益生菌作为一种活性微生态制剂,对人类和动物的健康有着举足轻重的作用。益生菌不仅可以促进宿主肠道发育,提高消化能力和免疫力,还可以抑制有害菌生长,减少疾病的发生,在抗生素替代方面发挥着重要作用。
近年来,益生菌不仅被用于人类药品和保健品,还广泛用于动物养殖生产中。但是在益生菌生产及使用过程中,不可避免的要受到高温、脱水、氧化等不良环境的影响,导致细胞发生结构或生理性损伤,从而降低益生菌的活力,严重制约了益生菌产业的发展。为使益生菌更好的发挥益生作用,必须保证产品在一定期限内含有足够含量的活菌数,因此如何提高益生菌制剂稳定性和耐受性成为国内外研究的热点。在生产工艺方面包括开发新型包被技术、筛选适宜的保护剂配方、优化喷雾干燥参数等后处理加工方式;在提升菌株耐热能力方面,常用的方法有热胁迫、酸胁迫、缓冲盐胁迫、基因改造等。大量研究表明,微生物胁迫耐受性是受多种代谢途径调控的复杂的生理过程。本文综述了细胞膜结构、蛋白质结构、热应激蛋白、DNA/RNA稳定性、渗透保护剂和群体感应系统对菌体耐热能力的影响,旨在为益生菌耐热菌株的选育和应用提供参考。
1 益生菌的热损伤
细菌细胞天生就有多种防御机制,如辅助折叠错误蛋白质的伴侣蛋白、降解不可逆损伤蛋白质的蛋白酶、维持正确渗透压的转运系统,处理活性氧的催化酶和超氧化物歧化酶,以及对抗细胞内pH值下降的质子泵、脱羧酶和转运蛋白[1]。MOAYYEDI[2]在喷雾干燥鼠李糖杆菌ATCC 7469的过程中,关键细胞成分包括DNA、RNA、蛋白质、细胞膜和核糖体等,均受到了不同程度的热损伤。ANANTA等[3]以鼠李糖杆菌GG为对象,用流式细胞术得出热损伤的主要部位是细胞膜,因此细胞膜损伤是造成细胞死亡的主要因素之一。升温过快导致膜蛋白热变性、膜脂氧化等一系列损伤,是造成细胞膜通透性增加、生理功能丧失的主要原因。TEIXEIRA等[4]对保加利亚乳杆菌NCFB 1489的研究也表明随着温度升高,细胞膜脂肪酸先受热损伤,随后蛋白质聚集,细胞膜逐渐瓦解,核糖体和RNA也接连发生损伤。由于DNA合成过程的起始和延续需要DNA复合物附着在细胞膜上完成,因此细胞膜及其表面相关蛋白的变化也在一定程度上影响了DNA的调控过程[5]。大于80 ℃的高温环境足以使DNA双螺旋解链,稳定性下降,导致复制-转录-翻译过程出现紊乱,导致一系列生理活动出现异常。
2 益生菌的耐热机制研究进展
益生菌在胁迫条件下的适应行为与细胞的组成结构、生理代谢和调控过程都密切相关,主要包括细胞膜结构、蛋白质结构、热应激蛋白、遗传物质稳定性、有机渗透剂以及细胞的群体感应系统等[6]。
2.1 细胞膜结构对益生菌菌株耐热性能的影响
细胞膜是外界环境作用的首要靶点,细胞膜的主要成分包括磷脂(占20%～30%)和蛋白质(占50%～70%),不仅具有屏障和运输的作用,还是合成细胞壁、糖被和能量的重要基地。嗜热菌细胞膜上饱和脂肪酸占比很高,主要成分为甘油脂肪酰二酯形成的稳定的疏水基团[7]。长链不饱和脂肪酸[8]和饱和脂肪酸[9]相对含量的提高有助于减少细胞膜的高温损伤,因为较长的链可以进一步渗透到双分子层中,增加层与层之间的酰基链相互作用,降低膜流动性,促进结构更加坚固。而脂肪酸饱和度对双层结构的影响大于链长,在细菌中,饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比例是控制膜流动性的主要机制[10]。能够增加细胞膜中饱和脂肪酸的含量被认为是在各种胁迫环境下成功生长的最重要因素之一,这些都已经在嗜热链球菌[11]、乳酸乳球菌、屎肠球菌[12]、片球菌属[13]中得到验证。屎肠球菌HL17细胞暴露于52 ℃ 15 min,不饱和脂肪酸的比例略有下降,热适应后的HL17存活率比非适应菌耐H2O2(0.01%)、乙醇(20%)、酸(pH 3)、碱(pH 12)的存活率高103～105倍,耐60 ℃水浴的能力也显著提高。
近年来,随着现代生物学技术的发展,大量通过影响细胞膜合成和代谢来影响菌体耐热性的基因被发现。如通过提高乳酸乳球菌TOMSC161中环丙烷脂肪酸合成酶含量,可以提高环丙烷脂肪酸及其前体物质油酸的含量,进而降低细胞膜流动性,增强了菌体冷冻和干燥胁迫耐受性[14]。磷脂酰丝氨酸合酶可以提高菌株的辛酸和总脂肪酸产量,进而导致细胞膜完整性增加、细胞膜和疏水核心区厚度增加,进而增加了菌株的耐高温能力。同理,脂肪酸合成过程中关键基因[15](fabA、fabB、fabD、fabF)、关键酶(乙酰辅酶A羧化酶[16])的过表达均会增加菌体对外界胁迫的耐受性。
2.2 蛋白质结构对益生菌耐热性能的影响
蛋白质是最不稳定和最丰富的生物大分子物质,也有人提出细胞的热敏感度取决于蛋白质变性和蛋白质组功能的丧失[17]。JARZAB等[18]对原核生物蛋白质结构研究表明,蛋白质组成、序列和大小影响热稳定性,并且蛋白质的长度与其热稳定性存在负相关。嗜热菌蛋白质中的脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)的含量高于常温菌蛋白质,而半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)的含量显著低于常温菌蛋白[19]。LEUENBERGER等[20]研究也表明,蛋白质长度是蛋白质热稳定性的决定因素,并且稳定性高的蛋白质通常富含赖氨酸和β-sheet结构。因此,影响蛋白质稳定性的不仅仅是蛋白质结构,还有他们之间的相互作用。例如,嗜热微生物中的二硫键[21]、蛋白质盐桥数量[22]均对蛋白质稳定性起着关键的作用。同时,关键区域某个氨基酸改变也许会造成高级结构的改变,增加酶蛋白质结构中的疏水键、氢键或离子键,改变其热稳定性[23]。
2.3 热应激蛋白对益生菌菌株耐热性能的影响
热激蛋白又称热休克蛋白(heat shock protein,HSPs),是细胞在应激状态下重新合成或合成量增加的一类高度保守性蛋白[24]。热应激蛋白主要负责初期蛋白和受损蛋白的折叠、寡聚蛋白的合成或分解、跨膜运输、促进不稳定蛋白质的降解、减少其聚集。氯霉素(100 mg/mL)具有抑菌作用,可阻断蛋白质合成,可用于检查蛋白质合成是否是热应激所必须的,在应激过程中添加氯霉素,屎肠球菌没有表现出热适应反应,说明屎肠球菌的热适应是依赖于蛋白质合成的诱导[25]。嗜热菌富含热应激蛋白,如HSP70、HSP60、小分子热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)、前折叠素(prefoldin,PFD)、泛素等。
多种益生菌在经历亚致死胁迫处理后会产生数十种热应激蛋白(如DnaJ、DnaK、GroES、GrpE、GroEL等),糖酵解相关蛋白、ATP酶亚基等蛋白[26]和小的热休克蛋白(Hsp1和3)均呈上调趋势[27]。热激蛋白中分子伴侣体系GroES-GroEL和DnaK-GrpE-DnaJ对于修复高温损坏的蛋白质,并维持细胞在高温中的存活率起着至关重要的作用[28-29]。热应激蛋白GroESL由GroEL和辅因子GroES组成。将耐溶剂恶臭假单胞杆菌的GroESL基因导入大肠杆菌后会增强大肠杆菌的耐温能力[30]。DanK需要与辅分子伴侣DnaJ和核苷酸交换因子GropE共同完成菌体蛋白的折叠。研究表明,过表达或导入外源的DnaK(大肠杆菌)基因后,乳酸乳球菌NZ9000的耐高温能力均显著提高。同样的,将外源的DnaK导入大肠杆菌JM109、短小芽孢杆菌B3[31]、中链球菌NCDO2227[32]和枯草芽孢杆菌446[33]中,均显著的提高了菌株的耐热能力。热诱导的100 kDa蛋白可能与热休克蛋白100/Clp家族有关,该家族参与耐热性[34],染色体编码的CLpC、ClpP、ClpE类热休克蛋白参与单核细胞增生李斯特菌的毒性和应激耐受性[35],将ATP依赖蛋白酶(ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit,ClpL)基因导入天然热敏感的李斯特菌菌株,可显著提高耐热性。
生物体中含有很多小分子热应激蛋白,他们也能够阻止蛋白质的聚集,帮助折叠变性的蛋白。将长双歧杆菌 NCC2705中热应激蛋白Hsp20过表达可以提高菌株的耐盐和耐高温性能[36]。小分子热激蛋白(CEHSP7)能够维持高温下细胞外膜的稳定性,将其导入大肠杆菌BW25113中后菌株可在50 ℃下生长[37]。热激蛋白TTE2469(编码泛素)、IbpA(Hsp20家族)和GroS2(Hsp10家族)在维持细胞壁完整性、海藻糖的积累和产生能量上起到一定的作用,将其导入酿酒酵母后可以提高菌株对发酵温度的耐受范围(28～35 ℃)[38]。
2.4 DNA/RNA稳定性对益生菌菌株耐热性能的影响
高温会引起核苷酸链断裂或阻碍DNA、RNA修复,破坏基因组的完整性。DNA的重组和修复蛋白RecA可与单链DNA结合,诱导包括自身在内的多个DNA修复基因的表达,被认为是与DNA损伤修复相关的重要蛋白质。大多数嗜热微生物耐温能力与(G+C)%之间存在正相关关系,栖热嗜热菌(G+C)%含量高达55.2%,有利于在高温下存活[39]。在高温的刺激下,菌体内会产生反解旋酶结合在DNA链上,防止超螺旋结构解链,维持遗传物质稳定性[40]。在热激蛋白mRNA的非编码区,形成一个颈环结构,将核糖体结合位点(ribosomal binding site,RBS)和起始密码子“保护起来”,我们称之为RNA温度计[41]。当环境温度较高时,RNA温度计中氢键结构被破坏,颈环结构被打开,暴露出RBS和起始密码子,热激蛋白大量表达,发挥特殊的耐热生理功能。“DNA/RNA解旋酶”的基因与一个死盒RNA解旋酶相关,属于SNF2亚家族。死亡盒蛋白是与核糖核酸代谢和细胞过程相关的保守核糖核酸解旋酶[42]。最近的研究表明,死盒RNA解旋酶与多重胁迫抗性有关,包括单核细胞增生李斯特菌F2365对低温的抗性[43],以及蜡状芽孢杆菌 ATCC 14579对碱和热胁迫的抗性[44]。
2.5 有机渗透保护剂对益生菌菌株耐热性能的影响
有机渗透保护剂在真核生物和细菌中广泛存在,属于一种非离子、高水溶性分子,包括糖、多元醇、氨基酸及其衍生物。他们可以从头合成或者从周围环境中吸收并累计,不会干扰代谢。他们的主要作用包括:a)稳定膜和DNA完整性;b)提高细菌的耐热、酸碱胁迫和渗透胁迫能力;c)提高抗氧化应激能力。
极端环境微生物含有的一种极端环境渗透调节物—四氢嘧啶,具有稳定蛋白质、核酸和生物膜的功能,渗透调节能力要更强于其他渗透调节物,如海藻糖、蔗糖和甘氨酸甜菜碱。当细胞需要调节胞内渗透压力时,优先选择积累甘氨酸甜菜碱及它的供体脯氨酸、甜菜碱或者胆碱,其次才会积累谷氨酸和海藻糖调节渗透压。而海藻糖相较于其他糖类更能保护生物分子和膜的稳定性和渗透调节性[45],而且在细胞层面,海藻糖在耐热方面的研究最多。
在高温胁迫下,酵母菌体内累积海藻糖比产生热休克蛋白更加重要[46]。海藻糖合成基因otsB、otsA和treS过表达,均能提高简单节杆菌 CPCC 140451的耐受性,并且otsB的效果最好[47]。敲除李斯特氏菌中的海藻糖降解基因TreA以后,菌体对热的耐受性也会得到提高。研究表明,将编码甘氨酸甜菜碱合成的两种酶胆碱单加氧酶和甜菜碱醛脱氢酶的基因导入毕赤酵母菌株,提高了该菌株耐甲醇和高温胁迫能力[48]。
2.6 群体感应系统对益生菌菌株耐热性能的影响
群体感应(quorum sensing,QS)指细菌在增殖过程中,随着菌体密度的增加,不断向周围环境分泌特定的信号分子,即自诱导肽(autoinducer peptide,AIP)。群体感应系统可以增加生物膜的形成,促进细菌素的分泌,提升菌体抗胁迫能力。生物膜是由细菌胞体、胞外基质和其他颗粒物的混合物所组成的膜系统,生物膜含量的提高有助于乳酸菌耐热性的提高[49]。胞外多糖被证明是高度热敏感物质,在经历较高温度后将很大程度被破坏,因此其提供的物理性保护作用非常微弱[50]。脂磷壁酸与细菌细胞壁上的耐热蛋白互相黏连,并且延伸于胞壁之外,说明脂磷壁酸可以在一定程度上稳定耐热蛋白,有利于保持菌株耐热性[51]。
在革兰氏阳性细菌中存在2种群体感应系统,一种是依赖于寡肽信号分子AgrD的群体感应系统,另一种是LuxS/AI-2(autoinducer 2,AI-2)系统。当AIP在胞外达到一定的阈值时,胞体通过群体感应系统感受到自身的细胞密度,启动相应基因的表达。AIP分子在胞内以前体肽形式合成,经过翻译加工修饰成成熟的AgrD,这类分子需要位于细胞外膜上特定的ABC转运系统(ATP binding cassette)或其他外膜通道蛋白才能运输到胞外。当胞外AIP分子达到浓度阈值时,阈值AIP激活AgrC(受体蛋白)结合成熟AIP,通过组氨酸激酶和应答调节蛋白构成的双组份传导,实现对下游基因的调控(图1)。当外部条件,如温度、氧气和营养条件发生变化时,群体感应基因luxS和信号分子AI-2的合成被上调,导致显著的生物膜积累。LEBEER等[52]添加了生物膜抑制剂D-半乳糖到植物乳杆菌GG的培养基中发现,luxs和cysE(丝氨酸乙酰转移酶)的表达被抑制,并减少了细胞外基质中的脂蛋白合成,导致生物膜基质的淀粉样变性、生物膜形成的减少和菌株对不利环境的抗性减弱。
图1 革兰氏阳性菌QS系统模式图
Fig.1 QS system pattern of Gram-positive bacteria
革兰氏阴性菌的群体感应系统主要是由[N-3-(oxohexanoyl)homoserinelacton, AHL]类信号分子及其受体蛋白组成,所有以酰基高丝氨酸内脂类化合物AHL为信号分子的细菌均利用Luxl/LuxR的蛋白系统进行调控。AHL类信号分子包含一个高丝氨酸内脂环和一个酰胺链(图2)。在大肠杆菌中发现5个质粒的存在可以增加生物膜的产生,包括一个含有几个抗微生物耐药性基因(anti-microbial resistance, AMR),一个重金属抗性操纵子,一个消毒剂抗性基因、一个β-内酰胺酶基因(TEM-1)和mrkABCDF操纵子;含mrk的质粒和K-12MG1655的结合导致更多生物膜的产生。另有研究表明,CysE基因的上调主要促进小分子的代谢、有机化合物的生物合成、α-氨基酸的生物合成、细胞的生物合成和细胞组成的变化,从而有利于生物膜的形成[53]。
图2 革兰氏阴性菌QS系统模式图
Fig.2 Gram negative bacteria QS system pattern diagram
3 提高益生菌菌株耐热性常用的手段
强健的耐热菌株在高温下具有维持其细胞大小的能力[54]。为了提高菌株耐热性能,常用的方法有热胁迫、酸胁迫、缓冲盐胁迫、辐照诱变及基因改造等。适宜的热应激处理促使菌株产生应激反应,提高菌株在高温中的耐受性,应激温度一般高于最适生长温度5～10 ℃[55]。研究发现,将副干酪乳杆菌在52 ℃中保持15 min后,菌体细胞在60 ℃中耐热存活率可以提升300～700倍,喷雾干燥存活率提升了18倍。Min用连续热驯化的方式驯化屎肠球菌和嗜热链球菌,菌株的耐热能力提高了20%。热胁迫允许细胞表达应激反应蛋白,这样细胞就可以准备其系统来管理更严重的应激。酸处理可提高乳酸乳杆菌NCDO 712的耐热、耐乙醇、耐H2O2(1.15 mmol/L)、耐NaCl(200 g/L)性能,而只有热应激能提高其耐酸性[56]。然而,也有一些报道表明,除热胁迫外,其他胁迫处理也可以提升益生菌的耐热性能。ARDANARESWARI等[57]的研究表明,热适应和酸碱度联合预处理副干酪乳杆菌 SNP2后,触发了该菌株应激反应蛋白DnaK、DnaJ、GroES、GroEL和GrpE的更高转录水平,与单独应激相比联合胁迫处理表现出最佳的抗热能力。HUANG等[58]研究表明,弗罗伊德雷契丙酸杆菌ITG P20在高浓度高渗培养基中通过渗透胁迫使得相容性溶质在细胞内积累,从而提高了菌株的多种抗性,包括耐热性。刘珊珊[59]对酵母菌株AY12进行等离子诱变后再进行41 ℃及42 ℃高温连续驯化,使其56 ℃处理3 min存活率提升了84.68%。鲁明波等[60]用紫外线诱变鼠李糖乳杆菌获得了9株耐高温菌株,产酸能力也提高了18.1 g/L。胁迫应激和辐照诱变的方法虽然对菌株耐高温能力具有提升作用,但是存在工作量大、周期长、定向性差等缺点。而利用现代分子生物学技术,通过对菌株进行基因改造获得优良特性的手段更为直接和高效。如通过构建磷脂酰丝氨酸合酶和顺反异构酶(cis/trans isomerase,Cti)过表达工程菌株,可以提高大肠杆菌的耐高温能力[61]。通过构建DnaK过表达的乳酸乳球菌NZ9000,耐高温能力显著提升[62]。
4 展望
近年来随着科学技术的快速发展,人们对益生菌的耐热性能的研究越来越深入。虽然已经有了大量文献证明基因改造手段可以提高菌体耐热性能,但是在非模式菌株中研究较少,在工业生产应用中也鲜有报道。其主要原因可能为目前缺乏针对包括益生菌在内的非模式微生物菌种的基因操作系统,而且利用分子生物学手段对益生菌改造后可能会涉及到转基因菌株安全性的评估,发酵特性和益生特性的变化,这些因素势必影响到转基因益生菌的产业化应用,需要相关领域学者进行更加系统和深入的研究。
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