花椒(Zanthoxy lumbungeanum)是一种芸香科(Rutaceae)植物[1],主要分为青花椒和红花椒两大品种。因其具有食药两用的功效,被广泛用于烹饪调料和中药配料[2]。中国是世界花椒第一生产大国,具有丰富的资源[3-4],种植历史非常悠久。
花椒通常被加工成花椒油进行市场销售,一定程度上减少了花椒加工及贮藏过程中香气成分逸散,能够较好地避免花椒香气逸散导致品质下降的问题。现代仪器分析技术为花椒油关键香气成分解析和研究提供了基础数据参考和技术支持。陈丽兰等[5]采用GC-MS等技术,鉴定出14种不同花椒油中芳樟醇、乙酸芳樟酯、苯乙酸甲酯、γ-松油烯、水芹烯等为关键风味物质。倪瑞洁等[6]通过气相离子迁移谱联用仪(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)技术测定发现芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、柠檬烯等为韩城大红袍花椒的标志性差异物。SUN等[7]采用GC-MS技术鉴定芳樟醇、柠檬烯和乙酸芳樟酯等为花椒油中存在的主要香气活性物质,研究认为p-伞花烃、β-水芹烯、辛酸、香茅醇、乙酸辛酯和桧烯为关键风味物质。
近年来我国花椒产业发展迅速,花椒调味油类产品产量及销售大幅提升,市场产品品牌繁多,产品的质量差异较大。为了丰富市售花椒油香气特征的研究,目前,关于花椒油的相关文献报道主要集中在实验室研究方面,而对市售花椒油的香气特征研究较少。花椒油质量的高低很大程度上取决于花椒香气物质种类以及含量,也是不同种类花椒油产品的关键品质差异因素[8],开展市售红花椒油产品的香气特征研究,对于市面上花椒油类产品的质量评价和品质提升具有理论和实践意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
花椒油样品均为市场销售,根据红花椒油品牌市场占有率的调研结果,共筛选出12个红花椒油产品,产品品牌及原料信息如表1所示。大部分市售花椒油产品使用了四川花椒原料,原料油种类以菜籽油和植物油为主。1,2-二氯苯,上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。
表1 红花椒油样品信息
Table 1 Red Chinese pepper oil sample information
样品编号品牌名称花椒产区原料油种类H1麻得倒 四川汉源植物油H2万弗 四川汉源菜籽油H3友加 四川汉源植物油H4建华 四川汉源玉米油H5山之娇 四川汉源大豆油H6五丰黎红四川汉源菜籽油H7树上鲜 四川汉源植物油H8帅青 四川汉源菜籽油H9爱蜀味 四川汉源菜籽油H10蜀味坊 四川盐源植物油H11新黎红 河北涉县菜籽油H12长康 湖南岳阳大豆油+菜籽油
1.2 仪器与设备
ME204/02电子天平,梅特勒-托利多仪器上海有限公司;7890A-5975气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent科技公司;HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),四川汉源;固相微萃取进样针萃取头[DVB/CAR/PDMS)50/30 μm],美国SUPELCO公司;PC-420D磁力加热搅拌器,美国Corning公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品前处理
用电子天平准确称取红花椒油样品5.00 g,加入1 μL质量浓度为0.326 5 μg/μL的1,2-二氯苯溶液,置于20 mL顶空瓶中,并立即加盖密封,在65 ℃的温度下,恒温水浴20 min,接着在萃取30 min后,再将萃取头插入GC进样口进行时长为15 min的解吸附,每个样品重复测定3次[9]。
1.3.2 GC-MS检测参数及程序
固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)条件:萃取温度设置为恒定的65 ℃,水浴平衡时间设置为20 min,萃取时间保持30 min。
GC条件:进样口的温度设置为250 ℃,色谱柱为HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 mm);柱温设置为65 ℃,采用分流比20∶1进样;吹扫流量为1.5 mL/min。具体程序的升温条件:以25 ℃/min的速度升至90 ℃,保持1 min,以1 ℃/min升至105 ℃,保持2 min,以3 ℃/min至200 ℃,保持2 min,以30 ℃/min至250 ℃,保持2 min;
MS条件:检测器温度设置为230 ℃;传输线温度为280 ℃;质量范围为35～500 amu。
1.4 数据处理
1.4.1 GC-MS定性定量分析
通过对NIST14.0数据库检索及保留指数(retention index,RI)[10]的对比鉴定,化合物含量通过峰面积归一法进行分析,保留指数的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:n为碳数;
为保留在碳数n和n+1正构烷烃之间化合物的保留时间;
是碳数为n的正构烷烃的保留时间;
是碳数为n+1的正构烷烃的保留时间。
1.4.2 气味活度值(odor activity value, OAV)的计算
OAV可判断不同化合物在食品香气中的贡献度,通过风味物质的含量与其嗅觉阈值的比值计算得到[11],具体计算如公式(2)所示:
(2)
式中:Ci为化合物的含量,mg/kg;OTi为嗅觉阈值,mg/kg。
1.4.3 统计分析
采用Microsoft Excel软件对原始数据进行处理,SIMCA-P 11.5、Origin 8.0以及SPSS 19.0软件完成数据分析及作图。
2 结果与分析
2.1 红花椒油挥发性风味物质分析
采用GC-MS技术对红花椒油挥发性物质成分进行分析,12种市售红花椒油挥发性化合物的种类及含量均存在显著差异(P<0.05)。红花椒油挥发性风味成分总含量为757.2～3 132.79 mg/kg,共检出85种挥发性风味成分,烯烃类物质最多,有25种;醛类物质19种;醇类物质14种;酯类物质12种;酮类物质6种;其他类7种;酸类物质最少,仅有2种。热图将GC-MS分析得到的挥发性物质成分数据可视化处理,颜色由蓝色到红色代表化合物含量依次增加。图1表明挥发性物质成分中,烯烃类含量最高,主要挥发性物质有乙酸芳樟酯、桧烯、芳樟醇、月桂烯、柠檬烯、罗勒烯等。与高夏洁等[12]报道的高温制取红花椒油中特征香气物质为月桂烯、芳樟醇、桉叶油醇、柠檬烯、乙酸芳樟酯及ISELI等[13]报道的花椒中关键差异性物质为柠檬烯、乙酸芳樟酯、β-月桂烯、桧烯、芳樟醇等研究结果基本一致。
图1 红花椒油GC-MS测定结果热图
Fig.1 Volatile compositions heatmap of red Chinese pepper oil products measured by GC-MS
2.2 花椒油活性香气值分析
OAV对于食品香气研究具有重要的作用,通常以浓度和阈值2个维度来评价食品中挥发性物质在食品中的影响[14-15]。通常,OAV>1的香气化合物被认为对产品整体香气影响较大,其数值越大表明对香气影响越大[16]。查阅文献获取红花椒油中OAV>1的香气物质共计31种,香气物质的阈值、香气描述及OAV如表2所示。
表2 不同市售红花椒油特征香气物质阈值、香气描述及OAV
Table 2 Aroma substance threshold, aroma description, and OAV of different commercially available red Chinese pepper oil
香气成分及编号阈值/(mg/kg)香气描述OAVH1H2H3H4H5H6H7H8H9H10H11H12芳樟醇(G1)0.037花香、青香、木香、甜香6 5343 9452 25512 2387 9666 2729 27911 93018 62128 02917 80523 132α-松油醇(G2)0.33水果味、薄荷味7104193235131721221133(-)-4-萜品醇(G3)1.2----1562-3----283,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇(G4)0.1甜味-12----31---2220乙酸异丁酯(G5)0.5月季花香,水果香---27-755343乙酸芳樟酯(G6)1似芳樟、薰衣草等香精油的香气98119717060339046924921052238148乙酸松油酯(G7)2.5清香带甜、似柠檬、薰衣草气息-1--76422111苯乙酸甲酯(G8)0.1似蜂蜜的香气--13----18----乙醛(G9)0.1发酵味674981624715101413戊醛(G10)0.15油脂味、木香味---10-8--1721-10己醛(G11)0.85青草香-21343324344庚醛(G12)0.23青草、青瓜、柑橘----84--8-55正辛醛(G13)0.015香草味、橘子味---115--1911831881771411652-庚烯醛(G14)0.001油脂味、青草味-1 2206102 2204 5802 590-1 4705 8304 15003 630反,反-2,4-庚二烯醛(G15)0.1肉桂样的脂肪香245134-431368072148603473(E,E)-2,4-己二烯醛(G16)0.1柑橘样的甜香-15--255436-26036332-壬烯醛(G17)0.15肥皂、青草、水腥臭、黄瓜香-----7--10714-癸醛(G18)0.65橙皮味---------3--反式-2,4-癸二烯醛(G19)0.004脂肪-373278--968-450480240--乙酸(G20)0.33醋酸味72263225734441855222932桧烯(G21)0.98松节油6104119881071540134431150169β-蒎烯(G22)0.14松木香、树脂香3966537472327661896682月桂烯(G23)0.0445花香3 1622 6372 6124 6115 0167 20312 47810 1987 8464 2576 5167 533α-水芹烯(G24)0.036黑胡椒香、蔼荷香8845-212321214-106-383-220柠檬烯(G25)0.2柑橘香2031 6781 4912 8862 6283 8145 5164 8563 2603 5043 4694 380罗勒烯(G26)0.034甜香1161 2791 2711 9171 9282 8565 2814 4652 3751 3401 7043 100γ-松油烯(G27)1.4松节油42-13418351115517萜品油烯(G28)0.2有松木树脂、较温和的木香218-4410463503854613764(-)-α-蒎烯(G29)0.274香料---1-53-----R-(-)-香芹酮(G30)0.025留兰香味10245---126132-155-158-(Z)-芳樟醇氧化物(G31)0.32花香77-7-1412-2114179
注:-表示无。
由表2可知,12个花椒油中有10种共有的活性香气物质,9个花椒油中共有的活性香气物质共计16种。其中,2-庚烯醛、月桂烯、芳樟醇、罗勒烯、柠檬烯5种香气物质在大部分花椒油样品中OAV≥1 000,特别是芳樟醇、月桂烯等物质,在部分花椒油中的活性值达到近3万。乙酸芳樟酯、正辛醛、反式-2,4-癸二烯醛、α-水芹烯、R-(-)-香芹酮这5种香气物质在大部分花椒油样品中OAV范围为100
聚类分析可以根据样本数据特征进行分类,将相似度较高样品聚为一类[18],对12种红花椒油OAV通过系统聚类的方法进行分析,结果见图2。当设定距离为10时,12种红花椒油分为了三大类。其中,麻得倒、万弗、友加、建华、山之娇、五丰黎红(H1～H6)聚为一类;树上鲜、帅青(H7～H8)聚为一类;爱蜀味、蜀味坊、新黎红、长康(H9～H12)为一类。
图2 红花椒油OAV系统聚类分析
Fig.2 Cluster analysis of red Chinese pepper oil OAV system
2.3 红花椒油OAV的偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)分析
聚类分析属于无监督学习算法,主要用来说明样品的分类趋势,不易准确获取不同类别样品间的差异来源[19]。PLS-DA是有监督学习算法,可以实现样品间的类别预测,消除组内噪音,突出组间差异[20],但过拟合现象的出现会导致分析结果的差异,因此,需要置换检验来验证模型参数[21],如图3所示。
a-PLS-DA的模型参数;b-模型检验结果
图3 PLS-DA模型参数
Fig.3 Replacement test of PLS-DA model parameters
由图3可知,
且
表示该模型预测能力较好。采用200次响应的置换检验方法对模型进行验证,Q2与y轴的截距小于零,表明该模型未过拟合,模型稳定性和预测能力都比较高[22]。
变量重要性投影值(variable importance in project,VIP)通常用于PLS-DA模型中变量重要程度的评价。VIP值越高,表明该香气物质在花椒油样品类型判别和差异分析中越重要[20]。一般认为VIP>1.0的变量对样品的区分具有较高的贡献率。
由图4可知,有12种香气化合物的VIP>1,可以作为判别三类红花椒油特性香气化合物。分别为:正辛醛(G13)、芳樟醇(G1)、柠檬烯(G25)、桧烯(G21)、β-蒎烯(G22)、月桂烯(G23)、2-壬烯醛(G17)、己醛(G11)、罗勒烯(G26)、(Z)-芳樟醇氧化物(G31)、戊醛(G10)和乙酸异丁酯(G5)。
图4 红花椒油样品PLS-DA的VIP
Fig.4 VIP of PLS-DA of red Chinese pepper oil samples
Biplot图将得分图和载荷图结合在一起,可以说明每个变量在判别组间差异中的影响。以第一主成分为横坐标,第二主成分为纵坐标建立红花椒油和香气化合物相关性的Biplot图(图5)。
图5 不同红花椒油中挥发性香气成分的PLD-DA结果
Fig.5 PLD-DA results of volatile aroma components in different red Chinese pepper oil
注:G1-G31:香气化合物;H1-H12:12种红花椒油样品; 紫色为VIP>1的关键香气化合物。
由图5分析可知,树上鲜、帅青(H7～H8)红花椒油以月桂烯(G23)、罗勒烯(G26)、柠檬烯(G25)为主要关键差异性化合物,结合表2可知,月桂烯香气为花香,罗勒烯具有甜香,柠檬烯香气为柑橘香,乙酸异丁酯具有月季花香和水果香,正辛醛香气描述为香草味、橘子味,但此类样品与乙酸异丁酯(G5),正辛醛(G13)距离较远,因此,这类红花椒油主要表现为花香,柑橘香和甜香香气特征,具有较弱的水果香和香草味;芳樟醇(G1)、桧烯(G21)、β-蒎烯(G22)、(Z)-芳樟醇氧化物(G31)是爱蜀味、蜀味坊、新黎红、长康(H9～H12)这一类红花椒油的关键差异性化合物,结合表2可知,芳樟醇香气描述为花香、青香、木香、甜香,β-蒎烯香气描述为松木香、树脂香,桧烯香气描述为松节油,(Z)-芳樟醇氧化物香气描述为花香,因此,此类样品香气特点可描述为花香、青草香、松木香及树脂香;麻得倒、万弗、友加、建华、山之娇、五丰黎红(H1～H6)这一类红花椒油相对树上鲜、帅青(H7～H8),爱蜀味、蜀味坊、新黎红、长康(H9～H12)这两类红花椒油中的关键差异性化合物距离较远,表现出较弱的花香,水果香,青草香和松木香等香气特征。这12种市售不同红花椒油所用原料花椒产区基本为四川汉源,主体挥发性物质也大体一致,但是由于关键差异性化合物的不同会对样品分类产生影响,呈现不同香气特征。郝旭东等[23]对4个不同产区大红袍花椒的挥发性组分分析中,关键风味物质为芳樟醇、3-蒈烯、乙酸香叶酯和月桂烯,对大红袍花椒整体香气有较大贡献度,与本研究结果基本一致。蒲凤琳等[24]研究中发现月桂烯、柠檬烯、β-罗勒烯是四川汉源花椒的特征风味成分,与本研究结果一致。虽然市售不同花椒油原料产地相同,但是由于关键差异性物质的不同表现不同香气特征,对于不同红花椒油的关键香气物质差异及香气描述还有待进一步研究。
3 结论
本文以12个市售红花椒油为研究对象,采用HS-SPME-GC-MS技术进行挥发性风味物质测定,分析共有85种挥发性物质,结合OAV值确定特征香气成分有31种化合物。在对不同市售红花椒油分类后,经PLS-DA的VIP值对导致分类的关键差异性香气成分进行分析。以VIP>1进行筛选,芳樟醇、正辛醛、月桂烯、(Z)-芳樟醇氧化物、桧烯、β-蒎烯、柠檬烯、2-壬烯醛、罗勒烯、己醛、戊醛和乙酸异丁酯为关键香气物质。本文探讨了市售不同红花椒油由于关键差异性物质的不同,分成三大类,分别呈现不同的香气特征,在一定程度上为建立红花椒油香气成分图谱数据库特征香气提供理论数据支持,对市售花椒油综合加工开发产生深远影响。关于市售不同花椒油原料花椒产区,原料油种类等对花椒油香气类型差异的影响还有待进一步研究。
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