维生素K2是一类重要的脂溶性维生素，根据侧链异戊二烯基数目的不同，可以分为多种亚型，如四烯甲萘醌(menaquinone-4, MK-4)、七烯甲萘醌(menaquinone-7, MK-7)、八稀甲萘醌(menaquinone-8,MK-8)等[1]。维生素K2在治疗骨质疏松和心血管硬化等疾病中发挥重要作用[2]。目前，维生素K2主要通过微生物发酵的方法获取。菌种之间生理特性存在差异，导致不同的菌种合成的维生素K2类型不同，比如大肠杆菌(Escherichia coli)主要合成MK-4和MK-8[3]，芽孢类细菌主要合成MK-7[4]。在维生素K2的众多亚型中，MK-7在人体内的半衰期更长，具有良好的亲和性[1]，且近期有研究表明MK-7能够降低发生线粒体功能障碍与帕金森疾病的风险[5]。这些重要的功能使MK-7受到了越来越多的重视，但其生产效率的低下限制了其产业化的进程。
MK-7的结构由2-甲基-(1,4)-萘醌核(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid,DHNA)及C-3位的脂肪侧链(C35)组成。在原核生物中，DHNA是由分支酸经过7步催化获得，侧链由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸经过甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径(methylerythritol-4-phosphate pathway, MEP pathway)获得[6]。在1,4-二羟基-2-萘甲酸异戊二烯基转移酶(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid prenyltransferase, MenA)的作用下将侧链转移到DHNA的C2的位置上，形成2-脱甲基甲萘醌[7]。然后，在甲基转移酶(methyltransferase，MenH)的作用下在C3的位置上增加一个甲基，最终生成MK-7[8](图1)。很多研究通过增加menA的表达量实现维生素K2的高效合成，比如在E.coli中组成型过表达menA和menD，相比于野生型菌株，八烯甲萘醌的产量提高了5倍[3]。在纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)中，HU等[9]确定了D78、D84、D208和D212位天冬氨酸在保持MenA活性发挥重要作用，并通过定点突变技术获得Q67R突变体，提高MenA活力，促进了MK-7的合成。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，通过在不同位点增加menA开放阅读框的拷贝数，MK-7的产量达到75 mg/L，相比于出发菌株提高了约2.3倍[10]。尽管MenA在MK-7的合成过程中起到重要作用，但是对MK-7合成途径中关键基因性质的研究还较少，限制了MK-7产量的进一步提高。
研究表明MK-7是细胞膜的组成成分[11]，在电子传递的过程中起到电子载体的作用[12]，但是关于MK-7进出细胞膜的过程机制却缺少相关报告[13]。针对此问题，结合前期实验结果，我们发现MenA和MenH是MK-7合成途径过程中的关键酶，并且通过(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测MenA和MenH的结构特点，发现MenA具有8个明显的跨膜结构域。为了确认MenA和MenH在细胞中的定位，我们将MenA、MenH与eGFP进行融合，通过绿色荧光蛋白分布确定MenA和MenH位于细胞膜中，进一步发现MenA和MenH在细胞膜上出现随机聚集的现象。实验结果表明，MenA与MenH位于细胞膜，并且MenH在细胞膜中呈现点状分布。然后，利用表面活性剂Triton-100能够破坏细胞膜结构的特性，验证细胞膜的完整性对MK-7合成的影响。在发酵培养基中的Triton-100体积分数为0.1%时，MK-7的合成受到明显的抑制。综上所述，细胞膜的完整性是合成MK-7的前提，位于细胞膜上的MenA和MenH对MK-7在细胞膜中的合成发挥重要作用。
图1 枯草芽孢杆菌中MK-7的合成途径
Fig.1 Synthetic pathway of MK-7 in B.subtilis
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
本实验所用出发菌株为B.subtilis 168，克隆菌株为E.coli JM109，穿梭质粒为pHT01。实验所用菌株、质粒全部保藏于本实验室。
1.2 重组菌株构建
以B.subtilis 168的基因组为模板，扩增menA的开放阅读框(open reading frame, ORF)，使用linker“GSGGGGS”将获得的ORF与egfp进行融合，然后构建在质粒pHT01上。利用同样的方式，分别构建其他蛋白与eGFP的重组表达质粒，使用天然启动子对menA基因进行表达，使用Pveg启动子对menH基因进行表达，用上述构建的质粒转化B.subtilis 168，得到重组菌株。
1.3 荧光蛋白的检测
将重组菌株接种到LB培养基中，37 ℃下220 r/min培养12 h，然后8 000×g离心2 min收集菌体。在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光的分布，其中eGFP的激发波长为488 nm，接收波长507 nm。将获得的绿色荧光图片使用软件ImageJ 1.52进行处理。
1.4 MK-7的发酵
首先在14 mL圆底试管中加入3 mL LB培养基，接入获得的重组菌株置于37 ℃摇床，220 r/min过夜培养。按照3%的接种量，把过夜培养的种子接入发酵培养基中，放入避光的摇床，220 r/min，40 ℃培养，定时取样测量生长情况与MK-7的产量。发酵培养基的配方为(质量分数)：5%葡萄糖，5%蔗糖，5%大豆蛋白胨，0.06% KH2PO4。为检测细胞膜对MK-7产量的影响，在发酵培养基中加入不同浓度的表面活性剂Triton-100，体积分数分别是0.05%，0.1%，0.2%，0.5%，1%。
1.5 MK-7的提取与检测
吸取发酵液到棕色离心管中，使用异丙醇和正己烷的混合物(体积比1∶2)以体积比4∶1的比例(有机物∶发酵液)萃取细胞中MK-7。将混合物用涡旋振荡器剧烈振荡10 min，然后以5 000×g离心5 min以分离有机相和水相，收集有机上清液用来检测MK-7含量。检测MK-7含量的仪器是配备有光子二极管阵列紫外检测器的高效液相色谱仪(Agilent 1260，Santa Clara，CA，USA)，色谱柱为C18 ODS色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)检测波长为254 nm，柱温为40 ℃。甲醇∶二氯甲烷(体积比9∶1)用作流动相，流速为1 mL/min。MK-7校准曲线在1～100 mg/L呈线性关系(R2=0.998)。
2 结果与分析
2.1 基于生物信息学分析MenA和MenH
课题组前期在强化MK-7合成实验中，发现通过强化menA和menH的表达，能够明显促进MK-7的合成，从而确定menA是MK-7合成过程中的关键基因[10]。基于B.subtilis 168的基因组数据，MenA的性质如下：MenA酶蛋白由311个氨基酸组成，其中带有负电荷氨基酸(Asp+Glu)的总共有14个，带有正电荷的氨基酸(Arg+Lys)总共有20个。MenA的分子质量为33.838 kDa，等电点为9.18，蛋白亲水性平均值(grand average of hydropathicity, GRAVY)为0.718。对MenA的跨膜结构进行预测(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，结果如图2所示。MenA酶蛋白共具有8个跨膜结构，跨膜区集中在蛋白中部。
A-TMHMM预测MenA潜在的跨膜区域； B-TMHMM预测MenH潜在的跨膜区域
图2 生物信息学预测MenA和MenH的跨膜结构域
Fig.2 Prediction of transmembrane domains of MenA and MenH by bioinformatics
使用同样的方法预测了MenH的性质，结果如下：MenH酶蛋白由233个氨基酸组成，其中带有负电荷氨基酸(Asp+Glu)的总共有29个，带有正电荷的氨基酸(Arg+Lys)总共有31个。MenH的分子质量为26.576 kDa，等电点为8.27，GRAVY为-0.367。对MenH的跨膜结构进行预测，结果如图2-B所示，MenH酶蛋白没有明显的跨膜结构。
2.2 MenA和MenH的定位
为了验证MenA在细胞中的定位，首先在质粒pHT01上使用天然启动子表达menA，获得重组质粒pHT01-Pnative-menA-eGFP。将重组质粒转化入B.subtilis 168中，然后将重组菌株接种于LB液体培养基中，37 ℃下220 r/min培养12 h。发酵结果显示，强化表达menA之后，细胞的生长并未受到影响(图3-A)。利用激光共聚焦荧光显微镜观察荧光的分布，发现荧光信号出现在细胞膜上，而且是均匀的分布在细胞膜上(分别利用CtaD和YuxO作为阳性和阴性对照)(图3-C)，说明MK-7支链结构和骨架结构的结合是发生在细胞膜上的。
MenH在MK-7合成的过程中起到提供甲基的作用，催化整个过程中的最后一步。根据生物信息学的预测，MenH并没有跨膜结构域，应该游离于整个细胞中。为了验证MenH在细胞中的定位，使用同样的方法构建重组质粒pHT01-Pveg-menH-eGFP。将重组质粒转化入B.subtilis 168中，然后将重组菌株接种于LB液体培养基中，37 ℃下220 r/min培养。结果显示过表达menH对细胞的生长没有明显的影响(图3-B)。培养12 h之后，在激光共聚焦荧光显微镜的下观察荧光的分布，根据荧光定位实验结果，MenH同样位于细胞膜上，但是有些荧光在细胞中呈现聚集分布。这一分布特点与MenA不同，MenA均匀的分布在细胞膜上，而MenH则是随机地在细胞中出现聚集(图3-C)。
A-过表达menA对菌株生长的影响；B-过表达menH对菌株生长的影响；C-关键基因在细胞中的荧光定位
图3 MenA与MenH在细胞中的定位
Fig.3 Localization of MenA and MenH in cells
2.3 不同浓度表面活性剂对MK-7合成的影响
表面活性剂Triton-100是一类非离子型表面活性剂，能够促进脂类物质的溶解，从而破坏细胞膜的结构。为了检测不同状态的细胞膜对MK-7合成的影响，我们在MK-7发酵培养基中加入不同浓度的表面活性剂Triton-100。由于加入不同浓度的表面活性剂之后，细胞的生长的受到不同程度的抑制，导致细胞的生长很难统一，所以只对最大生长OD600值进行统计。结果如图4-A所示，当加入表面活性剂时，细胞的生长和MK-7的合成均受到不同程度的抑制。当Triton-100体积分数为0.1%时，MK-7的产量受到明显的抑制，仅为野生型的36.9%。特别是当Triton-100的体积分数达到0.5%时，细胞的OD600值最高仅为5.6，且几乎检测不到MK-7的合成(图4-B)。当细胞膜的结构受到破坏时，对MenA和MenH的定位产生影响，从而影响到MK-7的合成。这些结果表明，完整的细胞膜结构是高效合成MK-7的前提条件。
A-不同浓度Triton-100对菌株生长的影响； B-不同浓度Triton-100对菌株合成MK-7的影响
图4 不同浓度表面活性剂对细胞生长和MK-7合成的影响
Fig.4 Effects of different concentrations of surfactants on cell growth and synthesis of MK-7
3 结论
MK-7作为脂溶性维生素K2的重要亚型，主要分布于细胞的细胞膜中，起到电子传递的作用[14]。然而，对于MK-7如何进入到细胞膜中并没有明确的报道。MenA可能在MK-7进入细胞膜的过程中起着关键作用，其作用是使胞内游离的DHNA与不同长度异戊二烯组成的侧链进行融合，形成2-脱甲基萘醌。MenA属于异戊二烯转移酶的UbiA家族(IPR000537)，包括了来源于细菌中的4-羟基苯甲酸酯八烯基转移酶(UbiA)[15]，酵母中的对羟基苯甲酸酯聚异戊二烯基转移酶(COQ2)[16]。根据已知晶体结构的UbiA家族的，通过同源比对发现包含两个富含天冬氨酸的保守催化位点，能够催化反式异戊二烯基转移酶的活性，分别是NDXXDXXXD和DXXXD。
生物信息学的预测结果显示MenA具有8个跨膜区，分布在细胞膜上。本研究将MenA与eGFP进行融合，通过荧光的位置确定MenA的分布。实验结果显示MenA位于细胞膜上，与生物信息学预测的结果一致。在E.coli中通过敲除回复突变实验，并通过收集细胞膜碎片，在细胞膜碎片中发现了MenA的活性，证实了MenA位于细胞膜内，并证明含有MenA的细胞能够在厌氧的环境中生长[17]。在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中，使用同位素1-3H标记的法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate, FPP)或者香叶基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate, GGPP)作为底物时，发现90%的MenA活力存在于富含细胞碎片的组分中，同样也证实了MenA位于细胞膜中[18]。在本研究中，通过在发酵培养基中加入表面活性剂破坏细胞膜的结构，发现MK-7的合成受到明显的抑制，说明细胞膜的存在对MK-7的合成具有重要作用。
MenH作为催化MK-7合成过程最后一步的关键酶，起到转移甲基的作用。在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)中，与甲萘醌合成相关的酶位于细胞内膜结构域上，包括甲基转移酶MenG和甲萘醌还原酶MenJ[19]。其中MenG的分布与MenA并不相同，MenA分布在常规质膜(包含膜磷脂与细胞壁)上。研究证明仅当存在额外拷贝的menG时，才能够在基因组上敲除menG，说明menG是耻垢分歧杆菌的必需基因[19]。在本研究中，我们依据生物信息学对MenH的结构进行了预测，发现MenH不具有跨膜结构域，但是荧光定位实验显示MenH同样位于细胞膜上。推测MenH可能是与枯草芽孢杆菌的膜蛋白互作，然后锚定在细胞膜上。本研究证明MenA 和MenH均位于细胞膜上，对MK-7在细胞膜中合成的过程中发挥作用，而且细胞膜的完整性对MK-7的合成具有重要作用。由于MenA和MenH在定位在细胞膜中方式不相同，MenH是如何与膜蛋白进行互作，以及哪种因素影响MenA和MenH在细胞膜中的定位是下一步的研究重点。
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