葡萄酒中含有1 000余种的复杂香气成分,而香气是评价葡萄酒感官品质的重要指标之一[1]。葡萄酒香气成分有3种不同的来源:葡萄中的香气成分(一类香气)、发酵过程中酵母代谢形成的物质(二类香气)和陈酿时产生的物质(三类香气)[2-3]。葡萄酒的发酵是将糖转化为乙醇和二氧化碳的同时产生次级代谢物[4-5],例如酯类、高级醇类、脂肪酸类、甘油、醛等,这些化合物之间复杂的相互作用决定了葡萄酒的香气品质和感官特征[6-7]。
探究葡萄酒在发酵过程中产生的香气成分与对应感官特征的变化规律,对调控发酵过程中的香气具有重要意义。代晨曦等[8]在赤霞珠干红葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程的动态变化中发现,酯类、醇类和酸类化合物是苹-乳发酵中的主要香气成分,在发酵过程中,酯类和酸类化合物的质量分数在增加,赋予葡萄酒浓郁的果香。郑明朋等[9]在霞多丽干白葡萄酒发酵过程的香气成分动态变化研究中发现,随着发酵的进行,香气成分总量、高级醇、脂肪酸以及类异戊二烯类物质含量均呈递增趋势,并在发酵结束时达到最大值。LU等[10]的研究发现,在马瑟兰干红葡萄酒发酵过程中,乙酸乙酯、己酸乙酯和香茅醇是发酵中重要的香气成分。
宁夏贺兰山东麓产区拥有生产优质葡萄酒得天独厚的地理条件,而赤霞珠是贺兰山东麓产区主要种植的红色酿酒品种[11],张众等[12]研究表明,在贺兰山东麓产区10个垂直年份赤霞珠干红葡萄酒香气成分以酯类物质为主,其次是醇类和酸类物质。孙丽君[13]在贺兰山东麓赤霞珠干红葡萄酒中筛选出丁酸乙酯、苯乙醇、乙酸异戊酯等25种关键香气成分,感官特征以红色水果、黑色水果、热带水果、清新花香、果酱和果脯为主。目前针对贺兰山东麓赤霞珠干红葡萄酒发酵完成后的香气成分特征研究较多,但是对于发酵过程中香气成分和感官特征动态变化规律的研究仍然存有空白。因此,本试验以贺兰山东麓产区赤霞珠葡萄为原料,在发酵过程中通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(head space-solid phase micro-extraction hyphenated with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)技术提取分析香气成分,组织成员进行感官品评,以阐明赤霞珠干红葡萄酒在发酵过程中香气成分与感官特征的动态变化规律,该试验不仅丰富了赤霞珠干红葡萄酒风味化学研究的理论基础,还为赤霞珠干红葡萄酒香气成分与感官特征的调控提供理论依据。
葡萄原料:赤霞珠于2021年10月1日采自宁夏回族自治区贺兰山东麓产区,还原糖含量287.5 g/L,可滴定酸含量(以酒石酸计)为5.93 g/L,pH值为3.56,卫生状态良好。
酿酒辅料:Excellence XR活性干酵母、Vinozym vintage FCE果胶酶、偏重亚硫酸钾,法国LAMOTHE ABIET公司。
试剂及标准品:氢氧化钠、亚硫酸氢钠、浓硫酸、氯化钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、邻苯二甲酸氢钾、氯化钠等(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司;C8~C20正构烷烃,美国Sigma-Aldrich公司;4-甲基-2-戊醇,日本TCI公司。
香气标准品:1-丙醇、2,3-丁二醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、正丁醇、1-癸醇、橙花醇、异辛醇、香叶醇、正庚醇、1-戊醇、异丁醇、香茅醇、己醇、(E)-2-已烯-1-醇、(Z)-2-己烯-1-醇、(Z)-3-己烯-1-醇、(E)-3-已烯-1-醇、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、乙酸己酯、己酸异戊酯、水杨酸甲酯、水杨酸乙酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸、丙酸、异戊酸、异丁酸、癸酸、癸醛、正辛醛、2,3-丁二酮、β-紫罗兰酮、苯酚、alpha-松油醇、糠醛,美国Sigma-Aldrich公司。
TU-1901型分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;雷磁pHS-3C型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;ME104E电子天平,瑞士METTLE公司;7890 B气相色谱-7000 D质谱仪、DB-WAX色谱柱(60 m×250 μm,0.25 μm),美国Agilent公司。
1.3.1 赤霞珠干红葡萄酒酿造工艺
葡萄采收后进行分选、除梗、破碎,转入20 L玻璃发酵罐中,在入料的过程中均匀加入果胶酶30 mg/L、偏重亚硫酸钾60 mg/L,室温下(18 ℃)浸渍1 d,浸渍结束后接种Excellence XR活性干酵母200 mg/L,酒精发酵温度25~27 ℃,酒精发酵期间每天压帽3次,每次1 min;发酵至残糖<4 g/L结束发酵,进行皮渣分离,将自流汁和压榨汁混合均匀,并补充SO2至60 mg/L;静置澄清后分离酒泥,进行理化指标检测;试验重复3次。
1.3.2 发酵过程中的取样
入料的当天开始取样,作为第0天,接种酵母为第1天,每天在同一时间点采样550 mL,直到发酵结束。
1.3.3 发酵过程中香气特征感官品评
采样结束后,立刻组织感官品评。感官品评小组由宁夏大学葡萄与葡萄酒学专业学生组成(女性10名,男性7名)。感官品评在标准品酒室(ISO 8589—1998)使用标准品酒杯(ISO 3591—1997)进行品鉴。感官特征词汇根据相关文献及品评小组成员共同讨论得出。感官评分采用0~10分制[14](0分:无此类香气;1~4分:微弱且较难分辨:5~9分:能分辨但不够强烈;10分:香气非常强烈)。
1.3.4 挥发性香气成分的测定
参照张众等[12]的方法利用HS-SPME-GC-MS技术对酒样中的挥发性香气成分进行提取分析,对有标品的香气成分用其标准曲线进行定量,没有标品的香气成分以化学结构相似的物质进行定量,并对其香气活性值(odor activity value, OAV)进行计算,如公式(1)所示:
香气活性值
(1)
1.3.5 数据统计分析
使用Microsoft Office 2010和IBM SPSS Statistics 23软件进行数据统计;使用Origin 2022软件进行绘图。
为了将赤霞珠干红葡萄酒的发酵阶段进行划分,将发酵时间进行聚类,把发酵过程分为4个时期:葡萄汁时期、发酵初期、发酵中期和发酵末期,如图1所示。
葡萄汁时期(0~2 d),这个时期能检测的香气成分较少,共有41种,包括11种高级醇类成分、6种类异戊二烯类成分、4种脂肪酸类成分和7种醛酮类成分,但随着发酵的进行,醛酮类成分含量逐渐降低,甚至检测不到。发酵初期(3~4 d),这个时期香气含量开始增加并生成新的成分:包括丁酸乙酯、癸酸甲酯、辛酸3-甲基丁酯、苯乙酸乙酯和癸酸3-甲基丁酯等。发酵中期(5~6 d),这个时期的香气成分含量与发酵初期相比降低,但丁酸乙酯、丁内酯、丁二酸二乙酯、棕榈酸乙酯、异丁醇等成分的含量略有增加。发酵末期(7~10 d),这个时期香气成分含量大幅度增加,包括丁酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯和月桂酸乙酯等14种酯类成分;苯乙醇、正己醇、苯甲醇和异戊醇等7种高级醇类成分;乙酸、辛酸和己酸3种脂肪酸类成分;香茅醇、里那醇和橙花叔醇3种类异戊二烯类成分。
由图1可知,在发酵的4个时期中均存在的香气成分有酯类、高级醇类、类异戊二烯类和脂肪酸类,但含量的变化趋势仍有不同。为进一步探究这四类成分中的主要香气含量在赤霞珠干红葡萄酒发酵过程中的动态变化,绘制主要香气成分含量堆积柱状图,如图2所示。
图1 赤霞珠干红葡萄酒发酵过程中时间聚类热图
Fig.1 Cluster heat map of aroma compounds during fermentation of Cabernet Sauvignon dry red wine
注:香气物质含量从蓝到红依次升高,仅在同一行进行对比。
a-酯类;b-高级醇类;c-类异戊二烯类;d-脂肪酸类
图2 赤霞珠干红葡萄酒发酵过程中主要香气成分浓度堆积柱状图
Fig.2 Bar chart of the accumulation of different aroma compounds during the fermentation of Cabernet Sauvignon dry red wine
图2-a是不同酯类成分含量堆积柱状图,酯类成分可以为葡萄酒带来重要的果香和花香的感官特征。在葡萄汁时期,酯类成分的总含量是最低,但在发酵初期时,酯类成分的总含量增加近10倍,丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯的含量增长速率最快;发酵中期时,酯类成分的总含量降低,但丁酸乙酯和乙酸异戊酯的含量仍在增加;发酵末期时,酯类成分的总含量增加并在第8天时达到最大值26 655.39 μg/L。
图2-b是不同高级醇类成分含量堆积柱状图,高级醇类成分有增加葡萄酒果香和花香复杂度的感官特征。酒样中高级醇类成分的总含量总体呈现增长趋势,葡萄汁时期含量最低,到发酵末期时总含量增加至最大。在所有高级醇类成分中,含量最高的是2,3-丁二醇和异戊醇,二者的含量占所有高级醇类成分含量的90%以上,为葡萄酒贡献了果香和奶油的感官特征。
图2-c是不同类异戊二烯类成分含量堆积柱状图,类异戊二烯类成分为葡萄酒贡献了柑橘类果香和花香的感官特征。随着发酵的进行,类异戊二烯类成分的总含量总体呈现波动增长趋势;发酵初期开始,香叶醇和香茅醇的含量在类异戊二烯类成分的总含量中占比最大,它们为葡萄酒贡献了柑橘水果和玫瑰花香的感官特征。
图2-d是脂肪酸类成分含量堆积柱状图,脂肪酸类成分在0.4~0.6 g/L时会为葡萄酒贡献奶酪、黄油等愉悦的感官特征[15]。在发酵的4个时期中,脂肪酸类成分的总含量基本保持稳定;葡萄汁时期存在反式-2-己烯酸,随着发酵的进行含量降低甚至检测不到。
不同种类香气成分浓度的变化会引起感官特征的变化,当香气成分的OAV>1时,才会对葡萄酒的感官特征产生影响,表1为赤霞珠干红葡萄酒发酵过程中OAV分析,为阐明赤霞珠干红葡萄酒在发酵过程中香气成分的变化会影响感官特征的变化,绘制赤霞珠干红葡萄酒在发酵过程中感官特征雷达图,如图3所示。
表1 赤霞珠干红葡萄酒发酵过程中OAV分析
Table 1 Content of types volatile and OAV analysis in Cabernet Sauvignon wine during the fermentation
物质名称CAS阈值[16-26]/(μg/L) 香气特征[16-26]OAV0 d1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d10 d乙酸己酯142-92-745苹果,茴香0.040.050.190.370.300.120.020.020.020.020.02丁酸乙酯105-54-435果香、草莓、青苹果0.000.000.001.714.204.645.876.547.019.038.89乙酸异戊酯123-92-2200香蕉,果香0.000.003.8550.3579.2449.4772.1488.0494.4988.1762.92己酸乙酯123-66-014草莓,青苹果0.000.001.0149.2146.0813.4323.7119.8426.7729.5825.72辛酸甲酯111-11-5200果香、柑橘、甜橙0.010.010.010.020.010.010.010.010.010.010.01辛酸乙酯106-32-1600菠萝,梨,花香0.110.110.311.732.101.111.602.532.192.371.94己酸异戊酯2198-61-050香蕉,果香0.090.090.090.170.170.110.120.140.120.120.12癸酸乙酯110-38-339脂肪,果香19.9119.9121.0528.0638.9227.6336.9043.8041.5640.7842.00壬酸乙酯123-29-51 300果香,玫瑰花0.010.010.010.010.020.010.010.020.020.020.02月桂酸乙酯106-33-21 500果香,花香,奶酪0.050.050.060.070.090.070.090.080.100.080.13丁二酸二乙酯123-25-115水果清香22.5722.4922.3359.1661.6366.659.0771.4951.0172.0557.69乙酸苯乙酯103-45-7250花香,桃子0.540.540.540.931.310.910.931.230.900.950.74棕榈酸乙酯628-97-71 500苹果,菠萝,奶油,蜡香0.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.02异戊醇123-51-330 000香蕉,果香0.000.000.444.7910.1312.3714.2717.2617.8018.2117.18异丁醇78-83-175 000轻甜,醇香0.000.000.000.430.530.901.370.931.751.791.79正丁醇71-36-3150 000清新醇香0.000.000.000.000.000.000.010.010.010.010.023-甲基-1-戊醇589-35-51 000辛辣,青草0.000.000.000.000.050.090.110.210.160.200.15己醇111-27-38 000辛辣,青草0.140.140.170.120.140.120.110.170.130.160.132,3-丁二醇513-85-9120 000果香,奶油0.210.210.2112.9125.6233.8825.6946.1248.7373.3744.56顺-2-己烯-1-醇928-94-917青草味122.290.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00庚醇111-70-62 500生青,甜味0.000.000.000.010.000.010.010.030.020.030.021-辛醇111-87-5900茉莉花,柠檬,柑橘,玫瑰花0.010.010.020.030.030.010.010.010.010.010.01苯乙醇60-12-81 400玫瑰花,花粉,香水7.167.108.6728.7645.7141.5949.9264.2956.1176.457.58香茅醇106-22-940青草,柠檬,蔷薇,丁香0.120.120.120.180.270.240.270.410.320.480.33β-大马士酮23726-93-40.05苹果,桃子80.3579.1478.5483.4384.3580.3579.3981.3679.5881.0878.24里那醇78-70-625果香0.050.070.050.050.050.050.10.180.140.170.12β-紫罗兰酮14901-07-6100紫罗兰0.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.03乙酸64-19-7200 000醋酸味0.140.140.230.180.190.210.250.420.420.560.57己酸142-62-1420奶酪,腐臭1.791.742.392.522.362.131.962.251.972.542.06辛酸124-07-2500奶酪,涩味0.630.641.001.512.131.481.31.771.351.951.18
葡萄汁时期,草本植物的感官得分为4~5分,介于微弱且较难分辨和能分辨但不够强烈之间;红色水果的感官得分为3~5分,介于微弱且较难分辨和能分辨但不够强烈之间;黑色水果的感官得分为1~2分,微弱且较难分辨;其他的感官得分均为0~1分。酒样中只检测到了少量的香气成分,醛类是葡萄酒中草本植物的重要来源,酒样中检测到2-己烯醛、反式-2,4-庚二烯醛、苯甲醛、反式-2-壬烯醛,根据品评小组成员讨论得出,这时草本植物类的感官特征主要以青草和果梗为主。
发酵初期,清新花香、热带水果、柑橘类水果、黑色水果的感官评分明显增加,其他香气的感官评分增加幅度较小。这是因为发酵进入旺盛期,开始产生香气成分,其中OAV>1的有丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、异戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、β-大马士酮、己酸和辛酸。
发酵中期,果酱味、坚果和黑色水果的感官评分略有增加,但热带水果和清新花香的感官评分降低,这与发酵初期酒样中酯类、类异戊二烯类和脂肪酸类的总浓度降低,高级醇类总浓度增加有关。
发酵末期,第7天时酒样中的感官得分在继续增加,到第9天的时候,红色水果、黑色水果、柑橘水果、草本植物、辛香料、坚果、果脯味、果酱味的感官评分都达到了最大值,其中红色水果和黑色水果的感官得分为8~9分,根据品评小组成员讨论得出,此时草本植物的感官特征主要以青椒和薄荷为主。
图3 赤霞珠干红葡萄酒发酵过程中香气特征雷达图
Fig.3 Radar diagram of sensory properties of Cabernet Sauvignon dry red wine during fermentation
在赤霞珠干红葡萄酒的发酵过程中,根据发酵阶段进行划分将发酵过程分为葡萄汁时期、发酵初期、发酵中期和发酵末期。
葡萄汁时期,样品为葡萄汁,检测出的香气成分非常少而且无法量化,但是检测出了具有草本植物香气的醛类:2-己烯醛、反式-2,4-庚二烯醛、苯甲醛和反式-2-壬烯醛等,使葡萄汁具有果梗和青草的感官特征。
发酵初期,也是发酵曲线对数期的中点,感官特征主要以红色水果、黑色水果、柑橘类水果、热带水果以及清新花香为主,是因为这个时期是糖和氨基酸代谢旺盛期,产生大量的醇、硫醇和脂肪酸等为合成酯的丝氨酸水解酶提供反应底物[27]。此外,高级醇的生成量较多,可以增加葡萄酒果香和花香的复杂度。类异戊二烯类成分是在葡萄果实中就已经存在,随着发酵的进行,β-大马士酮浓度逐渐降低,从酵母中释放的一些甘露糖蛋白可能与这种化合物相互作用并导致这种变化[28]。
发酵中期,酯类、类异戊二烯类和脂肪酸类成分的总含量均有降低趋势,而高级醇类成分的香气含量持续增加。这个时期的感官特征主要以黑色水果和红色水果为主,虽然香气成分的总含量均有降低,果酱和坚果的感官评分略有增加,应该与异丁醇、异戊醇、3-甲基-1-戊醇和2,3-戊二酮等含量增加相关。值得关注的是,这个时期所有香气成分和感官特征与猜想有所不同,并不是随着发酵的进行,所有香气成分含量和感官特征的评分都会逐渐增加,发酵所产生的CO2会带走80%挥发性化合物和相关的水解酶活性增加[29],都会导致这种变化的产生。
发酵末期,酯类成分的总含量增加并在第8天时达到最大值26 655.39 μg/L,发酵曲线趋于平缓,发酵速率降低,大多数的高级醇生成量逐渐减少。类异戊二烯类成分总含量在第9天时达到最大值162.49 μg/L,脂肪酸类成分浓度也增加,表明大多数的香气成分在发酵末期含量达到最大值[30]。红色水果、黑色水果、柑橘水果、草本植物、辛香料、坚果、果脯味、果酱味的感官评分都达到了最大值,其中红色水果和黑色水果的感官得分为8~9分,能分辨但不够强烈,此时草本植物的感官特征与葡萄汁时不同,主要以青椒和薄荷为主。
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