番茄红素(lycopene)是一种广泛存在于植物中的天然类胡萝卜素,主要存在于西红柿、西瓜和粉红葡萄等水果蔬菜中[1]。番茄红素可提高人体免疫力、调节血脂、预防心血管疾病[2];同时还对过敏性鼻炎有一定的治疗作用,且随着番茄红素剂量的增加,这种作用越强[3]。研究表明,番茄红素比其他类胡萝卜素具有更好的抗氧化活性,被誉为“植物金”[4],有专家建议每天可以摄入5～7 mg的番茄红素[5]。目前将番茄红素应用于越来越多的食品、医药、化妆品等领域。但由于番茄红素存在大量的共轭双键,温度、光照等都会造成番茄红素的氧化分解[6],这限制了番茄红素的应用。
微胶囊(microcapsules)是使用一种或几种稳定的分子材料将不稳定的物质进行包埋,包埋的分子材料作为壁材,被包埋的材料作为芯材[7]。微胶囊具有降低外界环境对芯材的影响,减少芯材蒸发、掩盖芯材的气味等功能[8],因此,将微胶囊技术应用于番茄红素,可以减少其损耗,微胶囊的开发已经成为提高番茄红素稳定性和扩大其应用范围的核心技术。制作微胶囊的方法多种多样,有喷雾干燥技术、真空冷冻干燥技术、复合凝聚法等,其中喷雾干燥是一种快速且简便的干燥手段,该方法干燥速度快,样品溶液可直接成为粉末状固体,无需粉碎过程即可直接得到颗粒大小均匀、溶解度极优的产品[9]。其原理是干燥室中将样品经雾化后,在与热空气的接触中,遇热水分迅速汽化,即得到干燥的微胶囊产品。有研究报道,采用改性淀粉为壁材,对番茄红素进行包埋,取得较高的包埋率[10]。冷冻干燥法可有效防止热敏性物质在干燥过程的变化[11],其原理为样品预冻后,在真空的环境下,将冰升华为蒸汽从而去除水分。龙海涛等[12]以麦芽糊精、蔗糖和酯化淀粉等为壁材,采用冷冻干燥的方法以制备番茄红素微胶囊,取得较高的包埋率并提高番茄红素的稳定性。冷冻干燥法和喷雾干燥法制备微胶囊是较为常见的2种方法,到目前为止,鲜有文献将喷雾干燥技术和冷冻干燥技术制备的番茄红素微胶囊进行对比,因此本文将喷雾干燥技术和冷冻干燥技术制备的微胶囊进行比较,旨在探讨制备番茄红素微胶囊的最佳工艺。
本实验从番茄中提取番茄红素,以此为芯材利用冷冻干燥技术和喷雾干燥技术制备番茄红素微胶囊。因明胶具有较好的成膜性,糊精水溶性好,可以增加固形物含量,蔗糖可以增强成膜的强度,因此选用明胶、β-环糊精和蔗糖作为喷雾干燥法的壁材,以β-环糊精作为冷冻干燥法的壁材。对不同加工工艺制得微胶囊的物理性能、粒径大小、包埋率、微观结构、抗氧化性进行评价,并对比2种工艺制备的番茄红素微胶囊在温度、光照等方面的稳定性。
1 材料与方法
1.1 材料仪器
番茄由上海丰伟果蔬专业合作社提供。
乙酸乙酯、β-环状糊精、蔗糖、水杨酸、FeSO4、体积分数30%H2O2,国药集团化学试剂有限公司;明胶、苏丹红Ⅰ号色素,上海源叶生物科技有限公司;总抗氧化(ABTS法)试剂盒,北京艾普希隆生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,阜阳曼林生物技术有限公司等。
N-1300型真空旋转蒸发仪,上海爱朗仪器有限公司;MQX200型酶标仪,美国百特仪器有限公司;B-290型喷雾干燥机,瑞士BUCHI实验室仪器公司;TM 4000 plus型扫描电子显微镜、CR21N型离心机,日本Hitachi公司;101-2型电热恒温干燥箱,绍兴市苏珀仪器有限公司;LYOQUEST-55型冷冻干燥机,河南兄弟仪器设备有限公司;CM-5型色差计,柯盛行(杭州)仪器有限公司;ZetaView型可视化纳米颗粒跟踪分析仪,德国Particle Metrix公司等。
1.2 实验方法
1.2.1 番茄红素的提取
图1列出了番茄红素的提取工艺。
图1 番茄红素的提取工艺
Fig.1 Extraction technology of lycopen
1.2.2 番茄红素微胶囊的制备
喷雾干燥法的壁材:称取明胶、 β-环糊精和蔗糖各5 g,溶于一定质量水中,微热溶解,即得喷雾干燥法需要的壁材溶液。
冷冻干燥法的壁材:取15 g β-环糊精溶于一定量水中,微热溶解,即得冷冻干燥法需要的壁材溶液。
乳液制备:参考周丹红[13]的方法并加以修改,取3 g番茄红素微热使其溶于少量乙酸乙酯中,此为油相,芯壁比为1∶5,边搅拌壁材溶液边加入油相物质,高速分散后均质,使乳化液均一稳定。
喷雾干燥微胶囊:壁材选用明胶、β-环糊精以及蔗糖并按质量比1∶1∶1溶解于一定质量的水中,此为水相,将上述乳液进行喷雾干燥,干燥条件进风温度为180 ℃,进料量为10 mL/min,进风流速为5.10 m3/min[14]。
冷冻干燥微胶囊:壁材选用β-环糊精溶解于一定质量的水中,此为水相,均质后进行冷冻干燥得微胶囊。
将2种方法得到的微胶囊对包埋率、物理性质、微观结构、抗氧化性以及稳定性方面进行研究。
1.2.3 番茄红素微胶囊的物理性质
1.2.3.1 得率
根据张波[15]的方法测定,计算如公式(1)所示:
得率
(1)
1.2.3.2 堆积密度
根据GOYAL等[16]的方法并加以修改,首先5 mL量筒的质量m1,后将番茄红素微胶囊散落在5 mL的量筒中,量取量筒和番茄红素微胶囊的质量m2,读取微胶囊的堆积体积V,求堆积密度r,计算如公式(2)所示:
(2)
式中:ρ,堆积密度,g/mL;m1,量筒的质量,g;m2,量筒和微胶囊的质量,g;V,微胶囊堆积体积,mL。
1.2.3.3 流动性
根据王鲁慧等[17]的方法并加以修改,在直径2 cm的圆纸的圆心上方,将一定质量的微胶囊沿漏斗下落到圆纸上,直到微胶囊到达边界,测定微胶囊的堆积高度h,计算如公式(3)所示:
(3)
式中:α, 休止角,°;h,堆积高度,cm;r,圆纸半径,cm。
1.2.3.4 溶解度
根据WANG等[18]的方法,选用一定质量的样品溶于蒸馏水中,超声振荡,离心,取上清液,干燥至恒重,量取干燥后固体的质量,溶解度计算如公式(4)所示:
溶解度
(4)
式中:m,干燥后的固体质量,g;V,上清液的体积,L。
1.2.3.5 色差
先用白板校正,根据仪器操作规范,将一定量微胶囊粉末置于色差仪,进行测量,得到结果L*、a*、b*。
1.2.3.6 粒径大小
利用可视化纳米颗粒跟踪分析仪测量番茄红素微胶囊粒径大小,先将微胶囊样品溶于蒸馏水中,通过塑料注射器进样测量。
1.2.4 番茄红素的测定
参照马倩雯[19]的测定方法并加以修改。
1.2.4.1 标准曲线的制定
制备0.1 mg/mL的苏丹红Ⅰ号色素溶液,分别稀释至0.004、0.008、0.012、0.016、0.02、0.024 mg/mL 的标准溶液,在474 nm处测吸光度,做标准曲线,回归方程y=28.304x-0.013 2,R2=0.992。
1.2.4.2 番茄红素含量的测定
番茄红素样品中的番茄红素含量测定:取0.1 g番茄红素样品,用乙酸乙酯定容至50 mL容量瓶,在474 nm处测吸光度,计算番茄红素含量,得出粗番茄红素中番茄红素的含量占30%。
1.2.5 包埋率
参照周丹红[13]的方法,并加以修改。
番茄红素微胶囊表面的番茄红素含量:取一定质量的微胶囊于离心管中,加入乙酸乙酯振荡摇匀,离心后取上清液,向离心管中继续添加乙酸乙酯,重复上述操作,直至乙酸乙酯呈现无色状态,合并乙酸乙酯,定容至50 mL,在474 nm处测定吸光度。
番茄红素微胶囊中的番茄红素含量:取一定质量的微胶囊,溶于蒸馏水中,加入乙酸乙酯多次浸提,直至下层无色,合并乙酸乙酯,脱水后定容至50 mL,在474 nm处测吸光度,计算如公式(5)所示:
包埋率
(5)
1.2.6 微观结构
采用扫描电子显微镜进行观察,样品处理前对其喷金,加速电压5 kV[20]。
1.2.7 两种工艺制备的微胶囊稳定性研究
1.2.7.1 温度对番茄红素微胶囊稳定性的影响
将番茄红素微胶囊分别放置在4、25、40 ℃中避光保存,每隔2 d取样测番茄红素含量,计算保留率,共测5次。
1.2.7.2 光照对番茄红素微胶囊稳定性的影响
将番茄红素微胶囊置于透明的食品级自封袋中,密封,在25 ℃下日光照射下贮藏。每隔2 d取样,测定微胶囊中的番茄红素含量,计算番茄红素保留率,共测5次。
1.2.8 番茄红素微胶囊的抗氧化能力评价
1.2.8.1 DPPH自由基清除率
采用林蔚婷等[21]的方法并加以修改,分别制备质量分数1%、1.5%、2%、2.5%和3%的微胶囊溶液和维生素C溶液,在试管中加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液和样品溶液,混匀,放置0.5 h后在517 nm处测吸光度A0;另一支试管中加入2 mL DPPH溶液和2 mL无水乙醇,静置0.5 h,测吸光度A1,另取一支试管,加入2 mL样品溶液和无水乙醇,静置0.5 h,测吸光度A2,清除率按公式(6)计算:
DPPH清除率
(6)
1.2.8.2 ·OH清除率
参照王记莲[22]的方法,分别配制质量浓度为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL的微胶囊溶液和维生素C溶液,在试管中加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和样品溶液,摇匀。随后加入2 mL体积分数0.1% H2O2溶液,摇匀后静置15 min,加入2 mL 6 mmol/L溶剂为无水乙醇的水杨酸溶液,摇匀后静置0.5 h,在50 ℃水浴中反应0.5 h,在510 nm处测定吸光值A1,在另一支试管中加入2 mL蒸馏水,重复上述步骤,测吸光度A0,清除率计算如公式(7)所示:
·OH清除率
(7)
1.2.8.3 总抗氧化能力(ABTS法)测定
分别配制质量浓度为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL的样品溶液和维生素C溶液,采用ABTS自由基试剂盒,抗氧化能力以mmol Trolox/mL表示。
1.3 数据分析
上述实验均进行3次重复实验,结果取平均值。图表和数据由Origin 2018以及SPSS 26分析所得,数据结果以
表示。
2 结果与分析
2.1 番茄红素微胶囊的物理性质
微胶囊的物理性质主要包括堆积密度、色差值、流动性以及溶解度等。由表1可知,喷雾干燥微胶囊的得率低于冷冻干燥微胶囊的得率,因为在喷雾干燥过程中,样品会粘在喷雾干燥机的内壁,造成样品损失。喷雾干燥微胶囊的堆积密度大于冷冻干燥微胶囊,可能由于2种工艺制备的微胶囊粒径大小不同造成的结果,流动性以休止角α来表示,休止角越大,表示流动性越小,喷雾干燥微胶囊的休止角大于冷冻干燥微胶囊,可能因为喷雾干燥微胶囊的颗粒相互接触的面积大,摩擦力大,造成流动性小[23];番茄红素自身不溶于水,结果表示,2种工艺制备的微胶囊均能部分溶于水,因为壁材能够将番茄红素分散均匀[14],且冷冻干燥微胶囊的溶解度高于喷雾干燥微胶囊;2种微胶囊在颜色上也有显著的差异,a*表示红绿度,a*越大,表示颜色越红,b*表示黄蓝度,b*值越大,表示颜色越黄,喷雾干燥微胶囊的a*和b*值均高于冷冻干燥微胶囊,因此,喷雾干燥微胶囊偏红偏黄。
表1 番茄红素微胶囊的物理性质
Table 1 Physical properties of lycopene microcapsules
制备工艺得率/%堆积密度/(g/mL)流动性/°溶解度/(g/L)色差L∗a∗b∗喷雾干燥微胶囊25.48±0.670.23±0.030.45±0.024.89±0.8768.43±0.3622.76±0.2853.77±0.59冷冻干燥微胶囊39.35±0.970.17±0.040.35±0.058.77±0.3873.30±0.4114.68±0.3329.68±0.50
2.2 包埋率
微胶囊的包埋率越高,说明壁材包埋芯材的效果越显著。由图2可知,喷雾干燥微胶囊的包埋率为(66.88±2.04)%,冷冻干燥微胶囊的包埋率为(41.70±1.32)%,喷雾干燥微胶囊的包埋率近似为冷冻干燥微胶囊的包埋率的1.5倍。可能由于在喷雾干燥过程中,溶液雾化成液滴,番茄红素被壁材包埋,壁材中的水分遇热迅速蒸发,在番茄红素周围形成一层保护膜,且喷雾干燥微胶囊的壁材中含有明胶和蔗糖,明胶具有较好的成膜性,有专家研究发现存在于明胶分子中的氨基与存在于蔗糖中的醛基能够发生相互作用,导致微胶囊的膜结构紧密性更高[24],因此,喷雾干燥微胶囊的包埋率较高,而样品在冷冻干燥的过程中,形成的冰晶会破坏番茄红素外部的液态膜,冻干过程中,冰晶升华,表面结构被破坏[25],导致包埋率低。
图2 两种工艺对微胶囊包埋率的影响
Fig.2 Effect of two kinds of processes on the embedding rate of microcapsules
2.3 微观结构
扫描电镜能够观察到微胶囊的表面微观结构,有利于探讨2种微胶囊的表面结构的差异。图3为2种工艺制备的微胶囊的微观结构,图3-a和图3-e分别为喷雾干燥微胶囊和冷冻干燥微胶囊样品,喷雾干燥微胶囊的颜色比冷冻干燥微胶囊偏黄,与色差值b*一致。图3-b和图3-f分别是喷雾干燥微胶囊和冷冻干燥微胶囊是在扫描电镜1 000倍下拍摄的画面,喷雾干燥微胶囊呈球形,可见颗粒大小不均,在喷雾干燥的过程中,样品被雾化为液滴,干燥得到番茄红素微胶囊,因此,番茄红素微胶囊呈球状,而冷冻干燥微胶囊呈碎片状,这与GUO等[26]的研究结果一致,这是因为样品在冷冻过程中形成冰晶体,冰晶体会破坏样品的结构,在分子间作用力的作用下,导致溶质聚集,使微胶囊呈现片状[27],图3-c和图3-g是扫描电镜2 000倍的图片,喷雾干燥微胶囊中部分微胶囊表面出现裂痕,原因可能是喷雾干燥过程中温度偏高,水分快速蒸发,从而导致表面出现裂痕[28]。图3-d和图3-h为可视化纳米颗粒跟踪分析仪的单个粒子跟踪功能的激光散射视频显微镜捕捉到的喷雾干燥微胶囊和冷冻干燥微胶囊颗粒的画面,图片中白色的点为激光散射视频显微镜观察的番茄红素微胶囊颗粒,从图片观察可得出喷雾干燥微胶囊的颗粒大小大于冷冻干燥微胶囊,经可视化纳米颗粒跟踪分析仪检测,得到微胶囊粒径的结果,喷雾干燥微胶囊平均粒径在171.8 nm,而冷冻干燥微胶囊平均粒径在119.2 nm,喷雾干燥微胶囊的平均粒径大于冷冻干燥微胶囊,与堆积密度结果一致,由于冷冻干燥法制得的微胶囊粒径小,微胶囊之间含有许多间隙,因此冷冻干燥微胶囊堆积密度较小[29]。
a-喷雾干燥微胶囊样品;b-喷雾干燥微胶囊 扫描电镜1 000×;c-喷雾干燥微胶囊 扫描电镜2 000×;d-喷雾干燥微胶囊粒径图片;e-冷冻干燥微胶囊样品;f- 冷冻干燥微胶囊 扫描电镜1 000×;g- 冷冻干燥微胶囊 扫描电镜2 000×;h-冷冻干燥微胶囊粒径图片
图3 两种工艺制得的番茄红素微胶囊的微观结构
Fig.3 Microstructure of lycopene microcapsules prepared by two different processes
2.4 微胶囊稳定性评价
贮藏稳定性是微胶囊质量的一个重要指标,稳定性越强,表明微胶囊中的番茄红素损失率越低。图4表示喷雾干燥法和冷冻干燥法2种工艺对番茄红素微胶囊稳定性的影响,图4-a表示在4 ℃避光保存的条件下,每隔2 d对番茄红素微胶囊测定番茄红素保留率,结果显示,番茄红素保留率与贮藏时间呈负相关,冷冻干燥微胶囊的番茄红素保留率低于喷雾干燥微胶囊;图4-b是在25 ℃避光保存下,对番茄红素保留率的测定,番茄红素的保留率均随贮藏时间延长而明显下降(P<0.05),在第6天后,冷冻干燥微胶囊的番茄红素保留率低于喷雾干燥微胶囊的番茄红素保留率;图4-c为番茄红素微胶囊在40 ℃环境下避光保存的结果,由图4-c可知,第4天后,喷雾干燥微胶囊的保留率显著高于冷冻干燥微胶囊,因为番茄红素含有大量不饱和共轭双键,自身不稳定,在温度升高时,更易受到破坏;图4-d表示在室温下自然光照射的情况下测定的保留率,与图4-b相比,在光照的条件下,番茄红素的保留率减少。综上所述,造成番茄红素损失的原因为番茄红素易受热、见光分解,在不同的贮藏条件下,冷冻干燥微胶囊的保留率均低于喷雾干燥微胶囊,因为喷雾干燥微胶囊的包埋率高于冷冻干燥微胶囊,壁材能够在一定程度上减弱温度和光照对番茄红素的破坏作用,导致喷雾干燥微胶囊的保留率高于冷冻干燥微胶囊。
a-4 ℃避光保存;b-25 ℃避光保存;c-40 ℃避光保存;d-25 ℃自然光照射下保存
图4 两种工艺对贮藏稳定性的影响
Fig.4 Effects of two processes on storage stability
注:图中同一组别不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.5 微胶囊抗氧化能力评价
DPPH自由基、·OH和ABTS阳离子自由基的清除率均是评价抗氧化能力的重要指标[30],抗氧化能力与自由基清除率呈正相关关系,抗氧化能力的比较如图5所示。图5-a表示两种微胶囊·OH清除率的差异,随着浓度增大,维生素C、喷雾干燥微胶囊以及冷冻干燥微胶囊的·OH清除率均增加,图5-b为2种微胶囊的DPPH自由基清除率的比较,随着质量分数的增加,维生素C的自由基清除率无明显变化(P>0.05),喷雾干燥微胶囊的DPPH自由基清除率高于冷冻干燥微胶囊;图5-c表示2种微胶囊的总抗氧化能力的比较,同一浓度下,喷雾干燥微胶囊的抗氧化能力高于冷冻干燥微胶囊,经分析,喷雾干燥微胶囊的IC50为0.015 mg/mL,而冷冻干燥微胶囊的IC50为0.017 mg/mL,IC50越低,表示抗氧化能力越强[31],结合图5-c和IC50比较,冷冻干燥微胶囊的抗氧化能力低于喷雾干燥微胶囊。综上所述,2种微胶囊对3种自由基均有一定程度的清除能力,冷冻干燥微胶囊的自由基清除能力弱于喷雾干燥微胶囊,即冷冻干燥微胶囊的抗氧化性弱于喷雾干燥微胶囊。
a-两种微胶囊对·OH清除率的影响;b-两种微胶囊对DPPH自由基清除率的影响;c-两种微胶囊对总抗氧化能力(以ABTS法表示)的影响
图5 两种工艺对番茄红素微胶囊的抗氧化能力的影响
Fig.5 Effects of two different processes on antioxidant capacity of lycopene microcapsules
3 结论
本文主要是将喷雾干燥微胶囊和冷冻干燥微胶囊从物理性质、微观结构、稳定性、包埋率和抗氧化能力进行比较。
在物理性质方面上,冷冻干燥微胶囊的得率为39.35%、溶解度为8.77 g/L,均高于喷雾干燥微胶囊,但色差值、堆积密度低于喷雾干燥微胶囊;喷雾干燥微胶囊的包埋率为66.88%,冷冻干燥微胶囊的包埋率为41.70%,喷雾干燥微胶囊的包埋率高于冷冻干燥微胶囊,表明喷雾干燥微胶囊中芯材的包埋效果优于冷冻干燥微胶囊;在贮藏稳定性方面,在4、25、40 ℃和光照的条件下,喷雾干燥微胶囊的番茄红素保留率均高于冷冻干燥微胶囊,表明喷雾干燥微胶囊的贮藏稳定性优于冷冻干燥微胶囊,与包埋率结果一致,包埋率越高,微胶囊的贮藏稳定性越强;在微观结构方面,2种微胶囊的微观结构差异明显,喷雾干燥微胶囊呈球状,能够对芯材实现更好的包埋,而冷冻干燥微胶囊呈现片状,喷雾干燥微胶囊平均粒径为171.8 nm,冷冻干燥微胶囊的平均粒径为119.2 nm,小于喷雾干燥微胶囊;在抗氧化方面,喷雾干燥微胶囊的·OH清除率、DPPH自由基清除率和总抗氧化能力随样品浓度增加而增加,而喷雾干燥微胶囊的3种自由基清除率均高于冷冻干燥微胶囊。综上所述,虽然喷雾干燥微胶囊的得率低于冷冻干燥微胶囊,但喷雾干燥微胶囊的贮藏稳定性和抗氧化活性均高于冷冻干燥微胶囊,贮藏稳定性是微胶囊重要的指标之一,贮藏稳定性强,表明番茄红素被保护程度高,能够减少番茄红素的损失,而番茄红素重要的生物活性为抗氧化能力,保持番茄红素的抗氧化能力尤为重要。因此,喷雾干燥技术制备的番茄红素微胶囊优于冷冻干燥技术,为番茄红素微胶囊的制备提供了依据。
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