可可是锦葵科可可属常绿乔木,历史悠久,适宜在西非地区尼日利亚等国的热带地区种植。可可果实及种子中蛋白质、脂肪等营养成分含量较高,同时富含多酚等活性成分,经发酵和烘焙等工艺后可制得可可粉及巧克力[1]。可可多酚(cocoa polyphenol,CP)是从可可豆中提取出来的天然成分,约占其干重的6%～8%[2]。CP的种类非常丰富,主要为原花青素(proanthocyandin,PC)、酚酸以及黄酮类化合物[3],其中PC的含量最高。CP具有很好的抗氧化能力,可抑制低密度脂蛋白胆固醇和脂质的氧化、过氧化,增强人体内的抗氧化应激能力,对预防心血管、炎症、代谢紊乱和癌症等疾病具有积极作用[4]。此外,CP可为食品提供巧克力香气、风味与色泽,因而被广泛添加到各类食品中,如可可饮料、巧克力冰淇淋、巧克力蛋糕等。可可饮料是以可可豆、可可粉为原料,添加或不添加其他食品原辅料和食品添加剂,经加工制成的饮料[5]。
多酚生物可及性是指经胃肠道消化后,从食品基质中释放且可以被人体吸收的多酚物质所占的比例,它可以反映多酚的消化稳定性。此外,生物可及性是生物利用性的重要部分,生物利用性的高低决定着多酚在机体内发挥健康功能的效应[6]。因此,探究多酚生物可及性对优化食品加工工艺和为人们提供合理膳食建议具有重要意义。可可饮料是消费者喜爱的饮料产品,提高该产品中CP生物可及性和营养健康性、优化相关配方、改善加工方法,最终可以提高其市场经济价值。CP健康功能的发挥与其生物可及性和加工条件及食品组分对它的影响密切相关。据报道,乳清蛋白(whey protein,WP)占牛乳蛋白的20%,含有亮氨酸、异亮氨酸等必需氨基酸,营养价值高,同时具有改善脑力、防御病菌等功能,且溶解性较优,易被人体吸收[7]。日常生活中,大多数饮料通过添加WP来增加蛋白质含量和产品营养价值。然而,在热加工可可饮料中,乳蛋白添加对CP生物可及性的影响及乳蛋白与CP的相互作用,目前尚不清楚。
因此,本研究以可可粉与WP混合溶液构建可可饮料模拟体系,通过体外模拟消化实验,探讨不同热处理条件下WP的添加对模拟体系中CP生物可及性的影响,然后选择β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)与CP中的主要成分PC,通过圆二色光谱和荧光光谱技术进一步探究不同热处理条件下二者间的相互作用及其与CP生物可及性变化的关系。研究结果对于优化可可饮料加工方法和配方,以及提升CP生物利用性和产品健康功能品质具有重要指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
PC(纯度≥99%),南京春秋生物工程有限公司;可可粉,无锡华东可可食品股份有限公司;WP(纯度≥90%),河北百味生物科技有限公司;胰酶,北京百灵威科技有限公司;β-LG(纯度≥95%),美国Sigma公司;甲醇、福林酚试剂、Na2CO3、KCl、CaCl2、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2、(NH4)2CO3(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SB-4200DTD超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Chirascan V100圆二色光谱仪,英国应用光物理公司;Fluoromax-4型荧光光谱仪,日本HITACHI公司;SevenEasy pH计、EL204电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;冷冻离心机,美国Sigma-Aldrich公司;UV 5300PC型紫外-可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
1.3 实验方法
1.3.1 CP的制备
称取1 g可可粉,加入15 mL体积分数80%的甲醇水溶液(含体积分数0.5%的甲酸),于25 ℃下超声波辅助提取30 min。提取液4 000×g离心10 min,收集上清液,残渣再重复提取2次,合并上清液并定容至50 mL,得到CP的提取液样品。
1.3.2 总酚含量测定
采用MOHD ROSLI等[8]的方法进行总酚含量测定,略作修改,具体如下:取500 μL样品置于离心管中,加入500 μL 100 g/L的福林酚试剂,涡旋振荡混匀,放置2 min。加入4 mL 50 g/L的Na2CO3溶液,涡旋混匀样品,40 ℃水浴20 min。之后冰浴冷却,在765 nm测定吸光度。以20～100 mg/L的PC绘制标准曲线,总酚含量表示为PC当量(mg/L)。
1.3.3 可可饮料模拟体系构建
按照可可粉15 g/L、WP 5.6 g/L配制可可饮料模拟体系。常温组:体系混合均匀后备用;85 ℃热处理组:将混合均匀后的体系于85 ℃水浴中加热30 min,加热结束后立即置于冰水浴中冷却;121 ℃热处理组:将混合均匀后的体系于高压蒸汽灭菌锅中进行121 ℃/15 min处理,加热结束后立即置于冰水浴中冷却。以上制备获得的样品用于后续体外模拟消化实验;另外,从其中取部分样品在10 000 r/min离心10 min,取上清液进行消化前体系中总酚含量测定。
1.3.4 体外模拟消化
按表1配制模拟口腔唾液、胃消化液和肠消化液。采用INFOGEST 2.0[9]进行体外模拟消化实验,分别对人体消化过程中口腔、胃、肠三个阶段进行模拟。
表1 体外模拟消化溶液的制备
Table 1 Preparation of in vitro simulated digestion solutions
工作液口腔唾液/mL胃消化液/mL肠消化液/mL0.5 mol/L KCl3.7751.7251.7 0.5 mol/L KH2PO40.9250.2250.21 mol/L NaHCO31.73.12510.6252 mol/L NaCl02.952.40.15 mol/L MgCl2·6H2O0.1250.10.2750.5 mol/L (NH4)2CO30.0150.1250H2O93.4691.7584.8pH6.81.38.1
移取5.0 mL模拟体系于50 mL离心管中,加入4.0 mL 口腔唾液、25 μL 0.3 mol/L CaCl2以及975 μL超纯水混合均匀并于37 ℃消化2 min。口腔阶段模拟消化结束后,向离心管中加入8.0 mL胃消化液、1.6 mL胃蛋白酶溶液、5 μL 0.3 mol/L CaCl2、0.2 mL 1 mol/L HCl(调节pH至3.0)以及0.195 mL水,并将离心管在37 ℃水浴中振荡消化2 h,之后,迅速将样品置于冰浴冷却。10 min后冷却结束,向离心管中加入8.5 mL肠消化液、5.0 mL胰酶溶液、2.5 mL 160 mmol/L胆汁盐溶液、40 μL 0.3 mol/L CaCl2、0.15 mL 1 mol/L NaOH(调节pH至7.0)以及3.81 mL水,之后再次将离心管于37 ℃水浴中振荡消化2 h,之后,迅速将样品置于冰浴冷却。10 min后结束冷却,在10 000 r/min下冷冻离心10 min,取上清液进行总酚含量测定。以模拟体系消化液生物可及中多酚的含量表示体系中CP的绝对生物可及性,单位为mg/L。
1.3.5 圆二色谱
参照QIE等[10]的方法,略作修改。用pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液配制20 μmol/L β-LG和100 μmol/L PC的混合溶液,同时制备相同浓度的单独β-LG和PC溶液作为对照,并同上述1.3.3节一样进行常温、85 ℃/30 min和121 ℃/15 min的热处理,冰浴冷却后的样品进行圆二色谱检测,设置带宽1.0 nm,采样时间间隔0.5 s,扫描范围190～250 nm。
1.3.6 荧光淬灭光谱
参照YIN等[11]的方法,略作修改。使用pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液分别配制20 μmol/L的β-LG溶液(于4 ℃过夜水合)和1.0 mmol/L的PC溶液(现配现用)。分别配制7个浓度梯度的PC-β-LG样品,其中β-LG浓度均10 μmol/L,PC浓度梯度为0、10、25、40、50、80、100 μmol/L,并分别进行如1.3.3节一样的常温、85 ℃/30 min和121 ℃/15 min热处理,加热结束后立即进行冰浴冷却,然后分别在25 ℃(298 K)、35 ℃(308 K)和45 ℃(318 K)恒温条件下对每组样品进行荧光分析。荧光光谱测定条件:激发波长280 nm,狭缝波长5 nm,在300～450 nm范围内进行扫描,并以相同浓度CP的缓冲溶液作为空白。
通过Stern-Volmer方程和双对数Stern-Volmer方程分析PC对β-LG的荧光猝灭机理、结合常数和结合位点数,计算公式如公式(1)、公式(2)所示:
=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]
(1)
(2)
式中:F0,蛋白质荧光体分子的荧光强度;F,蛋白质荧光体分子与猝灭剂(PC)结合后的荧光强度;Kq,生物大分子猝灭过程中的速率常数;τ0,荧光分子在无猝灭剂情况下的寿命常数(约为10-8 s);KSV,动态猝灭常数;[Q],猝灭剂浓度;KA和n分别代表猝灭剂与荧光分子相互作用的结合常数和结合位点数。
根据Van’t Hoff方程计算配体与蛋白质间的热力学参数,计算如公式(3)所示:
ΔG=-RTlnKA
(3)
ΔG=ΔH-TΔS
式中:T,绝对温度(K);KA,温度T时的结合常数;ΔH,结合焓变;ΔG,结合自由能变化;ΔS,结合熵变;R,气体常数[8.314 J/(mol·K)]。
1.4 数据分析
所有实验均重复3次,结果以平均值±标准偏差表示。数据结果采用Statistix 9.0软件进行单因素方差分析,并采用最小显著性差异法分析平均值之间的差异。
2 结果与分析
2.1 不同热处理条件下WP对CP提取物中总酚含量的影响
由图1可知,CP和添加WP的CP体系在经过热处理(85 ℃/30 min和121 ℃/15 min)后总酚含量明显增加。据ZZAMAN等[12]报道,热处理会导致可可中酚类物质含量明显下降,但由于可可粉中含有蛋白质、纤维素等物质,在常温下与CP呈结合状态,而随着温度的升高,蛋白质、多糖等大分子物质发生降解,结合态的CP逐渐被释放出来,同时温度升高也会导致CP的溶解性增加,这会导致体系内游离态CP增加的量大于其热损失减少的量,故经热处理后总酚含量有所增加[13]。此外,在常温和85 ℃/30 min条件下,WP的加入对CP体系内游离总酚含量无显著影响,但在121 ℃/15 min处理条件下,加入WP使CP中游离总酚含量下降13.43%。出现此现象的可能原因是在常温和85 ℃条件下,CP与WP间的相互作用不显著,但在121 ℃热处理条件下,CP与WP间存在非常强烈的相互作用,因此使CP中游离总酚含量显著下降。
图1 热处理对添加/不添加WP的CP提取物中总酚含量的影响
Fig.1 Effects of heat treatment on the total phenolic contents of CP with/without WP addition
注:不同字母表示不同组间存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.2 不同热处理条件下WP对CP生物可及性的影响
由图2可知,未添加WP时,与常温对照组相比,经85 ℃/30 min和121 ℃/15 min处理后CP绝对生物可及性分别增加66.34%和219.63%。添加WP后,经不同热处理,与常温对照组相比,经85 ℃/30 min和121 ℃/15 min后CP绝对生物可及性分别增加39.46%和120.07%。CP的生物可及性显著提高是由于热处理导致CP从可可大分子中释放并溶于水体系中的含量高于热损失的含量[14]。
图2 热处理对添加/不添加WP的CP绝对生物可及性的影响
Fig.2 Effects of heat treatment on the total phenolic bioaccessibility of CP with/without WP addition
在常温和85 ℃/30 min处理条件下,WP加入后CP中总酚的生物可及性分别提高34.02%和12.37%,这说明在体外消化过程中WP的加入对CP具有保护作用。CP与WP结合形成的络合物,对于不同消化阶段的酸碱抵抗性增加,经消化后其损失量将减少。此外,在常温和85 ℃下,CP与WP的结合强度可能较低,容易与蛋白解离再次以游离形式进入体系中,因此WP的加入会呈现保护作用大于削弱作用的情况。而在121 ℃/15 min处理下,加入WP会导致CP总酚的绝对生物可及性下降7.73%,这是由于经121 ℃处理后,CP可能会与蛋白发生非常强烈的相互作用,从而与消化道体系中悬浮的颗粒物相结合,以结合态的形式存在,导致游离酚含量的下降[13-14]。
2.3 热处理条件下可可饮料体系中β-乳球蛋白与原花青素相互作用
2.3.1 圆二色谱
由图3可知,热处理对于β-LG的圆二色性有较强影响,而PC的影响相对不明显。由圆二色谱得到的二级结构信息如表2所示,与常温相比,85 ℃/30 min会使β-LG的α-螺旋和无规则卷曲含量增加、β-折叠和β-转角含量降低,而121 ℃/15 min处理使β-LG的α-螺旋、β-转角和无规则卷曲含量增加、β-折叠含量降低,这说明热处理会使β-LG的结构变得松散。此外,不同热处理条件下PC的加入对β-LG二级结构的影响整体不大,呈现α-螺旋结构稍微下降无规则卷曲结构轻微上升的趋势,说明加入PC后由于多酚结合作用使β-LG的结构变得松散[15]。
图3 不同处理条件下β-LG的圆二色谱图
Fig.3 Circular dichroism spectra of β-LG with different treatments
表2 不同处理条件下β-LG的二级结构含量 单位:%
Table 2 Secondary structure contents of β-LG with different treatments
样品/热处理条件α-螺旋β-折叠β-转角无规则卷曲β-LG/常温5.940.922.330.9PC-β-LG/常温5.741.022.131.3β-LG/85 ℃7.439.321.831.5PC-β-LG/85 ℃6.839.121.732.4β-LG/121 ℃7.237.122.533.3PC-β-LG/121 ℃6.237.922.433.5
2.3.2 荧光光谱
2.3.2.1 荧光淬灭分析
从图4中可知,β-LG在85 ℃和121 ℃加热后荧光强度显著增加,这可能与它在中性环境的变性温度在65～68.5 ℃有关[16],在常温下β-LG主要以二聚体形式存在,当热处理温度高于变性温度时,β-LG二聚体会发生变性解体,同时荧光自消灭的Trp会减少,从而使得β-LG荧光强度增大。PC对β-LG的荧光具有明显猝灭作用,且PC浓度越高,对β-LG荧光的猝灭效果越强烈。
图4 不同热处理下不同浓度(0～100 μmol/L)PC对10 μmol/L β-LG在λex=280 nm的荧光猝灭图
Fig.4 Fluorescence spectra of β-LG (10 μmol/L) with PC (0-100 μmol/L)-subjected to different heat treatments at 280 nm (λex)
注:a-0;b-10 μmol/L;c-25 μmol/L;d-40 μmol/L;e-50 μmol/L;f-80 μmol/L;g-100 μmol/L。
β-LG在常温条件下的最大发射波长(λmax)为332 nm,而β-LG在不同处理温度下经不同浓度PC作用后,其λmax几乎不变,这说明PC对β-LG的Trp残基的环境无明显改变。当PC浓度为100 μmol/L时,PC在常温、85 ℃以及121 ℃处理条件下(298K)对β-LG荧光值的猝灭率分别为73.03%、86.85%、97.42%,可见随热处理温度的增加猝灭率增高,这可能与PC受热氧化后,结构改变,对β-LG的猝灭能力增强有关[17]。同时,在高温条件下,尤其是121 ℃处理下,PC浓度增加对β-LG猝灭程度的增加的效果越发明显。这与徐洁琼[18]测得的表没食子酸儿茶素、表儿茶素没食子酸酯等茶多酚单体对β-LG的荧光猝灭情况相比,PC具有更高的猝灭率,这可能与PC具有多羟基的结构且是低聚体有关[19]。
2.3.2.2 荧光淬灭机理
由图5可知,PC与β-LG的Stern-Volmer方程是非直线的,尤其是85 ℃和121 ℃下其非直线性更加明显,可以说明PC对β-LG的猝灭作用是静态猝灭作用和动态猝灭作用共同发生导致的[18]。Stern-Volmer曲线斜率KSV代表动态猝灭常数,且由表3可以看出,PC与β-LG的KSV值随温度增加而增加,但其Kq值在1012～1013 L/(mol·s)数量级,远大于最大动态猝灭的Kq值[2×1010 L/(mol·s)]。总的来说,在线性范围内,PC对β-LG的猝灭作用是静态猝灭,即β-LG的荧光猝灭是由于新复合物形成引起的。
a-常温;b-85 ℃/30 min;c-121 ℃/15 min
图5 不同热处理条件下β-乳球蛋白与原花青素在298、308和318 K下的Stern-Volmer曲线
Fig.5 Stern-Volmer curves of PC-β-LG at 298, 308, and 318 K under different heat treatments
表3 不同热处理下原花青素与β-乳球蛋白的猝灭常数
Table 3 Quenching constants of PC-β-LG with different heat treatments
热处理温度/KKSV/(×104 L/mol)Kq/[×1012 L/(mol·s)]常温2982.40±0.16a2.40±0.16a3082.50±0.15a2.50±0.15a3182.31±0.00a2.31±0.00a85 ℃2985.56±0.14a5.56±0.14a3084.97±0.10ab4.97±0.10ab3184.68±0.18b4.68±0.18b121 ℃29827.34±0.53b27.34±0.53b30830.90±0.51a30.90±0.51a31828.86±0.93ab28.86±0.93ab
注:不同字母表示相同处理温度不同保温温度下KSV及Kq间存在显著性差异(P<0.05)。
2.3.2.3 结合常数与结合位点数
从图6可知,其双对数曲线都呈现较好的线性关系,并根据直线的斜率和截距可分别得到n和KA,结果如表4所示。常温下PC与β-LG的结合常数KA为2.63×105L/mol,85 ℃热处理下PC与β-LG的结合常数KA为74.28×105 L/mol,121 ℃热处理下PC与β-LG的结合常数KA为4 973.22×105 L/mol。常温下PC与β-LG的结合位点数n略大于1,说明常温下β-LG提供一个结合位点与PC结合。当热处理温度升高时,PC与β-LG的结合位点数n增加,121 ℃热处理下PC与β-LG的结合位点数n接近2,说明121 ℃下β-LG提供2个结合位点与PC结合。
a-常温;b-85 ℃/30 min;c-121 ℃/15 min
图6 不同热处理条件下β-乳球蛋白与原花青素在298、308和318 K下的双对数回归曲线
Fig.6 Double logarithmic regression curves of PC-β-LG at 298, 308, and 318 K under different heat treatments
表4 原花青素与β-乳球蛋白的结合常数KA、结合位点数n及热力学参数
Table 4 Binding constants, numbers of binding sites, and thermodynamic parameters of PC-β-LG
热处理温度/KKA/(×105L/mol)nΔH/(kJ/mol)ΔG/(kJ/mol)ΔS/[J/(mol·K)]常温2982.63±0.32b1.26±0.003081.85±0.621.22±0.033181.40±0.091.20±0.01-25.03-30.9219.77-31.0619.58-31.3219.7885 ℃29874.28±0.17b1.53±0.0030830.42±5.591.44±0.0231812.28±2.561.35±0.02-70.86-39.20-106.27-38.23-105.97-37.07-106.27121 ℃2984 973.22±727.76a1.81±0.013087 867.88±1 027.011.85±0.013189 467.41±160.301.88±0.0025.47-49.61251.95-52.45252.99-54.64251.93
注:不同字母表示在298 K下KA存在显著性差异(P<0.05)。
由上述结果可以看出,随着温度的增加,PC与β-LG的结合强度增加,这是因为β-LG的结构易受温度影响,当其经20～60 ℃热处理时,会从二聚体解聚成为单体,同时结构会稍作展开[20]。但当其经受80 ℃以上热处理时会发生不可逆的变性,同时内部的疏水侧链会暴露到表面[21],因此其与多酚等小分子物质的结合将变得更加强烈。PC与β-LG在不同热处理下相互作用的变化与上述研究中CP生物可及性的变化呈现很好的相关性,这也一定程度上解释了为何出现WP在常温和85 ℃热处理下可以提高CP的生物可及性,而在121 ℃热处理下却降低了CP的生物可及性。
2.3.2.4 热力学常数及结合力类型
从表4可知,PC与β-LG结合过程的吉布斯自由能变化ΔG<0,这表明PC与β-LG是自发结合的。对于β-LG与PC在常温下的结合反应,其ΔH<0、ΔS>0,表明两者之间的相互作用主要为静电相互作用;β-LG与PC经85 ℃热处理后,其ΔH<0、ΔS<0,表明两者之间主要存在范德华作用和氢键作用;而121 ℃热处理后,其ΔH>0、ΔS>0,表明两者主要以疏水相互作用发生结合[22-23]。
3 结论
本文研究了可可饮料体系中WP的添加对不同热处理条件下CP生物可及性的影响,并通过圆二色谱和荧光光谱技术研究β-LG和PC的之间的相互作用。结果表明,常温和85 ℃热处理条件下,添加WP对消化前CP总酚含量无明显影响,但在体系进行121 ℃热处理后,CP总酚含量明显下降13.43%。常温和85 ℃热处理下,加入WP后CP生物可及性分别提高34.02%和12.37%,但121 ℃热处理下,WP的加入使CP生物可及性下降7.73%。可可饮料体系中的PC与β-LG在热处理条件下发生不同程度的相互作用,常温和85 ℃热处理下,PC与β-LG分别以静电相互作用、范德华和氢键相互作用为主,强度相对较弱;经121 ℃热处理后它们以疏水相互作用为主,结合作用很强(KA为4.97×108 L/mol)。可可饮料体系中CP生物可及性和多酚-蛋白质相互作用强度有关,在常温和85 ℃热处理下,一定强度的蛋白-多酚相互作用对CP有保护效果,可提高CP的生物可及性,但121 ℃热处理后,蛋白-多酚相互作用强度过大,乳蛋白反而降低CP生物可及性。
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