热处理对乳清蛋白原料起泡性、理化特性的影响及关系研究

婴儿配方奶粉的主要成分为蛋白质、乳糖、脂肪、维生素以及矿物质,当无法母乳喂养时,婴儿配方奶粉在婴儿身体生长、智力发育、激素调节中发挥重要作用[1]。然而,在冲调过程中产生的大量泡沫会降低婴儿配方奶粉的稳定性,婴幼儿调节横膈膜的神经尚未发育完善,这会导致婴儿吸入空气后引起胀气、吐奶等症状[2]。婴儿配方奶粉起泡性问题受到了越来越多的关注。

婴儿配方奶粉成分复杂,蛋白质、脂肪、游离脂肪酸均可能影响起泡性[3-4]。其中,蛋白质是婴幼儿配方粉中产生气泡的主要成分。作为两亲性分子,蛋白质中的疏水基团使其能自发地吸附于气-水界面,蛋白吸附层的形成导致界面张力降低,有利于泡沫的形成和稳定[5]。婴儿配方奶粉中含量最多的蛋白是乳清蛋白,在加工过程中主要的乳清蛋白来源为脱盐乳清粉(demineralized whey powder, DW)、浓缩乳清蛋白(whey protein concentrate, WPC)[6]。其中脱盐乳清粉可根据盐分的脱除程度进一步分类,D70和D90分别指灰分脱除程度为70%和90%,在婴儿配方奶粉加工过程中较为常用。目前,已有许多研究讨论不同蛋白的起泡特性,如大豆蛋白、蛋清蛋白等[7-8]。然而,对不同的乳清蛋白起泡性研究较为缺乏。此外,作为婴幼儿配方粉加工过程中常见的操作单元,加热处理会改变蛋白的结构、理化性质以及起泡特性[9]。乳清蛋白中主要组成为α-乳球蛋白以及β-乳白蛋白,作为球状蛋白,随着温度的升高非共价键被破坏,结构开始展开,最初的展开是可逆的;当长时间在高于变性温度(70 ℃)的条件下时,其二级和三级结构发生不可逆的破坏,促进分子间疏水相互作用以及聚集的形成[10]。研究表明,当热处理温度高于60 ℃时,乳清蛋白的起泡能力发生变化,且不同的加热温度以及时间对其起泡特性有显著影响[11-12]。目前结合实际生产条件探究不同加热处理对乳清蛋白起泡性影响的研究比较有限。

因此,本文首先比较D70、D90、WPC起泡特性差异,并采用光谱技术、激光衍射等技术表征并比较了婴儿配方粉加工过程中常见的热处理,包括均质(50～60 ℃ 30 min)、浓缩(50 ℃ 10 min)、杀菌(80 ℃ 20 s)对乳清蛋白结构、理化特性和起泡特性的影响,通过皮尔逊相关性分析考察起泡特性和结构性质之间的关系,以期为提高婴儿配方粉品质提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱盐乳清粉D70(12.6%蛋白,82.1%乳糖,0.7%脂肪,1.1%水分,2.6%灰分),法国红鸟;脱盐乳清粉D90(13.5%蛋白,83.0%乳糖,0.3%脂肪,2.1%水分,0.8%灰分),荷兰DOMO;浓缩乳清蛋白WPC(78.5%蛋白,7.02%乳糖,4.53%脂肪,4.31%水分,4.93%灰分),美国Hilmar公司;8-苯胺-1-萘磺酸(8-aniline-1-naphthalene sulfonic acid,ANS)、5,5-二硫-双2-硝基苯甲酸,Sigma公司。本试验使用的分析试剂均为分析级试剂。

1.2 仪器与设备

C-MAG HS 7 digital型磁力搅拌器、Ultra Turrax T25型高速剪切机,德国艾卡IKA公司;Zetasizer nano ZS纳米粒度及Zeta电位仪,英国马尔文公司;紫外分光光度计,中国普析通用仪器有限公司;Chirascan型圆形二色光谱仪,英国应用光物理公司;F-7000型荧光分光光度计,日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不同加热处理乳清蛋白的制备

在室温条件下用去离子水溶解D70、D90及WPC,蛋白质量浓度统一为10 mg/mL,在转速为700 r/min 条件下混合2 h,将溶液置于4 ℃过夜水合。溶液恢复至室温后,在50 ℃ 10 min、50 ℃ 30 min、80 ℃ 20 s水浴加热,迅速利用冰水浴冷却至室温,得到D70、D70 50 ℃10 min、D70 50 ℃ 30 min、D70 80 ℃ 20 s;D90、D90 50 ℃ 10 min、D90 50 ℃ 30 min、D90 80 ℃ 20 s;WPC、WPC 50 ℃ 10 min、WPC 50 ℃ 30 min、WPC 80 ℃ 20 s。

1.3.2 起泡能力和泡沫稳定性测定

根据文献[13]方法测定起泡能力和泡沫稳定性。将D70、D90、WPC用去离子水溶解,蛋白质量浓度统一为10 mg/mL,溶液体积为50 mL。利用高速剪切机10 000 r/min搅打2 min,分别记录搅打后0 min和30 min后的体积为V1、V30。按照公式(1)、公式(2)计算起泡能力以及泡沫稳定性:

1.3.3 粒径和电位的测定

根据文献[14]方法对样品的粒径和电位进行测定。溶液首先用去离子水稀释至1 mg/mL,然后进行粒径和电位的测定。设定溶剂的折光系数为1.33,平衡时间为120 s。粒径用体积平均直径(D43)表示。

1.3.4 蛋白质溶解度及浊度测定

浊度为紫外分光光度计测定溶液(2 mg/mL)在633 nm处的吸光度。对于溶解度的测定,将蛋白溶液质量浓度稀释至0.5 mg/mL,在10 000 r/min离心15 min,取上清液及蛋白溶液,以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)为标准蛋白,用Bradford法测定溶解度。蛋白质溶解度的计算如公式(3)所示:

1.3.5 蛋白质二级结构测定

利用圆二色光谱仪测定蛋白质的二级结构变化。将蛋白溶液(0.1 mg/mL)置于0.1 cm石英比色皿中,在190～260 nm内扫描得到CD光谱,带宽为1 nm。二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲)含量通过系统自带软件进行计算。

1.3.6 巯基含量的测定

游离巯基含量的测定采用SHENG等[15]的方法。将5 mg/mL的蛋白溶液与2.5 mL Tris-甘氨酸缓冲液和Ellman试剂混合,在室温下反应15 min后测定412 nm处吸光度。游离巯基按照公式(4)进行计算:

式中:OD412为样品在412 nm处的吸光度;D为稀释倍数;C为蛋白浓度。

1.3.7 表面疏水性的测定

以1-苯胺-8-萘磺酸(1-aniline-8-naphthalene sulfonic acid,ANS)为荧光探针测定样品的表面疏水性[16]。将20 μL ANS(8.0 mmol/L, pH 7.0)加入到质量浓度为0.5 mg/mL,体积为4 mL的样品中。用荧光分光光度计扫描得到荧光光谱,条件设置为:激发波长370 nm,发射波长400～700 nm,激发和发射狭缝5 nm,PMT电位为600 V,以最大荧光强度作为疏水性指数,标记为H0。

1.4 统计分析

样品的各指标均测定3次,数据以平均值±标准偏差(standard deviation,SD)表示。试验数据通过分析软件SPSS 19.0进行单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),P<0.05表示存在显著性差异。采用二元线性相关中的Pearson相关分析来确定发泡性能与其他理化性能之间的相关性。本试验结果图使用Origin 2021 b软件绘制。

2 结果与分析

2.1 乳清蛋白起泡特性比较

由图1可以看出,3种乳清蛋白的起泡能力和泡沫稳定性存在显著差异(P<0.05),起泡能力大小依次为D70(95.62±6.90)%、D90(73.98±10.99)%、WPC(60.39±9.07)%,泡沫稳定性大小依次为D70(65.02±0.71)%、D90(24.47±3.89)%、WPC(13.91±4.77)%。与WPC相比,D70和D90的起泡能力和泡沫稳定性较高,这可能是由于D70和D90样品中乳糖含量较多。糖类的添加会增加表观黏度,从而抑制泡沫析出,提高泡沫稳定性[17]。此外,与D70和D90相比,WPC中脂肪含量较高可能是WPC泡沫稳定性较低的原因之一。在KAMATH等[4]的研究中,全脂牛奶与脱脂牛奶相比泡沫由于聚结而出现更高的破裂程度,这可能是脂肪不能形成黏弹性界面层稳定泡沫。

2.2 加热处理对乳清蛋白起泡特性和结构性质的影响

2.2.1 加热处理对乳清蛋白起泡特性的影响

图2为加热处理对乳清蛋白起泡能力和泡沫稳定性的影响。在不同加热处理下,D70起泡能力略微。上升,泡沫稳定性略微降低,与对照组相比不存在显著差异,表明不同程度的加热对D70的起泡能力和泡沫稳定性影响较小。在D90中,不同加热处理后样品的起泡能力与对照组相比无显著差异。在泡沫稳定性方面,与其他3组相比,80 ℃ 20 s处理样品泡沫稳定性显著提高(P<0.05),与对照组相比提高50%,说明80 ℃ 20 s对D90的泡沫稳定性产生较大影响。在WPC对照组中,起泡能力和泡沫稳定性分别为(60.39±9.07)%、(11.25±1.77)%,随着热处理温度的增加、时间的延长,WPC的起泡能力和泡沫稳定性提高。经80 ℃ 20 s处理,起泡能力和泡沫稳定性为(78.82±11.10)%、(29.37±3.46)%,与对照组相比分别提高了30%、62%,说明不同加热处理对WPC起泡能力和泡沫稳定性存在影响,其中80 ℃ 20 s影响最大。D70和D90与WPC相比,在加热条件下起泡特性变化较小可能是乳糖的存在能够抑制蛋白变性,保持蛋白的结构稳定,因此对起泡特性影响较小[18]。

2.2.2 加热处理对乳清蛋白粒径大小的影响

加热处理对乳清蛋白粒径影响如图3所示。加热处理导致样品的粒径减小,这可能是由于加热使蛋白分子展开,疏水基团的暴露导致水层降低,从而水动力半径减小。与对照组相比,经80 ℃ 20 s处理后D70(262 nm)、D90(209 nm)、WPC(249 nm)的粒径降低至241、193、226 nm。经80 ℃ 20 s粒径最小可能与达到蛋白变性温度,蛋白分子结构展开程度高有关。ZHANG等[9]在对乳清蛋白进行加热时得到类似结果,发现乳清蛋白未加热样品的平均粒径显著大于热处理样品。粒径大小与蛋白质在气-水界面的吸附行为有关。本研究中,与对照组的大颗粒相比,加热后乳清蛋白颗粒变小有利于向气-水界面快速移动。

2.2.3 加热处理对乳清蛋白电位的影响

如图4所示,与对照组相比,D70和D90样品经热处理电位值不存在显著差异,在WPC中,热处理使WPC电位值显著降低(P<0.05)。加热处理后的乳清蛋白样品具有更高的电位绝对值,可能的原因是加热使蛋白中的电荷发生重排,更多的电荷暴露出来,从而具有更高的电位绝对值[19]。此外,与D90和WPC样品相比,D70样品的电位绝对值低于30 mV。蛋白较低荷绝对值能降低界面静电势垒,促进分子快速吸附于气-水界面,从而促进发泡性能[20],这可能解释了D70的高起泡特性。

2.2.4 加热处理对乳清蛋白溶解度及浊度的影响

加热处理对乳清蛋白的溶解度无显著影响(图5)。经过热处理,溶解度出现轻微降低,这可能是由于乳清蛋白中的主要成分是β-乳球蛋白,作为球状蛋白,在热处理时结构易展开,疏水基团暴露,导致溶解度降低[21]。

在本研究中,浊度的变化与溶解度呈相反趋势(图6),样品浊度随着溶解度的降低而升高。在D70、D90和WPC中,80 ℃经20 s处理样品浊度最大,与对照组相比分别提高了17%、12%、17%。浊度的提高可能是由于乳清蛋白热稳定性较差,加热时巯基暴露并在二硫键作用下聚合。当加热温度超过60 ℃后,乳清蛋白分子变性,进一步展开形成聚合物,温度的增加使得乳清蛋白的聚合程度逐步增强,因此浊度增加。

2.2.5 加热处理对乳清蛋白二级结构的影响

由图7和表1可以看出,经过不同的加热处理,D70、D90、WPC样品的峰形相似,样品主要二级结构相似,但是不同的加热处理后蛋白的二级结构改变,80 ℃ 20 s处理二级结构变化最大。与对照组相比,加热处理后无规则卷曲结构含量提高,在D70中,无规则卷曲含量从36.5%增至36.9%;在D90中,无规则卷曲含量从35.9%增至38.7%;在WPC中,无规则卷曲含量从34.1%增至34.9%。二级结构含量变化会影响起泡能力,无规则卷曲结构含量提高表明蛋白二级结构从有序变为无序,构象柔韧性提高,柔韧的分子结构有助于改善发泡性能[22]。

2.2.6 加热处理对乳清蛋白巯基含量的影响

游离巯基是影响蛋白质性质的重要因素,能够反应蛋白质空间构象变化程度(图8)。与对照组相比,在加热的条件下样品的游离巯基显著提高(P<0.05)。在3个乳清蛋白样品中,80 ℃ 20 s组与对照组相比游离巯基含量增加最多,这可能与加热处理使乳清蛋白原先位于内部的巯基暴露以及二硫键的断裂有关。本研究结果与房天琪[23]研究结果相似,即加热处理使乳清蛋白游离巯基含量显著增加,构象也发生改变。

2.2.7 加热处理对乳清蛋白表面疏水性的影响

表面疏水性在蛋白质泡沫的形成和稳定中发挥重要作用,表面疏水性的增加有利于蛋白质分子快速扩散到气-水界面,促进蛋白质在界面上的吸附、扩散和重排。如图9所示,经过热处理后乳清蛋白的表面疏水性出现不同程度的升高,经过80 ℃ 20 s处理,D70和WPC的表面疏水性显著高于对照组(P<0.05)。表面疏水性的提高是由于加热处理使乳清蛋白分子展开,β-乳球蛋白等球状蛋白的展开使原本位于内部的疏水基团暴露[24]。乳清蛋白经过加热处理后的表面疏水性大小趋势与起泡能力一致,说明表面疏水性的提高可能是导致起泡性提高的重要原因。

2.3 相关性分析

通过皮尔逊相关性分析进一步探究乳清蛋白起泡特性与理化、结构特性之间的关系(图10)。Zeta电位与起泡能力及泡沫稳定性呈正相关(0.78/0.69),电位绝对值的降低能够降低界面处静电屏障,促进蛋白在气水界面处的吸附,从而改善起泡能力[20]。α-螺旋与起泡能力和泡沫稳定性呈负相关(-0.81/-0.84),而β-转角(0.82/0.67)和无规则卷曲结构含量(0.74/0.60)与起泡特性呈正相关,说明二级结构含量在起泡特性中起到重要作用。表面疏水性与起泡能力呈正相关(0.67/0.46),起泡特性的提高可能与样品较高的表面疏水性有关,较高的表面疏水性降低了蛋白质在气-水界面的界面能垒,从而增强蛋白质形成泡沫的能力[25]。综上,电位值、β-转角和无规则卷曲、α-螺旋结构含量以及表面疏水性与蛋白的起泡特性呈显著相关。这说明蛋白的起泡特性主要受其表面性质(表面电荷量及表面疏水性)、空间结构(蛋白分子的柔性)影响。

3 结论

本试验确定了3种乳清蛋白起泡特性的差异,探讨了不同加热处理对乳清蛋白起泡能力和理化性质的影响。D70、D90、WPC的起泡能力和泡沫稳定性存在显著差异(P<0.05),D70的起泡能力和泡沫稳定性最高,其次为D90、WPC。在模拟不同加热条件下,3种乳清蛋白起泡能力均出现不同程度的提高,粒径、电位、二级结构、空间构象也发生一定的改变,其中80 ℃,20 s处理对乳清蛋白起泡能力和理化特性影响最大。皮尔逊相关性分析表明起泡能力的提高可能是由于加热过程分子展开,无规则结构含量提高,表面疏水基团的暴露。研究结果表明,需要进一步进行控制变量试验来说明乳清蛋白中组成成分对样品发泡性能的影响。

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