猕猴桃是我国的传统水果,海沃德为主栽品种之一,占我国猕猴桃种植面积的80%～90%[1]。猕猴桃被誉为“维生素C之王”,含有丰富的糖、鞣质、果胶、葡萄糖酸以及钾、钙、锌等微量矿物质元素,因其营养丰富,酸甜可口而备受消费者青睐[2-3]。猕猴桃加工成鲜切产品不仅方便食用,而且可提高其附加值[4]。然而,鲜切水果经修整、去皮、切割等加工处理后,其生理衰老、营养损失、风味下降等进程加速,果实表面也更易被微生物侵染,大大缩短了货架期,同时可能导致食源性疾病的发生[5]。
常用于鲜切水果的杀菌保鲜技术可分为热杀菌和非热杀菌。热杀菌技术包括巴氏杀菌、瞬时高温灭菌、适度热处理结合其他杀菌方式等,这类杀菌方法在处理鲜切水果时会因为产热而破坏果蔬中的热敏性营养成分并且影响风味[6-7]。而非热杀菌技术则能有效保证鲜切水果原有的色、香、味及营养成分,且杀菌效果良好,已成为果蔬保鲜杀菌研究领域的热点。其中,低温等离子体(cold plasma, CP)作为新兴的非热杀菌保鲜技术,具有杀菌效果好、破坏性小、不产生有毒有害物质、短时无残留等优点,主要是利用由气体分子电离所形成的一种包括自由电子、带电离子、原子、原子团和分子等组成的正负电荷总量相等的离子化气状混合物,其中包括多种活性物质,如活性氧、自由基、紫外光子等,对食品的表面及内部进行杀菌,从而达到延长货架期的目的[8-10]。与常规的紫外杀菌技术相比,CP处理可有效抑制细菌生长,对食品的杀菌效果更好,品质影响更小[11]。
目前,低温等离子体技术在果蔬保鲜领域的应用研究较为广泛。研究发现,CP处理可使鲜切猕猴桃片在一定贮藏期内保持良好的保鲜效果,并延长货架期,经CP处理后,不同的贮藏温度也会对鲜切猕猴桃片的某些品质特性(色差、脆性、维生素C含量及菌落总数)产生显著影响,并且可以利用品质指标和菌落总数建立货架期预测模型[12-13]。RAMAZZINA等[14]研究表明,冷等离子处理可以有效延缓鲜切猕猴桃的腐败时间。王照琪等[15]采用介质阻挡放电(dielectric barrier discharge, DBD)、滑动电弧放电2种不同等离子体放电技术处理鲜切猕猴桃,结果发现2种处理对鲜切猕猴桃均有良好的保鲜效果。TAPPI等[16]发现CP处理后,哈密瓜、菊苣切片等样品的储存时间明显延长,且其品质及外观变化甚可忽略。LI等[9]利用60 kV的CP处理鲜切火龙果300 s,发现样品中的好氧菌数显著降低,同时该处理促进了火龙果中的酚类物质积累及抗氧化活性的提高。低温等离子体是一种有效抑制鲜切果蔬中微生物生长繁殖,提高其贮藏品质并延长货架期的杀菌保鲜技术,该技术发展迅猛,市场应用潜力巨大,但有关低温等离子体对鲜切猕猴桃片微观结构影响的研究仍较鲜见[17]。因此,本研究以鲜切猕猴桃片为材料,研究DBD低温等离子体的处理电压及时间对鲜切猕猴桃片微观结构及理化特性的影响,进一步丰富了CP技术用于鲜切猕猴桃片杀菌保鲜的理论研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海沃德猕猴桃,陕西周至。三氯乙酸、乙二胺四乙酸二钠、邻苯二酚、NaOH标准溶液、草酸、抗坏血酸、醋酸、愈创木酚、邻苯二酚、Na2HPO4、NaCl、无水CH3COONa、NaH2PO4等,上海沪试国药集团化学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BK130/36低温等离子体,美国PHENIX科技有限公司;U-5100可见光分光光度计,日本HITACHI公司;CS-210精密色差仪,杭州彩谱科技有限公司;Mira 3 XH场发射高分辨扫描电子显微镜,捷克TESCAN公司;Q150T ES PLUS高真空离子溅射镀膜仪,英国QUORUM公司。
1.3 实验方法
1.3.1 猕猴桃样品预处理
选取成熟程度一致、大小相近且表面无机械损伤、无病虫害的猕猴桃若干个,清洗表面后去除表皮,切成厚度约为10 mm的猕猴桃片。将猕猴桃片装入保鲜盒,每盒90 g左右,每盒4片,放一层,然后用PE自封袋包装。
1.3.2 低温等离子体处理
将预处理猕猴桃片分为对照组和处理组,对照组不作任何处理,将处理组进行CP处理,条件为:40 kV 90 s、40 kV 120 s、50 kV 90 s、50 kV 120 s。将所有组置于4 ℃冰箱冷藏以模拟超市真实贮藏环境,每天取样测定鲜切猕猴桃片的各项指标,每个指标重复测定3次,共测定7 d。
1.3.3 指标测定
1.3.3.1 菌落总数
参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》测定。
1.3.3.2 微观结构观察
参照TAGLIENTI等[18]的方法进行测定。样品首先用体积分数1%的锇酸溶液固定1～2 h,倒掉固定液,用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗3次,每次15 min。用梯度浓度(30%、50%、70%、80%、90%和95%,体积分数)的乙醇溶液对样品进行脱水处理,每种浓度处理15 min,再依次用100%的乙醇和纯丙酮分别处理20 min。最后将脱水样品喷金(电流15 mA,喷金30 s),上机测试(测试电压5 kV,工作距离10 mm),得到反映试样表面形貌的二次电子图像。
1.3.3.3 亮度测定
参考SELCUK等[19]的方法,用色差仪(CS-210)测量鲜切猕猴桃片的L*值。
1.3.3.4 失重率测定
参照吴琼[20]的方法测定,每天测量对照组和处理组样品的质量,测量前使用吸水纸吸去散失在表面以及盒子上的水分,失重率(W)的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:m,试验当天质量,g。
1.3.3.5 可滴定酸(titratable acid, TA)测定
参照侯莹等[21]的方法:称取50 g鲜样研磨后离心,取3 mL上清液加5 mL蒸馏水,再滴加3～4滴酚酞溶液,用1 g/L NaOH溶液进行滴定,至出现淡红色,记下NaOH溶液的用量,重复测定3次。
1.3.3.6 pH值测定
参照AZADBAKHT等[22]的方法,用PHS-3C精密pH计测定,每组平行测定3次。
1.3.3.7 可溶性固形物含量(soluble solid content, SSC)测定
参照PAULAUSKIENE等[23]的方法测定。每组样品混合打浆后于5 000 r/min离心5 min,取上清液测定2个平行,每个处理重复4次。
1.3.3.8 维生素C含量测定
参考曹建康等[24]的方法,用紫外可见分光光度计在243 nm处测定吸光度值,重复测定3次。
1.3.3.9 丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量测定
参照曹建康等[24]的方法,略微修改,5 g样品用20 mL三氯乙酸(50 g/L)均质。在95 ℃加热15 min后,快速冷却,12 000 r/min离心15 min。在450、532、600 nm处测定其吸光度值,重复3次。
1.3.3.10 多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)及过氧化物酶(peroxidase, POD)活性测定
参照文献[25-26]的方法并加以改进,用6 mL 100 mmo1/L(pH 7.8)(内含1.0 mmo1/L EDTA、50 g/L PVP、10 mL/L Triton X-100)的磷酸缓冲液,提取上清液。PPO采用磷酸盐缓冲液2 mL(pH 6.8)、100 mmo1/L 4-甲基邻苯二酚1 mL和上清液2 mL进行测定;POD采用0.5 mL上清液、2.9 mL磷酸缓冲液(pH 6.8)、1 mL体积分数0.08%H2O2和2 mL体积分数0.1%愈创木酚进行测定。
1.4 统计分析
所有数据平行测定3次,结果表示为平均值±标准差,利用Excel统计数据,SPSS对数据进行差异显著性分析(显著水平为P<0.05),Origin 2018软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片菌落总数的影响
如图1所示,在整个贮藏期间,对照组鲜切猕猴桃片的菌落总数呈显著增长的趋势(P<0.05),各处理组样品的菌落总数显著低于对照组(P<0.05)。贮藏第1天,对照组样品的菌落总数为2.54 lg CFU/g,经不同电压和时间的CP处理(40 kV 90 s、40 kV 120 s、50 kV 90 s、50 kV 120 s)后,各处理组样品的菌落总数依次下降了0.28、0.43、0.59、0.52 lg CFU/g。贮藏末期(第6天),对照组样品菌落总数高达5.94 lg CFU/g,接近果蔬产品菌落总数的最低限值(6 lg CFU/g)[4],而不同处理组的菌落总数值在第7天时仍远远低于该限值,分别为5.38、5.33、4.52、4.51 lg CFU/g。可见不同条件的CP处理对鲜切猕猴桃片均有一定的杀菌作用,能够最大限度地延长鲜切猕猴桃片的货架期。
图1 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片菌落总数的影响
Fig.1 Effect of cold plasma treatment on the total number of colonies of fresh-cut kiwifruit slices
注:大写字母不同表示同一处理在不同贮藏时间内有显著差异;小写字母不同表示不同处理在相同贮藏时间内有显著差异(P<0.05)(下同)。
2.2 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片亮度和失重率的影响
鲜切猕猴桃片亮度常用L*值的变化表示,该值可以表征果实的褐变程度。由图2-a可知,在贮藏期间,所有样品的L*值均有所减小。其中,对照组样品L*值下降幅度最大,小于各处理组,7天内从64.31降至55.49;贮藏第7天,对照组L*值显著小于所有的处理组(P<0.05)。L*值越小表明鲜切猕猴桃片色泽越暗淡,这可能是因为CP处理可抑制POD、抗坏血酸过氧化物酶及叶绿素降解酶活性,减缓叶绿素降解,从而减小亮度损失,使得处理组L*值更高[13]。陈月圆等[12]同样采用低温等离子体处理鲜切猕猴桃片,L*值的变化趋势与本研究大致相同。这些研究结果说明CP处理能够明显改善鲜切猕猴桃片的褐变,有效延缓色泽变暗,但不同的处理电压及时间对样品亮度无显著性影响(P>0.05)。
a-L*;b-失重率
图2 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片亮度和失重率的影响
Fig.2 Effect of cold plasma treatment on L* value and weight loss rate of fresh-cut kiwifruit slices
由图2-b可知,整个贮藏期间,所有组别样品的失重率均呈现逐渐上升趋势,对照组鲜切猕猴桃片的失重率明显上升且高于处理组。果实采后贮藏期间仍进行呼吸作用等新陈代谢活动,不断消耗能量,导致果实质量减少,而经CP处理后,鲜切猕猴桃片的呼吸作用受到抑制,使得水分散失减少,因而处理组样品的失重率低于对照组[27]。贮藏至第4天,40 kV 120 s、50 kV 90 s和50 kV 120 s处理组的失重率均为0.5%。贮藏末期(第7天),处理组鲜切猕猴桃片的失重率显著低于对照组(P<0.05),其中,相同处理电压,不同处理时间的组别之间呈现显著性差异(P<0.05)。随着处理时间的延长,鲜切猕猴桃片的失重率不断上升,与任翠荣等[28]研究在常压低温等离子体处理下,不同处理时间草莓失重率变化的结果相似。总的来说,在50 kV电压下处理90 s更有利于减少果实损伤并抑制其失重率增加。
2.3 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片TA含量、pH值、SSC含量的影响
TA是衡量果实营养品质的指标之一,会影响果实的食用风味[29]。从整体看,所有组别样品的TA含量随着贮藏时间的延长而逐渐降低。TA主要由多种有机酸构成,随着果实成熟度增加,有机酸分解,导致TA含量下降,有机酸的降解速率可反映其呼吸作用的强弱[30]。由图3-a可知,贮藏前5 d,对照组TA含量呈显著降低趋势(P<0.05),在此期间TA不断分解为呼吸作用供能,后期有所回升,可能是因为鲜切水果具有代谢活性,在贮藏过程中依然进行着新陈代谢活动[31]。贮藏结束时,处理组样品TA含量显著高于对照组(P<0.05),50 kV 90 s和120 s处理组的TA含量变化趋势与40 kV 90 s处理组相似,它们在贮藏后期均略高于40 kV 120 s处理组。这表明CP处理能较有效地延缓果实TA含量的下降,保持较好的风味和可食用性。
a-TA;b-pH;c-SSC
图3 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片TA含量、pH值和SSC含量的影响
Fig.3 Effect of cold plasma treatment on TA content, pH value, and SSC content in fresh-cut kiwifruit slices
测定贮藏过程中果蔬的pH值变化对研究其各项指标有着重要的意义,TA下降会表现为水果pH值上升[32]。如图3-b所示,整个贮藏期内,所有组别鲜切猕猴桃片的pH值不断升高。贮藏末期,各处理组pH值显著小于对照组(P<0.05),其中50 kV 90 s处理组的pH值最低,但各处理组间差异不明显。结合TA的变化趋势可知,50 kV处理90 s可有效抑制有机酸分解,维持TA,减缓pH值升高。总的来看,CP处理可以一定程度上延缓鲜切猕猴桃片pH值的升高。
SSC不仅是果实风味的重要影响因素,也是呼吸代谢的主要底物,SSC含量的变化能反映果实的衰老情况[33]。由图3-c可知,整个贮藏期间,所有组别鲜切猕猴桃片的SSC含量基本呈上升趋势。可能是因为随着贮藏期延长,鲜切猕猴桃片的成熟程度增加,呼吸代谢增强,淀粉分解为单糖,果实软化,导致SSC含量上升[31]。经CP处理的样品SSC含量大多高于对照组,且基本维持在较稳定水平,其中50 kV 90 s处理组的SSC含量一直高于其他各组样品,表明CP处理有助于维持果实中SSC含量的稳定,有可能是由于CP处理过程中产生的活性氧对猕猴桃的呼吸具有抑制作用,因而减缓了SSC含量的变化[13]。
2.4 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片维生素C和MDA含量的影响
如图4-a所示,贮藏期间,所有鲜切猕猴桃片的维生素C含量均呈现下降趋势,但经CP处理鲜切猕猴桃片的维生素C含量在贮藏期内各阶段都显著高于对照组,这与陈月圆等[12]的研究结果相似。40与50 kV处理鲜切猕猴桃片均能延缓果实中维生素C含量下降,经50 kV低温等离子体处理90 s后,鲜切猕猴桃片维生素C含量显著高于其他试验组(P<0.05),贮藏7 d后其维生素C含量高出对照组56.67 mg/100 g。任翠荣等[28]研究发现一定范围内的CP处理时间与电压对草莓中的维生素C有良好的保护作用,能够降低其中维生素C含量的损失,与本试验结果相似。CP处理能够减少贮藏期间鲜切猕猴桃片维生素C含量的损失,50 kV 90 s的CP处理最有利于维持维生素C含量,维生素C含量越高,表明果蔬越新鲜,其抗氧化能力越强,果实的营养品质可能也更佳。
a-维生素C;b-MDA
图4 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片维生素C和MDA含量的影响
Fig.4 Effect of cold plasma treatment on VC and MDA content in fresh-cut kiwifruit slices
MDA是组织膜脂过氧化产物,其含量高低是衡量组织衰老水平的重要指标[34]。由图4-b可知,未经CP处理的鲜切猕猴桃片在贮藏期间的MDA含量呈现迅速上升趋势,显著高于其他各组(P<0.05),这说明CP处理能够有效延缓鲜切猕猴桃片膜脂氧化,有助于维持细胞膜的通透性,保持其抗氧化能力。但处理电压相同,处理时间延长会使CP处理产生的活性物质与鲜切猕猴桃片接触过久,破坏细胞的膜结构,从而产生不良品质变化。本实验结果表明,50 kV 90 s条件下,CP处理能够保护鲜切猕猴桃片的膜结构,减少MDA的累积,与其他各组相比效果显著(P<0.05)。
2.5 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片PPO和POD活性的影响
PPO是植物中广泛存在的催化酚类物质氧化的酶类,其活性的增加是果实内部组织开始走向衰老的重要特征[35-36]。图5-a表明,各处理组鲜切猕猴桃片PPO活性的变化趋势基本一致,前3 d呈现显著地快速上升趋势(P<0.05),随后均有所下降,在贮藏后期又有所回升,这应该是因为鲜切猕猴桃片步入衰老期,对外抵抗下降,导致PPO活性增加[35]。贮藏后期(6～7 d),经CP处理鲜切猕猴桃片的PPO活性均显著低于对照组(P<0.05),表明CP处理能够在一定程度上延缓鲜切猕猴桃片的衰老,其中处理条件为50 kV 90 s时,鲜切猕猴桃片贮藏期间的PPO活性变化更为稳定。
a-PPO;b-POD
图5 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片PPO
和POD活性的影响
Fig.5 Effect of cold plasma treatment on PPO and POD activity in fresh-cut kiwifruit slices
POD是植物在逆境条件下酶促防御系统产生的一种关键酶,其作用是清除细胞内的活性氧,同时能避免活性氧在植物体内的产生和积累[36]。如图5-b所示,5组鲜切猕猴桃片的POD活性基本呈先上升后下降的趋势,可能是在贮藏前期(1～5 d),随着贮藏时间的增加,鲜切猕猴桃片中的H2O2增多,细胞膜脂质过氧化,低浓度的H2O2刺激POD活性增强,而贮藏后期(5～7 d),H2O2积聚更多,浓度升高,从而抑制了POD活性[37]。从整体来看,处理组鲜切猕猴桃片的POD活性低于对照组,应该是CP处理所产生的活性粒子,清除了鲜切猕猴桃片体内所产生的H2O2,延缓了细胞衰老,从而更有助于降低POD活性[13]。
2.6 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片微观结构的影响
利用扫描电子显微镜对不同CP处理鲜切猕猴桃片的微观结构进行观察。由图6-a和图6-b可知,贮藏第1天,对照组鲜切猕猴桃片的微观结构较为平整,而CP处理后的样品内部组织出现了轻微的褶皱。随着贮藏期延长至第7天,与对照组相比,处理组鲜切猕猴桃片的微观结构略微粗糙,褶皱程度变高。这可能是因为CP处理一定程度上导致了细胞结构的损伤,使鲜切猕猴桃片的细胞膜破裂,溶质流失,从而产生了些许褶皱[38]。此外,依图6-c和图6-d所示,在贮藏初期,所有组鲜切猕猴桃片中的淀粉颗粒表面光滑饱满,贮藏至第7天时,淀粉颗粒干瘪或形态不完整,与对照组相比,CP处理组样品中的淀粉颗粒整体变化差异不大,但随着CP处理时间的增加,淀粉颗粒更加干瘪。可能是因为随着贮藏时间的增加,淀粉颗粒原本就发生了不同程度的消化和破碎,这是淀粉降解的痕迹,而CP处理时间的延长可能也在一定程度上加速了淀粉的降解[39]。结合鲜切猕猴桃片的L*值、MDA含量变化以及PPO、POD活性的变化趋势,可以看出,CP处理对鲜切猕猴桃片的理化性质有较好的维持作用,因此虽然CP处理对鲜切猕猴桃片的微观结构有一定的影响,但总体来看影响不大。总之,在贮藏期间,CP处理时间的增加会对鲜切猕猴桃片的微观结构产生一定影响,而不同处理电压对其影响较小。由此可知,适当的CP处理对鲜切猕猴桃片的微观结构和形态影响不大。
a-贮藏1 d,比例尺100 μm;b-贮藏7 d,比例尺100 μm;c-贮藏1 d,比例尺20 μm;d-贮藏7 d,比例尺20 μm
图6 低温等离子体处理对鲜切猕猴桃片微观结构的影响
Fig.6 Effect of cold plasma treatment on microstructure in fresh-cut kiwifruit slices
3 结论
本文研究了贮藏期间,不同电压及时间CP处理对鲜切猕猴桃片的微观结构及相关理化特性的影响,得出以下结论:
随着贮藏时间的延长,CP处理对鲜切猕猴桃片有较好的杀菌作用,有效延长了鲜切猕猴桃片的货架期,同时鲜切猕猴桃片的失重率、pH值、SSC以及MDA含量呈上升趋势,而L*值、TA和维生素C含量减少,PPO、POD活性则呈先上升后下降的趋势。随着CP处理时间的增加,鲜切猕猴桃片的失重率,MDA含量不断上升,维生素C含量有所下降;而不同CP处理电压对果实理化特性的影响较小。利用SEM观察鲜切猕猴桃片的微观结构和形态,发现随着贮藏时间的增加,果实内部组织出现少许褶皱,淀粉颗粒因降解而发生消化或破碎,与对照组相比,CP处理未对鲜切猕猴桃片的微观结构及形态产生严重影响,造成损伤,合适的CP处理可基本维持其形态结构的完整。
对样品的微观结构和理化特性变化进行综合分析发现,鲜切猕猴桃片经50 kV电压处理90 s后杀菌效果较好,微观结构所受影响较小,维生素C含量最高且显著高于对照组(P<0.05),且MDA含量、PPO和POD活性变化也较平缓。因此,利用适当时间和电压的CP处理鲜切猕猴桃片,对于减缓其产品品质的劣变、延长货架期具有重要意义。本研究为CP技术应用于鲜切猕猴桃片及其他鲜切果蔬的贮藏保鲜提供了理论支撑,同时为鲜切果蔬新型贮藏保鲜技术的研发提供了参考。
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