六六六是一种广谱的有机氯杀虫剂,由于其生产工艺简单、价格便宜,在20世纪60～80年代曾在我国大量生产和使用。六六六化学结构稳定,降解速率慢[1],由于其毒性高,具有长期残留、生物蓄积及长距离迁移等特性,给生态环境和人类健康带来极大威胁[2],我国于1983年停止了它在农业上的使用。然而尽管六六六已经被禁用近40年,但大量研究表明部分地区的土壤、水体及食品中仍维持一定的残留水平[3-9]。残留在环境中的六六六,不仅会造成环境污染,还能通过食物链富集作用,给人类健康带来危害[10]。因此准确测定食品中六六六的残留量,对食品安全控制具有重要意义。
目前关于六六六检测方法的研究较多,其不确定度评定多采用气相色谱法进行分析检测[11-14],应用QuEChERS前处理方法,使用气相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定六六六的不确定度评定未见相关报道。本研究依据CNAS—GL006《化学分析中不确定度的评估指南》和JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》,基于GB 23200.113—2018 《食品安全国家标准 植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》测定果汁中4种六六六的残留量,评定实验结果的不确定度,以期为检测结果的正确判定提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
α-六六六溶液标准样品、β-六六六溶液标准样品、γ-六六六溶液标准样品、δ-六六六溶液标准样品(质量浓度均为1 000 μg/mL),农业农村部环境保护科研监测所;乙腈、乙酸乙酯(色谱纯),德国默克公司;QuEChERS试剂盒,美国安捷伦公司;有机相微孔滤膜(0.22 μm),上海安谱实验科技股份有限公司;市售果汁。
1.1.2 主要仪器设备
7890A/7000C三重四级杆气质联用仪,美国安捷伦公司;ME203E电子天平,梅特勒托利多科技(中国)有限公司;MD200-2氮吹仪,杭州奥盛仪器有限公司;TGL-20C高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂;SCI-VS可调式混匀仪,美国Scilogex公司;移液器(100 μL、1 mL和5 mL),德国Eppendorf公司。
1.2 实验方法
1.2.1 基质标准系列工作曲线配制
100 μg/mL标准储备溶液:准确移取1.0 mL α-六六六溶液标准样品(1 000 μg/mL)至10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配制成100 μg/mL标准储备溶液。同法配制β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的标准储备溶液。
1 μg/mL混合标准溶液:分别移取4种六六六标准储备溶液100 μL至10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配制成1 μg/mL混合标准溶液。
基质标准系列工作溶液:分别精确移取0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、2.5 mL 1 μg/mL混合标准溶液至10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配制成5、10、50、100、200、250 ng/mL的标准系列工作溶液。将果汁空白基质溶液氮气吹至近干,加入1 mL相应浓度的标准溶液复溶,用微孔滤膜过滤后得到基质标准系列工作溶液。
1.2.2 样品前处理
将供试品摇匀,称取10 g(精确至0.01 g)至离心管中,依次加入10 mL乙腈、QuEChERS萃取盐包和1颗陶瓷均质子,盖上管盖涡旋振荡混匀后离心。吸取6 mL上清液加至QuEChERS净化管中,涡旋振荡混匀后再次离心。准确吸取1 mL上清液于1.5 mL EP管中,40 ℃条件下N2吹至近干,加入1 mL乙酸乙酯复溶后过膜用于测定。
1.2.3 加标样品制备
称取6份果汁空白样品各10 g,分别精密加入1 μg/mL混合标准溶液0.5 mL,其余步骤同1.2.2节样品前处理。
1.2.4 气相色谱及质谱条件
色谱柱HP-5ms(30 m×250 μm×0.25 μm);载气为高纯氦气,1 mL/min;进样口温度280 ℃;进样方式为脉冲不分流;进样量1 μL。升温程序:柱温90 ℃保持1 min,以30 ℃/min升温至170 ℃,再以6 ℃/min升温至200 ℃,保持2 min,再以30 ℃/min升温至300 ℃,保持11 min。传输线温度300 ℃;溶剂延迟3 min;离子源温度250 ℃;电子轰击源70 eV;检测方式为多反应监测;多反应监测条件见表1。
表1 四种六六六的多反应监测条件
Table 1 Multi reaction monitoring conditions of 4 kinds of BHC
组分保留时间/min定量离子对(m/z)碰撞能量/eV定性离子对(m/z)碰撞能量/eVα-六六六8.093218.9>183.05216.9>181.05β-六六六8.658181.0>145.015216.9>181.05γ-六六六8.806181.0>145.015216.9>181.05δ-六六六9.377216.9>181.05181.0>145.015
1.3 不确定度评定数学模型
试样中待测组分残留量按公式(1)计算。
(1)
式中:X,试样中待测组分残留量,mg/kg;C,实验测得的待测组分质量浓度,ng/mL;V,样品溶液定容体积,mL;m,样品质量,g;10,样品质量折算系数;1 000,浓度换算系数。
2 不确定度来源分析
综合分析样品检测过程及不确定度评定数学模型,GC-MS/MS法测定果汁中六六六残留量的不确定度主要来自于标准溶液配制过程、样品溶液(包括样品称量、样品溶液定容及测定)、分析仪器的测量重复性、方法回收率和标准曲线的线性拟合。
3 不确定度各分量评定
3.1 配制标准溶液引入的不确定度ur,C
3.1.1 标准溶液标准值引入的不确定度
查阅标准样品证书,4种六六六标准溶液的质量浓度标准值均为1 000 μg/mL,扩展不确定度分别为1.30、1.00、1.30、1.30 μg/mL(k=2),由标准溶液标准值引入的相对不确定度分别为:
3.1.2 配制标准系列工作溶液引入的不确定度
100 μg/mL标准储备溶液、1 μg/mL混合标准溶液和基质标准系列工作溶液配制时使用1 mL移液器、100 μL移液器、5 mL移液器和10 mL容量瓶(A级),各类量器的容量允差、测量重复性和温度变化造成的溶液体积变化是不确定度的主要来源[15]。根据JJG 196—2006 《中华人民共和国国家计量检定规程 常用玻璃量器》和JJG 646—2006 《中华人民共和国国家计量检定规程 移液器》,各类量器引入的相对标准不确定度数据见表2。由于配制4种六六六标准系列工作溶液的方法步骤相同,故对于4种六六六该分量引入的不确定度相同。
表2 标准溶液配制过程中各类量器引入的不确定度
Table 2 Uncertainty introduced by locomotive pipette and volumetric flask in the preparation of standard solution
量具使用体积(使用次数)容量允差引入的相对标准不确定度测量重复性引入的相对标准不确定度温度变化引入的相对标准不确定度容量误差计算式ur,允差测量重复性计算式ur,重复温度波动计算式ur,温度合成相对标准不确定度u2r,允差+u2r,重复+u2r,温度100 μL移液器1 mL移液器5 mL移液器10 mL容量瓶(A级)50 μL(1)0.50%0.50%/30.002 891.30%1.30%/30.007 51100 μL(2)0.10%0.10%/30.000 580.50%0.50%/30.002 890.5 mL(1)0.20%0.20%/30.001 150.20%0.20%/30.001 151.0 mL(4)0.10%0.10%/30.000 580.30%0.30%/30.001 732.5 mL(1)0.50%0.50%/30.002 890.10%0.10%/30.000 5810 mL(8)0.009 mL0.009/6/100.000 370.016 mL0.016/6/100.000 65±5 ℃5×1.38×10-330.003 980.008 980.004 950.004 300.004 380.004 950.004 05
按公式(2)计算标准工作溶液配制过程中引入的不确定度。
(2)
综合以上2个分量,标准系列溶液配制引入的不确定度ur,C按公式(3)计算。
(3)
可得ur,C-α=0.019 52,ur,C-β=0.019 52,ur,C-γ=0.019 52,ur,C-δ=0.019 52。
3.2 样品溶液引入的不确定度ur,样
3.2.1 样品称量引入的不确定度ur,m
样品称量的不确定度主要由电子天平最大允许误差引入。根据天平检定证书,得到其最大允差为±0.005 g,依据均匀分布计算
0.000 29。
3.2.2 样品溶液定容引入的不确定度ur,V
待测样品使用移液器吸取1 mL乙酸乙酯定容,不确定度主要由测量重复性、最大允差和温度波动引入。由移液器检定证书得到测量重复性为0.3%,最大允许误差为±0.1%,以均匀分布处理
可得
根据移液器检定规程JJG 646—2006,检定在室温20 ℃条件下进行,定容时溶液温度一般为(20±5) ℃,定容使用乙酸乙酯作为溶剂,其体积膨胀系数为1.38×10-3/℃,由温度变化产生的体积变化为±(1×5×1.38×10-3)mL=±0.006 9 mL,以均匀分布处理,
由样品溶液定容引入的不确定度如公式(4)所示,相对不确定度如公式(5)所示。
uV
=0.004 38 mL
(4)
(5)
3.2.3 测量重复性引入的不确定度ur,X
平行制备6份加标样品进行测定,实验结果见表3。重复测定引入的相对不确定度代入公式(6)[16]计算。
表3 加标样品重复测量结果
Table 3 Repeated determination results of spiked samples
编号称样量/gα-六六六β-六六六γ-六六六δ-六六六检测质量浓度/(ng/mL)回收值/(mg/kg)检测质量浓度/(ng/mL)回收值/(mg/kg)检测质量浓度/(ng/mL)回收值/(mg/kg)检测质量浓度/(ng/mL)回收值/(mg/kg)110.02048.639 20.048 548.161 10.048 148.481 80.048 448.216 20.048 1210.01347.807 70.047 747.106 20.047 047.606 80.047 546.845 80.046 8310.01446.267 60.046 246.211 80.046 147.245 80.047 247.085 80.047 0410.01147.231 30.047 245.555 10.045 545.615 10.045 645.695 20.045 6510.01248.276 20.048 247.481 90.047 447.682 20.047 646.235 40.046 2610.00446.875 40.046 945.188 10.045 246.178 50.046 245.078 00.045 1平均值47.516 20.047 546.617 40.046 647.135 00.047 146.526 10.046 5标准偏差0.890.000 881.160.001 141.060.001 041.110.001 08
(6)
式中:S(X),待测组分回收值的标准偏差;
待测组分回收值的平均值。
可得:
综合以上3个分量,样品溶液测定引入的相对不确定度代入公式(7)计算。
(7)
可得:
3.3 仪器引入的不确定度ur,仪
仪器引入的不确定度按均匀分布处理
根据GC-MS/MS检定证书得到仪器的测量重复性为
3.4 方法回收率引入的不确定度ur,R
根据6份加标样品的平均回收率
和回收率的标准偏差S(R),按公式(8)、公式(9)[14,17]分别计算回收率引入的不确定度uR和相对不确定度ur,R。依据公式(10)计算t值,利用t检验判断加标回收率R与100%之间的差异是否显著[16],结果见表4。
表4 回收率结果
Table 4 Results of recovery
组分R/%S(R)/%uR/%ur,RtPα-六六六94.911.760.7170.007 557.10显著β-六六六93.122.270.9280.009 977.41显著γ-六六六94.152.070.8460.008 996.91显著δ-六六六92.942.170.8850.009 527.98显著
(8)
(9)
(10)
当置信度为95%,n-1=5,查阅t值临界值分布表得t(0.05,5)=2.571,t>t(0.05,5),说明要将回收率代入公式(1)对检验结果进行校正。
3.5 标准曲线拟合引入的不确定度ur,Q
测定基质标准系列工作溶液,得到基质标准曲线测量数据,见表5。平行制备6份加标样品进行添加回收试验,样品测定结果见表3。
表5 标准曲线测量结果
Table 5 Results of standard curve
根据标准曲线测量数据,依据公式(11)[18-19]计算标准溶液峰面积残差的标准差。
(11)
式中:n,基质标准系列工作溶液的测定次数(n=6)。
依据公式(12)[18-19]计算标准曲线拟合引入的标准不确定度。
(12)
式中:S,标准溶液峰面积残差的标准差;b,标准曲线的斜率;p,样品溶液平行测定次数,6;n,标准曲线浓度点测定次数,
待测组分检测质量浓度的平均值,
基质标准系列工作溶液质量浓度的平均值,102.5 ng/mL;Ci,基质标准系列工作溶液的实测质量浓度,ng/mL。
标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为
详细结果见表6。
表6 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度
Table 6 Relative standard uncertainty introduced by standard curve fitting
组分SbC/(ng/mL)(C-Ci)2∑ni=1(Ci-Ci)2uQ/(ng/mL)ur,Qα-六六六59 939.259 594.421 26047.516 23 023.218 2651 295.797 853.912 780.082 35β-六六六46 434.327 383.729 32646.617 43 122.864 9851 835.741 383.945 290.084 63γ-六六六47 813.137 381.643 79947.135 03 065.283 2251 946.528 084.057 200.086 08δ-六六六36 872.295 154.136 07646.526 13 133.077 4852 856.866 224.482 540.096 34
4 不确定度的合成及扩展
4.1 合成相对标准不确定度
根据公式(13),代入上述各不确定度分量,计算4种六六六的相对标准不确定度,结果见表7。
表7 六六六不确定度评定结果
Table 7 Uncertainty evaluation in determination of BHC
组分urU/(mg/kg)检测结果(k=2)/(mg/kg)α-六六六0.085 750.008 60.047 5±0.008 6β-六六六0.088 420.008 80.046 6±0.008 8γ-六六六0.089 600.009 00.047 1±0.009 0δ-六六六0.099 590.010 00.046 5±0.010 0
(13)
4.2 测量结果的扩展不确定度
根据公式(14),计算4种六六六的扩展不确定度,结果见表7。
(14)
5 结论
GC-MS/MS法测定果汁中六六六残留量的不确定度主要来源于标准曲线拟合,其次是标准系列工作溶液配制引入的不确定度,样品前处理过程、仪器设备和方法回收率引入的不确定度较小。因此,实验时可以根据待测样品农药残留的情况选择适宜的标准曲线浓度点,拟合标准曲线时可以调整标准曲线的权重为1/x,能显著提高低浓度点的定量准确性。在配制标准溶液时,要选择合适的稀释方法,检验人员应选用适宜的量器,并正确使用各类量具,同时定期对量具及仪器设备进行检定校准,以减小测定结果的不确定度。
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