过氧化物还原酶6对宰后初期牛肉颜色和嫩度的影响及机制研究

颜色和嫩度是牛肉品质的关键指标,是影响消费者购买欲望的重要因素。动物屠宰放血后,由于缺氧、缺血的内源环境变化导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)在胴体内积累,通过促进蛋白质和脂质的氧化影响肉色和嫩度。为了维持ROS的动态平衡,细胞乃至整个机体进化出了完整的抗氧化系统(酶类抗氧化系统、非酶类抗氧化系统),能够有效地调节体内ROS的产生和清除,维持氧化还原平衡[1]。

过氧化物还原酶6(peroxiredoxin 6,Prdx6)属于过氧化物酶家族,能够保护细胞免受氧化应激的损伤[2]。Prdx6具有3种酶活性:非硒依赖谷胱甘肽过氧化物酶活性(non-selenium glutathione peroxidase,NSGPx)、磷脂酶A2活性和溶血磷脂酰转移酶活性。研究表明,Prdx6的过表达可以保护小鼠免受氧化应激的损伤以及保护细胞免受磷脂过氧化物介导的膜损伤[3];敲除Prdx6基因的小鼠对体内外的氧化应激都很敏感[4]。因此,Prdx6在维持氧化还原稳态方面发挥重要作用。动物宰后肉的品质与机体内的氧化还原稳态密切相关,而Prdx6作为一种关键的抗氧化酶,在宰后肌肉向食用肉转变的过程中,对肉品质的形成具有重要的影响。

前期研究发现,Prdx6在肉色稳定的牛排中表达量更高[5],且与a*值呈正相关关系[6]。此外,GAGAOUA等[7]还发现,在嫩度不同的牛肉之间,Prdx6的表达量有显著差异,且Prdx6的表达与μ-钙蛋白酶呈显著的正相关关系,而已知μ-钙蛋白酶可以通过降解细胞骨架蛋白促进肉的嫩化。但目前的研究对Prdx6在肉嫩化中的作用并不一致,另有研究发现背最长肌与半膜肌中Prdx6的表达量与嫩度呈负相关关系,当Prdx6表达量过低时,会促进细胞凋亡和蛋白质降解的发生,从而对嫩度产生积极影响[8]。

诸多研究利用蛋白质组学技术鉴定出Prdx6可能是影响牛肉品质的关键蛋白,但其NSGPx活性在宰后牛肉品质形成中的具体作用尚未阐明。因此,本实验采用巯基琥珀酸(mercaptosuccinic acid,MA)处理牛背最长肌以抑制Prdx6的NSGPx活性,探究其NSGPx活性在宰后牛肉品质形成过程中的作用;借助蛋白质组学技术进一步探究其调控牛肉品质的关键蛋白及相关通路,以便完善Prdx6在宰后牛肉品质形成中的作用及机制,为调控牛肉品质奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

本实验随机选取6头饲养方式、生长环境、胴体重量相似的西门塔尔杂交阉割公牛(山东菏泽曹县商都恒昌清真肉类有限公司,20月龄,胴体重约为360 kg)作为实验样本,且肉牛宰后24 h的极限pH值均在5.4～5.8。

MA,Sigma-Aldrich;生理盐水,辰欣药业股份有限公司;总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0058)、谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0056),上海碧云天生物技术有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒,江苏康为世纪生物科技有限公司。

HH-4型数显恒温水浴锅,常州国华电器有限公司;TA-XT2i型质构仪,英国Stable Micro System公司;SP62型便携式色差计,爱色丽仪器有限公司;BioTek Epoch2型酶标仪,美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

肉牛经商业流程屠宰后,在放血30 min内取左半胴体背最长肌,将牛的第12～13肋骨间肉样迅速切分为2.54 cm厚的牛排(用于肉色和剪切力指标的测定)和1 cm×1 cm×0.5 cm大小均匀的肉块,并将30 g肉样立即浸入液氮冷冻作为0 h样本。剩余肉样随机分为2组,按照肉液比1∶1(g∶mL),分别浸泡在10 mmol/L MA(抑制Prdx6的非硒依赖谷胱甘肽过氧化物酶活性组)和0.9%生理盐水(对照组)中,在16 ℃下孵育至6 h后(避免冷收缩),继续在4 ℃孵育至12、24、72、168 h。在相应时间点测定肉色及剪切力指标,并在每个时间点留取肉样在液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱保存,用于后续指标的测定。

1.2.2 Prdx6的NSGPx活性的测定

NSGPx活性的测定采用碧云天公司的总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0058)和硒依赖谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0056)进行测定。使用预冷的生理盐水漂洗组织样品,防止血液对测定结果的影响。称取80 mg肉样置于0.8 mL样品匀浆液中冷冻研磨3次(4 ℃,45 Hz,每次45 s),后于4 ℃下12 000 × g离心10 min,取上清液并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。根据试剂盒配制工作液(含3.125 mmol/L NADPH和3.75 mmol/L谷胱甘肽)和30 mmol/L的过氧化物试剂。取50 μL上清液和40 μL工作液混匀,室温下孵育15 min后加入10 μL的过氧化物试剂,立即于340 nm处测定吸光值,此时为0 min吸光值。将样品在25 ℃下孵育,每隔1 min测定一次吸光值,共测定6 min。NSGPx活性=总谷胱甘肽过氧化物酶活性-硒依赖谷胱甘肽过氧化物酶活性。

1.2.3 肉色指标测定

在贮藏的第12、24、72、168 h,打开包装后去除表面残留液体,并使用便携式色差计避开表面筋腱及脂肪测定牛排表面的CIE L*(亮度值)、a*(红度值)、b*(黄度值),每块牛排测定6次,取其平均值。

1.2.4 剪切力的测定

将宰后0、24、72、168 h的牛排样品置于真空包装袋中,于80 ℃水浴条件下加热至中心温度达到70 ℃,样品冷却至室温后放置于0～4 ℃过夜。用空心取样器(直径为1.27 cm)沿肌纤维方向取肉柱(避开脂肪和筋腱),使用TA-XT2i型质构仪的HDP/BSW探头进行测定。牛排的剪切力值(N)为该牛排各个肉柱测定结果的平均值。

1.2.5 蛋白质组学分析

1.2.5.1 蛋白质提取和肽段酶解

采用SDT裂解法裂解肌肉样品并提取蛋白质,使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质含量。采用Filter aided sample preparation(FASP)法取200 μg蛋白质样品加入30 μL SDT缓冲液[4% SDS,150 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L dithiothreitol(DTT),pH 8.0]进行裂解,使用尿素缓冲液(8 mol/L尿素,150 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)重复超滤去除洗涤剂、DTT和其他低分子质量组分后,加入100 μL 100 mmol/L碘乙酰胺溶液,避光孵育30 min。使用100 μL 尿素缓冲液洗涤3次,再用100 μL 25 mmol/L NH4HCO3缓冲液洗涤2次后,蛋白悬液用4 μg胰蛋白酶在40 μL NH4HCO3缓冲液中消化,37 ℃过夜酶解,收集肽段滤液。采用C18 Cartridges对样品肽段滤液脱盐冻干,并取40 μL甲酸溶液以复溶冻干的肽段样品。用紫外光谱密度在280 nm处按照氨基酸(色氨酸和酪氨酸)出现频率对蛋白质肽含量进行定量计算。

1.2.5.2 TMT标记及RP分级

各个样品分别取100 μg肽段,按照Thermo公司TMT标记试剂盒说明书进行标记。标记好的肽段等量混合,通过高pH反向肽分级试剂盒(High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit)进行分级。采用0.1%(质量分数)三氟乙酸酸化,并将混合的标记肽段样品加载到高pH值的反相分馏旋转柱中,低速离心水洗并进行脱盐处理。采用浓度梯度依次增加高pH洗脱溶液中乙腈浓度,对柱结合的肽段洗脱成10个不同的馏分,离心收集。收集的组分真空干燥后用12 μL 0.1%三氟乙酸复溶冻干样品,在280 nm处测定肽段浓度。

1.2.5.3 LC-MS/MS数据采集

每份样品采用nL流速的HPLC液相系统Easy nLC进行分离。色谱柱以95%的缓冲液A(0.1%甲酸水溶液)平衡,样品由自动进样器到上样柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100 μm×2 cm,nanoViper C18),经过分析柱(Thermo scientific EASY column,长10 cm,内径75 μm,树脂3 μm,C18-A2)以缓冲液B(84%乙腈-0.1%甲酸)进行线性梯度分离,流速为300 nL/min。

样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。检测方式为正离子,母离子扫描范围300～1 800 m/z,一级质谱分辨率为70 000(200 m/z),automatic gain control(AGC)target为1e6,Maximum IT为50 ms,动态排除时间为60.0 s。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫描后采集20个碎片图谱(MS2 scan),MS2 Activation Type为HCD,Isolation window为2 m/z,二级质谱分辨率17 500 (200 m/z),Normalized Collision Energy为30 eV,Underfill为0.1%。

1.2.5.4 蛋白质鉴定和定量分析

质谱分析原始数据采用软件Proteome Discoverer 1.4和MASCOT(Matrix Science, London, UK;version 2.2)进行查库鉴定及定量分析,序列数据库为uniprot_Bos_taurus.fasta。

1.3 数据处理

使用SAS 9.0软件中的混合模型对数据进行分析,使用Origin 2018软件进行绘图。在鉴定出的所有蛋白质中,以差异倍数(fold change,FC)绝对值>1.2,P<0.05为标准筛选差异蛋白质。使用KAAS(KEGG Automatic Annotation Server)软件对目标蛋白质集合进行KEGG通路注释。

2 结果分析

2.1 MA处理对宰后牛肉成熟过程中Prdx6的NSGPx活性的影响

如图1所示,MA处理组中NSGPx的活性随成熟时间的延长而持续降低,且在成熟时间内显著低于对照组(P<0.05),表明MA处理显著抑制了Prdx6的NSGPx活性。王路鹿[9]研究表明,MA可以使Prdx6的半胱氨酸残基高度硫醇化从而抑制其NSGPx活性,同时其磷脂酶A2活性不受影响。对照组中NSGPx的活性在成熟期间呈现先下降后上升再下降的趋势,在宰后24 h达到最大值,这可能是宰后前24 h,机体自适应的提高其NSGPx活性以对抗氧化应激,维持宰后初期的氧化还原平衡。宰后成熟24 h后,其NSGPx活性不断降低。O’FLAHERTY等[10]的研究解释了这一变化,研究表明氧化应激可以使Prdx6的半胱氨酸残基高度硫醇化,从而降低Prdx6的NSGPx活性。

2.2 MA处理对宰后牛肉成熟过程中肉色的影响

由表1可知,处理方式与成熟时间对L*值无交互作用(P>0.05),但处理方式与成熟时间的主效应分别影响显著(P<0.05)。在整个成熟期间,2组牛肉的L*值均呈现上升趋势。先前的研究表明,随成熟时间的延长,牛肉中蛋白质降解程度增加,弱化了蛋白质结构,导致光折射增加,进而表现为较高的L*值[11]。MA组的L*值显著高于对照组(P<0.05),这可能是由于MA处理后,氧化应激的程度增加导致蛋白质降解增多所致。

a*值表示肉样的红度值,相较于L*值和b*值,a*值通常是反映肉色最重要的指标,a*值越大表示肉色越鲜红。由表1可知,处理方式与成熟时间对a*值的影响无交互作用(P>0.05),但处理方式与成熟时间的主效应分别影响显著(P<0.05)。随成熟时间的延长,2组牛肉的a*值均呈现下降趋势,这可能是由于成熟过程中生成了较多的高铁肌红蛋白,使肉色劣变。此外,宰后牛肉线粒体活性的降低导致高铁肌红蛋白还原能力降低也会造成肉色劣变。MA组的a*值显著低于对照组(P<0.05),在宰后成熟第72 h和第168 h,MA组的a*值分别是对照组的71.02%和57.39%,说明MA处理抑制NSGPx活性后,加快了宰后成熟过程中a*值的降低。黄琳琳[12]研究发现,抑制NSGPx活性可以加速蛋白质氧化、细胞凋亡等过程,而蛋白质氧化会对肉色产生不利影响,且孙志昶等[13]的研究也表明细胞凋亡率与a*值呈负相关关系,这与本研究的结果一致。

处理方式与成熟时间的交互作用对b*值有显著影响(P<0.05)。在宰后成熟的72 h内,2组的b*值均无显著变化(P>0.05),72至168 h时显著增大(P<0.05),且在168 h时MA组的b*值显著高于对照组(P<0.05)。这与VERGARA等[14]的b*值随成熟时间的延长而增加的研究结果一致,这可能与高铁肌红蛋白的形成有关。

2.3 MA处理对宰后牛肉成熟过程中剪切力的影响

剪切力是衡量牛肉嫩度的重要指标。如图2所示,MA处理组的牛肉剪切力值持续下降,而对照组的剪切力值呈先升高后下降的趋势,且在宰后成熟第24 h和72 h,MA处理组的剪切力值均显著低于对照组(P<0.05),分别为对照组的78.88%、76.55%,表明MA处理加快了宰后牛肉成熟过程中的嫩化速度。

2.4 MA处理后的蛋白质组学变化

表2列出了MA组和对照组宰后24 h样品的主要差异蛋白,通过分析,这些差异蛋白共富集到39条KEGG通路中,由图3可以看出,大部分差异蛋白参与了细胞生长和死亡、信号转导、碳水化合物代谢以及能量代谢等通路。这些富集结果表明抑制Prdx6的NSGPx活性会影响细胞凋亡、细胞信号转导和机体的代谢循环等过程。

为了进一步确定抑制Prdx6的NSGPx活性对宰后牛肉品质的影响,我们对主要的差异表达蛋白进行了分析。这些差异表达蛋白按照功能主要分为结构蛋白、代谢酶类、呼吸电子传递链相关蛋白、热休克蛋白、细胞凋亡相关蛋白等,其具体信息如表2所示。

2.4.1 结构蛋白的变化

在差异表达蛋白中,结构蛋白所占比例最高。其中肌球蛋白轻链6(myosin light chain 6,MYL6)、肌球蛋白-2(myosin-2,MYH2)、肌钙蛋白-T(troponin T, fast skeletal muscle,TNNT3)、α-辅肌动蛋白1(α-actinin-1,ACTN1)以及伴肌动蛋白(nebulin,NEB)等结构蛋白与肉的嫩度密切相关。本研究结果显示在MA处理组中这些蛋白表达量均显著下调,表明MA处理加剧了肌球蛋白、肌钙蛋白以及肌动蛋白的降解,破坏了肌原纤维的完整性,加速了牛肉嫩化。

肌球蛋白结合蛋白H(myosin binding protein H,MYBPH)是脊椎动物骨骼肌重要的肌原纤维蛋白成分,其功能是调节肌球蛋白和肌动蛋白间的相互作用。研究表明MYBPH可以被内源性蛋白酶(如μ-钙蛋白酶)降解,引起肌肉超微结构变化,不仅影响肉的嫩度,还会通过光散射的作用影响肉色[9]。本研究中,与对照组相比,MA处理组的MYBPH表达量显著上调,这可能是由于Prdx6的NSGPx活性被抑制后,ROS含量升高,加剧内源性蛋白酶(如μ-钙蛋白酶)氧化失活,从而使MYBPH降解量减少。且该组的剪切力值低于对照组,这与GUILLEMIN等[8]研究发现MYBPH在嫩度较好的肌肉类型中表达量更高的结果一致。

肌球蛋白轻链3(myosin light chain 3,MYL3)是一种结构蛋白,参与肌肉的生长发育等过程。L width=11,height=17,dpi=110

PEZ-PEDROUSO 等[15]发现,在嫩度较差的鹿肉中MYL3表达量更高,且MYL3与剪切力呈显著正相关关系。KONING等[16]研究发现,缺氧条件下会导致MYL3表达量上调。本研究发现,在MA处理组中MYL3表达量显著上调,这可能与MA组受到更大的氧化应激有关。

胶原蛋白α-1(I)链(Collagen alpha-1(I) chain,COL1A1)和胶原蛋白α-2(I)链(Collagen alpha-2(I) chain,COL1A2)均属于胶原蛋白家族成员。本研究结果显示,COL1A1和COL1A2被显著富集到细胞外基质(extracellular matrix,ECM)-受体相互作用通路。ZHAO等[17]研究发现,敲除COL1A1后,抗凋亡相关因子BCL-2显著下调,促凋亡相关因子Bax显著上调,凋亡程度显著增加。FU等[18]等抑制牛卵丘细胞中COL1A1的表达后,发现细胞内ROS含量增加,凋亡级联反应被激活,这表明COL1A1可能是重要的抗凋亡因子。本研究MA处理组中COL1A1的高表达量,可能是由于氧化应激环境促进了凋亡的发生,机体自适应提高COL1A1的表达量以对抗凋亡。此外,氧化应激条件下缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)过表达,刺激COL1A2的激活,这也与本研究中MA组COL1A2表达量上调的结果一致。研究结果表明,抑制Prdx6的NSGPx活性促进了胶原蛋白的降解,破坏了细胞结构的完整性,使牛肉嫩度提高。

肌原纤维蛋白表达量的显著变化表明Prdx6的NSGPx活性对细胞结构完整性以及肌肉收缩能力有较大的影响,可能通过该途径进一步影响宰后牛肉的嫩度。

2.4.2 代谢酶类的变化

在鉴定出的代谢酶中,2-氧代异戊酸脱氢酶β亚基(2-oxoisovalerate dehydrogenase subunit beta, mitochondrial,BCKDHB)和丙酮酸脱氢酶E1组分α亚基(Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha,PDHA2)等蛋白显著富集在碳水化合物代谢通路。其中丙酮酸脱氢酶参与糖酵解过程,催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH),生成的NADH可以参与高铁肌红蛋白的还原,有助于维持肉色及其稳定性。本研究中发现,MA处理组PDHA2表达量下调,可能是其肉色较差的原因。JOSEPH等[19]在不同肌肉类型的差异蛋白研究中发现丙酮酸脱氢酶与a*值呈正相关关系,与本研究结果一致。

酰基辅酶A氧化酶(Acyl-coenzyme A oxidase,ACOXL)是过氧化物酶体中脂肪酸β氧化的关键酶,作为脂质代谢中的重要调节剂,可以引发长链脂肪酸的氧化代谢,最终被氧化为乙酰辅酶A,生成的乙酰辅酶A参与三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环[20]。在敲除ACOXL基因的小鼠中发现H2O2水平显著升高,此外,KONG等[21]研究发现采用棕榈酸酯诱导ROS水平升高后,ACOXL表达量显著升高。因此ACOXL不仅可以维持脂质稳态,参与TCA循环,还在调节ROS代谢方面发挥重要作用。本研究MA处理组中,ACOXL表达量显著上调,表明抑制了Prdx6的NSGPx活性促进了ACOXL的表达,且高表达的ACOXL很可能通过促进脂质代谢以及TCA循环等过程参与了肉色及其稳定性的形成。

2-磷酸-D-甘油酸水解酶(2-phospho-D-glycerate hydro-lyase,ENO2)是一种参与糖酵解中间步骤的烯醇化酶,催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。ENO2具有与氧化应激和热休克蛋白相关的功能,可以和HSP70相互作用以保护细胞免受氧化应激的损伤[22]。JOVÉ等[23]研究表明,ENO2是脂肪氧化受损后的关键靶标。本研究检测到抑制Prdx6的NSGPx活性后,ENO2表达量下调,推测可能是MA组受到氧化应激,发生脂肪氧化导致的。而ENO2的下调会进一步阻碍糖酵解进程,减少了中间代谢物的产生和积累,进而影响了肉色及其稳定性。此外,JOSEPH等[19]研究也表明烯醇化酶因其在糖酵解代谢中的作用,可以使肉色稳定性得到改善。

以上代谢酶均是参与糖酵解和代谢循环的重要酶类,影响NADH的生成并进一步影响宰后肉中高铁肌红蛋白的还原。在宰后初期表达量的改变表明Prdx6的NSGPx活性与能量代谢存在潜在关联,且可能通过影响代谢途径进一步影响牛肉的肉色及其稳定性。

2.4.3 细胞凋亡相关蛋白的变化

在差异表达蛋白中,细胞色素c和组蛋白H2A被显著富集到细胞生长和死亡通路。

细胞色素c是线粒体电子传递链的主要电子载体,可以将细胞色素还原酶血红素基团上的电子转移到细胞色素氧化酶复合体上,参与线粒体介导的高铁肌红蛋白还原。此外,作为重要的凋亡相关因子,它可以通过激活Bax等促凋亡因子引发凋亡级联反应,加速凋亡进程。与对照组相比,MA处理组细胞色素c水平显著下调,这可能通过阻碍线粒体电子传递链的进程,抑制高铁肌红蛋白的还原,导致该组肉色及其稳定性降低。

组蛋白H2A(histone H2A,H2AFX)是组蛋白核心的重要组成部分,容易受到氧化损伤,与坏死性凋亡密切相关。研究表明,过量的ROS会导致组蛋白H2A泛素化,更易受到由蛋白酶体所介导的降解,最终导致细胞炎症和凋亡的发生[24]。本研究发现MA处理组H2AFX水平显著下调,这可能是由于抑制Prdx6的NSGPx活性后,过量的ROS持续积累导致的。

凋亡相关蛋白表达量的变化进一步表明Prdx6的NSGPx活性可能通过影响凋亡途径影响牛肉的品质。

2.4.4 呼吸电子传递链相关蛋白的变化

细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)是线粒体呼吸电子传递链的末端蛋白质复合物Ⅳ,将电子从细胞色素c转移到氧分子,再将分子氧还原成水,参与线粒体电子传递过程以及ROS的生成,在能量代谢中发挥重要作用。细胞色素c氧化酶亚基7A1(cytochrome c oxidase subunit 7A1, mitochondrial,COX7A1)是其中的一个同工酶亚基,可以调控COX在线粒体内膜中的装配过程并调控COX的活性。MISHRA等[25]研究认为COX7A1的过表达会促进细胞凋亡的发生。本研究MA组中COX7A1表达量显著上调,表明抑制Prdx6的NSGPx活性可以通过调节线粒体呼吸电子传递链途径影响牛肉品质。

2.4.5 热休克蛋白的变化

热休克蛋白β-8(heat shock protein bate-8,HSPB8)是一种在缺血缺氧条件下表达量上调的应激蛋白,防止细胞受到氧化或凋亡损伤。HSPB8过表达后会增加线粒体产生NO的能力,而NO可以减少宰后线粒体的O2消耗和ROS的产生从而为应激的细胞提供保护,因此通常将HSPB8作为缺血缺氧后保护线粒体功能的潜在指标。本研究抑制Prdx6的NSGPx活性后HSPB8表达量的上调,可能反应了宰后初期肌细胞对抗氧化应激所产生的自我防御能力。

3 结论

Prdx6作为动物体内关键的抗氧化防御酶,面对宰后初期缺氧缺血的应激环境时,机体在短时间内自适应提高其NSGPx活性来抵御氧化应激。本研究中,MA处理显著抑制了Prdx6的NSGPx活性,且抑制其NSGPx活性后肉色及其稳定性显著降低,嫩度显著提高,表明Prdx6的NSGPx活性会延缓宰后牛肉肉色的劣变,但对牛肉的嫩化产生不利影响。采用差异蛋白质组学分析发现,差异表达蛋白主要为结构蛋白、代谢酶类、呼吸电子传递链相关蛋白、热休克蛋白、细胞凋亡相关蛋白等。其中在MA组中肌球蛋白轻链6、肌球蛋白-2、肌钙蛋白-T、α-辅肌动蛋白1以及伴肌动蛋白等结构蛋白表达量显著下调,表明抑制Prdx6的NSGPx活性可能加剧肌球蛋白、肌钙蛋白以及肌动蛋白的降解,加速牛肉嫩化;2-氧代异戊酸脱氢酶亚基β、酰基辅酶A氧化酶和2-磷酸-D-甘油酸水解酶等代谢酶表达量的变化表明:抑制Prdx6的NSGPx活性影响了糖酵解和TCA循环等代谢过程,并进一步影响牛肉的肉色及其稳定性。此外,组蛋白H2A(H2AFX)和细胞色素c氧化酶亚基7A1(COX7A1)等蛋白质表达量的差异表明抑制Prdx6的NSGPx活性还影响了细胞凋亡和呼吸电子传递链等过程,并可能是影响牛肉品质的潜在因子。综上所述,Prdx6的NSGPx活性影响了宰后牛肉的品质,其具体作用机制值得进一步探究。

[1] ZHANG L T, LI Q, JIA S L, et al.Effect of different stunning methods on antioxidant status, in vivo myofibrillar protein oxidation, and the susceptibility to oxidation of silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) fillets during 72 h postmortem[J].Food Chemistry, 2018, 246:121-128.

[2] JIA X, VEISETH-KENT E, GROVE H, et al.Peroxiredoxin-6:A potential protein marker for meat tenderness in bovine longissimus thoracis muscle[J].Journal of Animal Science, 2009, 87(7):2391-2399.

[3] WANG Y, MANEVICH Y, FEINSTEIN S I, et al.Adenovirus-mediated transfer of the 1-cys peroxiredoxin gene to mouse lung protects against hyperoxic injury[J].American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, 2004, 286(6):L1188-L1193.

[4] WANG X S, PHELAN S A, FORSMAN-SEMB K, et al.Mice with targeted mutation of peroxiredoxin 6 develop normally but are susceptible to oxidative stress[J].Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(27):25179-25190.

[5] YANG X Y, WU S, HOPKINS D L, et al.Proteomic analysis to investigate color changes of chilled beef longissimus steaks held under carbon monoxide and high oxygen packaging[J].Meat Science, 2018, 142:23-31.

[6] GAGAOUA M, CLAUDIA TERLOUW E M, MICOL D, et al.Understanding early post-mortem biochemical processes underlying meat color and pH decline in the longissimus thoracis muscle of young blond d’Aquitaine bulls using protein biomarkers[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(30):6799-6809.

[7] GAGAOUA M, CLAUDIA TERLOUW E M, BOUDJELLAL A, et al.Coherent correlation networks among protein biomarkers of beef tenderness:What they reveal[J].Journal of Proteomics, 2015, 128:365-374.

[8] GUILLEMIN N, BONNET M, JURIE C, et al.Functional analysis of beef tenderness[J].Journal of Proteomics, 2011, 75(2):352-365.

[9] 王路鹿. 宿主Prdx6单一酶活性与布鲁氏菌胞内寄生关系的研究[D].长春:吉林大学, 2019.

WANG L L.Study on the relationship between single enzyme activity of host Prdx6 and intracellular parasitism of Brucella[D].Changchun:Jilin University, 2019.

[10] O’FLAHERTY C, LIU Y N.In vivo oxidative stress alters thiol redox status of peroxiredoxin 1 and 6 and impairs rat sperm quality[J].Asian Journal of Andrology, 2017, 19(1):73.

[11] HASSAN M S M, MANDEEP K, ASGAR F, et al.The pathogenic and spoilage bacteria associated with red meat and application of different approaches of high CO2 packaging to extend product shelf-life[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2021:21-22.

[12] 黄琳琳. 基于氧化应激途径对过氧化物还原酶6调控牛肉嫩度机制的研究[D].泰安:山东农业大学, 2022.

HUANG L L.Study on the mechanism of peroxidase 6 regulating beef tenderness based on oxidative stress pathway[D].Tai’an:Shandong Agricultural University, 2022.

[13] 孙志昶, 余群力, 韩玲, 等.细胞凋亡对牦牛肉成熟过程中品质的影响[J].现代食品科技, 2014, 30(8):82-88.

SUN Z C, YU Q L, HAN L, et al.The research of apoptotic in yak muscles during postmortem aging[J].Modern Food Science and Technology, 2014, 30(8):82-88.

[14] VERGARA H, GALLEGO L.Effects of gas composition in modified atmosphere packaging on the meat quality of Spanish Manchega lamb[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81(14):1353-1357.

[15] L

PEZ-PEDROUSO M, FRANCO D, SERRANO M P, et al.A proteomic-based approach for the search of biomarkers in Iberian wild deer (Cervus elaphus) as indicators of meat quality[J].Journal of Proteomics, 2019, 205:103422.

[16] KONING M, WERKER P M N, VAN LUYN M J A, et al.Hypoxia promotes proliferation of human myogenic satellite cells:A potential benefactor in tissue engineering of skeletal muscle[J].Tissue Engineering Part A, 2011, 17(13-14):1747-1758.

[17] ZHAO W, JIANG X E, YANG S X.lncRNA TUG1 promotes cell proliferation, migration, and invasion in hepatocellular carcinoma via regulating miR-29c-3p/COL1A1 axis[J].Cancer Management and Research, 2020, 12:6837-6847.

[18] FU X H, CHEN C Z, WANG Y, et al.COL1A1 affects apoptosis by regulating oxidative stress and autophagy in bovine cumulus cells[J].Theriogenology, 2019, 139:81-89.

[19] JOSEPH P, SUMAN S P, RENTFROW G, et al.Proteomics of muscle-specific beef color stability[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(12):3196-3203.

[20] HUANG M Y, DUAN R Y, YIN J W, et al.Individual and mixture toxicity of chromium and copper in development, oxidative stress, lipid metabolism and apoptosis of Bufo gargarizans embryos[J].Aquatic Toxicology, 2020, 229:105671.

[21] KONG A D, XU D, HAO T T, et al.Role of acyl-coenzyme A oxidase 1 (ACOX1) on palmitate-induced inflammation and ROS production of macrophages in large yellow croaker (Larimichthys crocea)[J].Developmental &Comparative Immunology, 2022, 136:104501.

[22] DIDIASOVA M, SCHAEFER L, WYGRECKA M.When place matters:Shuttling of enolase-1 across cellular compartments[J].Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2019, 7:61.

[23] JOVÉ M, PRADAS I, DOMINGUEZ-GONZALEZ M, et al.Lipids and lipoxidation in human brain aging.Mitochondrial ATP-synthase as a key lipoxidation target[J].Redox Biology, 2019, 23:101082.

[24] GUO Y, CHOMIAK A A, HONG Y, et al.Histone H2A ubiquitination resulting from Brap loss of function connects multiple aging hallmarks and accelerates neurodegeneration[J].iScience, 2022, 25(7):104519.

[25] MISHRA N, TIMILSINA U, GHIMIRE D, et al.Downregulation of cytochrome c oxidase subunit 7A1 expression is important in enhancing cell proliferation in adenocarcinoma cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2017, 482(4):713-719.