叶酸(又称为维生素B9)是一种在人体细胞分裂增殖及新陈代谢中发挥重要作用[1-2]的水溶性维生素[3]。动物肝脏和绿叶蔬菜含有十分丰富的天然叶酸[4]。叶酸缺乏可引起一系列的不良症状,如细胞性贫血[5-6]、骨关节炎、粒细胞减少[7]。叶酸含量还与新生儿神经管畸形有关[8-10],含量过低可导致新生儿出生缺陷发生率上升[11],如泌尿道缺陷、肢体缩短缺陷、唇腭裂、先天性心脏病[12-14]。孕妇在怀孕期间一般需要补充叶酸[15-17],缺乏可引起早产[18-19]、流产[20]、妊娠期糖尿病[21]等不良妊娠反应。过量补充叶酸同样会引起并发症[22],影响人体对锌的吸收,下一代易代谢异常[23]、患自闭症[24-25]。因其具有特殊的功能,市场上出现很多添加叶酸的食品,其中最普遍的是婴幼儿配方乳粉。检测婴幼儿配方乳粉中叶酸含量是否符合国家标准是保障食品安全的重要工作。
目前,叶酸检测技术主要为微生物法、超高效液相色谱-质谱/质谱法、光学生物传感器法[26]。微生物法多用于测定低叶酸含量的食品;超高效液相色谱-质谱/质谱法检测范围较小,仅可测定单一组分的叶酸含量;光学生物传感器法被列入美国官方分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)的推荐方法。国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission,CAC)、欧盟和美国将微生物法作为叶酸检测的首选方法和仲裁方法[27],我国在测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量使用微生物法。
我国现行标准中生物法检测叶酸含量存在检测周期长、操作过程繁琐的缺点。其中测定用菌株需经过提前培养、多次传代、冰箱保存多个步骤,易引起菌株的污染、变异[28]。冷冻保存菌株直接使用的方式操作简单方便,制备后即用即取可长期保存,在保证检测结果准确的基础上降低实验人员的工作量[27]。目前针对叶酸检测用冻存菌株研究较少,本文在GB 5009.211—2022标准的基础上,通过验证保护剂对菌株的使用效果制备定量菌株。为更加便捷快速检测婴幼儿配方乳粉中叶酸含量,本研究制备叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 材料与试剂
MRS培养基、TSA培养基,北京陆桥技术有限责任公司;无水乙醇、甲酸、乙腈,天津科密欧化学试剂有限公司;SRM 1869叶酸质控样品[含量范围(223.9±8.6) μg/100 g],美国NIST。
鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus(ATCC 7469),中国食品药品检定研究院。
1.1.2 仪器与设备
AdVantage Pro真空冷冻干燥机,美国SP Scientific公司;UV-2700紫外分光光度计,日本岛津公司;MIR-254低温恒温培养箱,日本SANYO公司;ME204 电子天平,美国METTLER TOLEDO公司;3K15 台式离心机,日本Sigma公司。
1.2 实验方法
1.2.1 叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株制备及检测
1.2.1.1 制备过程
将鼠李糖乳杆菌标准菌株接种于MRS培养基,36 ℃培养24 h;菌苔刮取到灭菌生理盐水中,振荡混匀,将麦氏浊度仪测得保护剂数据归零,保护剂中滴加菌液,直至麦氏浊度为2.5 MCF;向西林瓶滴加50 μL 加入保护剂的菌悬液,放入真空冷冻干燥机。待样品充分干燥后取出,密封压盖存放。
1.2.1.2 冻干基质筛选
在真空冷冻干燥过程中,为了减少细胞损伤,人们通常会使用冻干保护剂。保护剂种类繁多,由于菌株本身特性不同因而对保护剂种类和使用量具有偏好性。本实验分别配制 100、150、200 g/L质量浓度的脱脂乳粉,对应不同质量浓度的蔗糖(50、100、150、200 g/L)按照冻干工艺将试验菌株进行冷冻干燥,测定存活率,比较不同浓度比例的保护剂效果。冻干存活率按公式(1)计算:
(1)
式中:R1,冻干存活率,%;a0,冷冻干燥前活菌数,CFU/mL;a1,冷冻干燥后活菌数,CFU/mL。
1.2.1.3 冻干工艺筛选
真空冷冻干燥技术是在真空状态下,利用升华原理,使冻结的水分不经过冰的融化直接以冰态升华为水蒸汽而除去的干燥法。由于冷冻干燥机对不同物质干燥效果不同,现对冻干工艺进行筛选。将50 μL菌悬液滴入加有液氮的西林瓶中,放入冷冻干燥机,按照以下程序设置:
方法A:设置程序预冻-40 ℃ 120 min;冷冻干燥-25 ℃ 360 min,真空度(Vac)130 mTorr,-10 ℃ 120 min,Vac 130 mTorr;最终维持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 状态。
方法B:设置程序预冻-40 ℃ 120 min;冷冻干燥-30 ℃ 360 min,Vac 130 mTorr,-20 ℃ 1 200 min,Vac 130 mTorr;最终维持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 状态。
方法C:设置程序预冻-40 ℃ 120 min;冷冻干燥-35 ℃ 480 min,Vac 130 mTorr -30 ℃ 360 min,Vac 130 mTorr;最终维持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 状态。
方法D:设置程序预冻-40 ℃ 120 min;冷冻干燥-25 ℃ 480 min,Vac 130 mTorr;-10 ℃ 120 min,Vac 130 mTorr;最终维持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 状态。
1.2.1.4 计数方法
将未开启的冻干菌株放置至室温,开启前用酒精擦拭铝塑盖和胶塞。放入10 mL无菌水中,稀释到合适浓度,倾注适量TSA培养基,放置于36 ℃培养箱24 h,计数。
1.2.2 稳定性研究
1.2.2.1 运输条件模拟实验
取叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株随机分成2份,其中一份放入37 ℃培养箱,另一份放入25 ℃培养箱。分别在第0、1、3、5、7、14天计数,并作3个平行实验。
1.2.2.2 贮存条件模拟实验
取叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株随机分成2份,其中一份放置于4 ℃冰箱,另一份放置于-20 ℃冰箱,分别在贮存0、1、3、5、7、14、28 d计数,并作3个平行实验。复苏率按公式(2)计算:
(2)
式中:R2,复苏率,%;nx,第x天菌量,CFU/mL;n0,第0天菌量,CFU/mL。
1.2.3 均匀性研究
随机抽取叶酸检测鼠李糖乳杆菌定量菌株10瓶,每瓶中加入1 mL生理盐水,溶解混匀,使用全自动微生物螺旋加样系统在E50模式下涂布于TSA平板,每个样品做2个平行。(36±1) ℃培养24 h。对结果进行统计分析,评价均匀性。
1.2.4 质控样品验证
质控样品按照GB 5009.211—2022前处理,将贮存于-20 ℃环境中28 d叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株加1 mL无菌水,混匀,制得菌液加入培养基中混匀使用,对同一质控样品测试6次叶酸含量测试,测试检验效果。
2 结果与分析
2.1 冻干基质筛选结果
由表1可知,按照质量浓度150 g/L脱脂乳粉、100 g/L蔗糖比例的保护剂冻存效果最好,存活率为94%,可选为后续实验冻干保护剂。
表1 脱脂乳粉和蔗糖保护剂冻干存活率
Table 1 Lyophilized survival rate of skim milk powder and sucrose protectant
脱脂乳粉质量浓度/(g/L)蔗糖质量浓度/(g/L)50100150200100827890821507994897620078718375
2.2 冻干工艺筛选结果
按照方法A、B、C、D依次冻存菌球,按照A、B、C方法冻存的菌球,形状不规则,外表湿润,颜色暗淡,不能满足实验要求,其中 A、B冻干的小球,因冷冻干燥时间不够,水分不能完全析出,在室温条件下有复溶现象,按照C方法冻存的小球中间为黏性。而按照方法D所冻菌球形状为圆形,外表干燥且内部为干粉,可以满足实验要求。通过对不同冷冻条件的筛选,最终确定了冻干工艺为:预冻-40 ℃ 120 min;冷冻干燥-25 ℃ 480 min,Vac 130 mTorr;-10 ℃ 120 min,Vac 130 mTorr;最终维持在-20 ℃,Vac 130 mTorr 状态。
2.3 稳定性检测结果
2.3.1 运输稳定性试验结果
由表2可知,在37 ℃环境中叶酸检测鼠李糖乳杆菌定量菌株随着贮存时间加长菌落数量有轻微变化,3次平行结果相差较小,14 d内能保持稳定。在25 ℃环境中叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株随着贮存时间加长菌落数量变化更小,3次平行结果相差较小,14 d内能保持良好稳定性。比较2种温度最终结果,25 ℃环境中保存比37 ℃环境中保存更接近最初菌落数,所以高温环境可采用泡沫箱加冰袋运输,常温环境可直接运输。
表2 叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株模拟运输 条件实验结果(n=3)
Table 2 Test results of simulated transport conditions for quantitative strains of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection(n=3)
贮存时间/d鼠李糖乳杆菌数量/(106 CFU/mL)37 ℃25 ℃09.50±0.089.50±0.0819.8±0.039.6±0.0639.2±0.099.3±0.1358.7±0.139.0±0.0578.9±0.098.8±0.03148.6±0.078.9±0.09
2.3.2 贮存稳定性试验结果
由表3可知,-20 ℃环境下贮存28 d复苏率为96.84%,样品稳定性良好,根据以往制备经验,在-20 ℃条件下可以保存长达18 个月;4 ℃环境下,贮存28 d复苏率为89.47%,可以作为短期贮存条件。
表3 叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株模拟贮存 条件实验结果(n=3)
Table 3 Test results of simulated storage conditions for quantitative strains of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection (n=3)
贮存时间/d4 ℃-20 ℃鼠李糖乳杆菌数量/(106 CFU/mL)复苏率/%鼠李糖乳杆菌数量/(106 CFU/mL)复苏率/%09.50±0.089.5±0.0819.00±0.1294.74±9.569.00±0.1294.74±6.08310.10±0.09106.32±10.259.70±0.08102.11±9.75511.20±0.13117.89±11.8010.20±0.10107.37±10.2677.60±0.1180.00±8.257.80±0.0782.11±9.63148.80±0.1092.63±11.359.40±0.1298.95±4.58288.50±0.0989.47±7.329.20±0.0996.84±7.45
2.4 均匀性检测结果
对10瓶样品进行检测结果如表4所示,检测结果相差较小。使用SPSS软件,采用单因素方差分析方法,对样品的均匀性进行检验,结果如表5所示,FINV(0.05,9,10)临界值=3.02,根据 SPSS 软件计算的结果F=0.179 表4 十瓶叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株计数结果 样品编号样品中鼠李糖乳杆菌/(106 CFU/mL) 19.509.0829.308.9038.809.7049.808.6058.709.1069.209.5079.309.5089.608.90 98.809.70109.409.00 表5 叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株均匀性试验结果 平方和df均方F显著性组间348 980 000 000.0009387 755 555 55.556组内216 820 000 000 0.00010216 820 000 000.0000.1790.992总数251 718 000 000 0.00019 由表6可知,测同一质控样品6次结果均在含量范围(223.9±8.6) μg/100 g内,平均值为225.11 μg/100 g,相对标准偏差为2.11%,说明叶酸检测用鼠李糖乳杆菌定量菌株重复性良好,实验结果可靠,可以满足婴幼儿乳粉中叶酸含量的测定需求。 表6质控样品叶酸含量检测结果 稀释倍数称样量/g含量/(μg/100 g)平均含量/(μg/100 g) 相对标准偏差/%1 0000.200 2225.561 0000.205 6230.081 0000.204 2220.74225.112.111 0000.200 4218.161 0000.202 0224.471 0000.203 8231.63 在我国食品安全国家标准中,微生物法是唯一的测定婴幼儿乳粉中叶酸含量的方法。新版国标增加微孔板测定方法,培养体积按比例缩减,节省实验品消耗,减少人员工作量,但并未对菌株的使用做进一步优化。现行标准中实验菌株培养时间长,步骤繁琐,极易造成菌株的污染、变异,影响检测结果的准确性。对鼠李糖乳杆菌定量菌株进行运输模拟实验和贮存模拟实验的结果显示,随着时间的延长菌落数量变化较小,可知其稳定性良好;单因素方差分析方法结果F [1] ALVES J O, DA SILVA FRAGA N, FIDELES M C, et al. 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Table 4 Quantitative strain count results of 10 bottles of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection
Table 5 Test results of quantitative homogeneity of Lactobacillus rhamnosus for folic acid detection
2.5 质控样品叶酸含量检测结果
Table 6 Results of folate assay for quality control samples
3 结论