between alcohol fermentative material and crude spirits (Δ13C ‰)
编号上层中层下层窖池1#0.400.040.06窖池2#0.190.10-0.17窖池3#-0.330.03-0.18窖池4#0.18-0.210.11窖池5#-0.170.17-0.17窖池6#-0.190.230.04平均差值0.010.06-0.05标准偏差0.280.150.14
由表1可知，上中下3层酒醅与基础酒乙醇δ13C之间的差异的平均值分别为0.01‰、0.06‰和-0.05‰，这说明酒醅与基础酒具有很好的一致性，虽然2.1中表明蒸酒过程会导致乙醇碳同位素分馏，但由于基础酒是不同酒段样品的混合样，涵盖了比酒醅偏正和偏负的大部分馏分，因此蒸酒过程不会改变酒醅的乙醇δ13C分布特征，可通过分析酒醅推测其基础酒的乙醇碳同位素特征。
2.3 粮食发酵过程中乙醇δ13C变化
白酒生产时会用到多种粮食，包括高粱、玉米、小麦、大米等，其淀粉含量、淀粉形态及颗粒的坚硬程度均有所差异，选择了1个窖池，在发酵过程中每隔7 d取酒醅，测定酒醅的乙醇δ13C值。以上层酒醅第1个样品的乙醇δ13C值为零点，对比分析各酒醅的同位素特征，结果见图2。
图2 发酵过程中乙醇δ13C变化特征
Fig.2 Ethanol δ13C variation during fermentation
图2显示出随着发酵逐渐深入，乙醇δ13C值略有不同,并且呈现逐渐偏正的趋势，这是由于白酒属于复合菌群多粮发酵过程，粮食糊化入池发酵后与微生物的结合程度不同，可能存在某类粮食优先被微生物利用的情况，但总的来说都在一定范围内(极差<1‰)，各样品间的差异不大，因此取发酵过程酒醅可以作为质量监控的一环，用作发酵完成后酒醅乙醇δ13C值的参考。
2.4 基础酒乙醇δ13C变化
作为各类型白酒产品基础的基础酒，其稳定性决定了产品的特征。研究不同生产时间的基础酒的乙醇δ13C特征，固定1个生产班组，每隔3 d共取样112个，测定各酒样的乙醇δ13C。以第1个样品的乙醇δ13C值为零点作图，结果见图3。
图3 不同基础酒的乙醇δ13C特征
Fig.3 Ethanol δ13C characteristics of crude spirits between different batches
由图3可知本次跟踪研究的基础酒，不同样品之间乙醇δ13C最大差异≤1‰，表明由于生产工艺条件相似、粮曲配比相同，乙醇的碳同位素特征是比较稳定的；而在一定范围内波动的原因可能是不同产地粮谷原料的同位素差异导致。
连续4年收集96个基础酒样品(n分别为7、43、9和36)，分别测定各样品的乙醇δ13C值，分析结果见图4(纵坐标单位刻度为1%)。
图4 不同年份基础酒的乙醇δ13C分布
Fig.4 Ethanol δ13C distribution of crude spirits in different year
图4显示，不同年份的基础酒并无显著性差异，但也不完全相同(极差分别为0.61‰、1.97‰、0.46‰和1.16‰)，这是由于白酒企业大规模生产时，生产用粮中碳水化合物的稳定同位素特征随产地、年份、品种而有差异的缘故。有研究表明，同一类含糖物料由于产地、年份不同时，δ13C值的最大差异可达5‰，因此，乙醇δ13C的实际应用中需考虑此差异问题[22]。
2.5 白酒产品乙醇δ13C变化
收集了某酒厂2018/2019年度的多批次多粮(配比一致)酿造的同一品牌的白酒产品样品58个，检测各白酒样品乙醇δ13C值，以第1个白酒样品为零点作图，结果见图5。
图5 同一酒厂2018/2019年度白酒乙醇δ13C变化
Fig.5 Ethanol δ13C variation of Baijiu from one manufacture in 2018/2019
图5显示，该酒厂2018/2019年度生产的多批次白酒乙醇δ13C 均值最大差异为0.96‰，<1‰，并且标准偏差为0.25‰，这说明同一酒厂酿酒粮食配比一致的情况下白酒乙醇δ13C无显著影响。但是，也要注意到该类型产品呈现微小的逐渐偏正的趋势，这可能是由于基础酒的稳定同位素特征存在自然波动的缘故，而基础酒的乙醇δ13C必然与其对应的粮食有关。考虑到此波动性，白酒乙醇δ13C在用于外源食用酒精检测时不能简单设置统一的判定阈值，而是应以数据库为前提开展真实性保障和掺假检测应用。
3 结论
通过长期跟踪试验发现，基础酒和成品酒的乙醇δ13C值均不是恒定值，而发生变化的原因在于乙醇δ13C值受酿酒原料的δ13C特征的影响，因此尽管白酒乙醇δ13C应用于外源食用酒精检测在理论上是可行的，但不能简单设置统一的判定阈值，而是应以数据库为前提或以原酒的δ13C真实值为基础开展真实性保障和掺假检测应用。并且，蒸酒过程中会导致乙醇δ13C发生反蒸气压分馏效应，因此蒸酒过程中的取样可能导致测定结果失真，但同批次酒醅蒸酒后混合的基础酒，可作为“真实样品”用于数据库的建设。
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