金枪鱼肌肉蛋白质含量高且氨基酸种类丰富,是一种优质蛋白资源[1]。但是金枪鱼蛋白溶解性较差,乳糜液体系不稳定,蛋白变性后其功能特性会随着热稳定性和化学稳定性的降低而降低,出现油水分离、蛋白沉淀、肉质粗糙等现象,使其在食品加工业的应用受到限制[2]。因此要大力开发具有优良特性的蛋白质资源,添加混合物对现有的蛋白质进行改造[3]。随着营养健康需求的不断增长,双蛋白乳糜液体系由于卓越的营养和功能特性而备受关注,有研究表明将动植物蛋白混合能够改善单个蛋白的特性并帮助解决环境和资源稀缺问题,在大多数情况下,双蛋白乳糜液体系在食品工业的应用过程中表现出出色的凝胶性、成膜性和其他表面功能特性[4]。
大豆蛋白营养价值高,具有良好的乳化性,广泛应用于婴幼儿配方食品中,且有研究表明在肉制品中适量添加大豆蛋白可以增加肉品稳定性和持水性,增强口感[4-6]。乳清蛋白属于全价蛋白,必需氨基酸含量明显高于普通的食用蛋白,易被人体吸收[7-8]。在食品生产中将乳清蛋白代替部分水产蛋白,与植物蛋白搭配形成的共混体系,在降低生产成本的同时可以更好地起到乳化的效果,提高产品的稳定性[9-10]。任广旭等[11]研究发现由乳清蛋白和大豆蛋白组成的双蛋白体系具有优良的消化特性,能维持血液中必需氨基酸的持续性供给,从而促进肌肉蛋白的合成。此外,为使制品获得良好的乳化性能和细腻口感,添加适量的油脂能够促使混合蛋白与脂质相互作用形成蛋白-脂质复合物,从而明显改善制品的乳化性,获得较好口感[12-14]。总体而言,动植物蛋白-油脂混合体系具有较为全面的营养和功能特性,为开发新型营养功能性食品提供了一种有广泛应用前景的方法。
本研究选取油脂、大豆蛋白和乳清蛋白作为混合蛋白体系的关键影响因素,在单因素的实验基础上,以大豆蛋白、乳清蛋白、油脂含量为自变量,以金枪鱼混合蛋白乳糜液的乳化特性为响应值,使用Design-Expert 13软件对蛋白体系的乳化性和乳化稳定性进行响应面试验,根据分析优化获得最佳的金枪鱼-植物蛋白浓度,建立稳定的金枪鱼-植物蛋白乳糜体系。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金枪鱼柳,浙江融创食品工业有限公司;葵花油,益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司;大豆蛋白,山东嘉华保健品股份有限公司;乳清蛋白,润嘉生物科技有限公司;十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS),北京索莱宝有限公司。
1.2 仪器与设备
JYL-C16V料理机,九阳股份有限公司;XHF-DY高速分散器,宁波新芝生物股份有限公司;高速冷冻离心机,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;SQP电子天平秤,赛多利斯科技仪器有限公司;VORTEX-5旋涡混合器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;ColorFlex EZ 45/0 Hunterlab色度计,德国HunterLab公司;Zetasizer NanoZS90粒径电位仪,英国马尔文仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 复合蛋白乳糜液的制备
选取金枪鱼靠近背鳍的中段鱼肉,手动去除皮肤、骨骼和暗色肌肉,并将背部的白色肉切成小块(边长约1 cm的立方体),然后将鱼块和冰水以料液比1∶9(g∶mL)漂洗2次,每次漂洗10 min,然后用滤网去除多余的水分。将300 g冲洗过的鱼肉与200 g纯净水充分混合并用料理机在250 W下强力粉碎5 min得到鱼肉浆。将不同质量分数的油脂(5%、10%、15%、20%、25%)、大豆蛋白(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、乳清蛋白(1%、2%、3%、4%、5%)加入金枪鱼分散液中,使用高速均质机以7 000 r/min的转速分别在4 ℃条件下均质,样液循环均质3次,制备出乳糜液,4 ℃下贮藏备用。
1.3.2 持水力的测定
参照BUAMARD等[15]的方法测定持水力,并做适当修改。将5 g(X)的金枪鱼混合蛋白乳糜液与25 mL (V1) 的超纯水在50 mL塑料离心管中混合。涡旋振荡后以5 000 r/min离心10 min。通过带有单层滤纸的布氏漏斗收集上层中过量的水(V2),重复测定3次,并使用公式(1)计算:
持水力
(1)
式中:X为金枪鱼乳糜液的质量;V1和V2分别代表加入金枪鱼乳糜液体系中水的体积和金枪乳糜液离心之后释放的水的体积;持水力为每克金枪鱼乳糜液保留水的体积。
1.3.3 白度的测定
将金枪鱼乳糜液倒入透明培养皿中,以黑色杯子为背景。用色差计在室温下3次重复测量样品的白度值。白度按公式(2)计算:
(2)
式中:W为白度值;L*表示明度;a*和b*表示色度,且a*正值表示偏红,负值表示偏绿;b*正值表示偏黄,负值表示偏蓝。
1.3.4 粒径的测定
采用THAGELE等[16]的方法对乳糜液粒径进行测定。将10 g金枪鱼乳糜液置于50 mL离心管中,盖好盖子在90 ℃水浴中加热20 min。用粒径电位仪测定蒸煮液的粒径。设定样品折射率为1.42,分散介质折射率为1.33。
1.3.5 乳化活性和乳化稳定性的测定
参照LI等[17]的方法测定其乳化性和乳化活性,从金枪鱼乳糜液底部吸取50 μL乳糜液,与5 mL的0.1 g/mL SDS溶液混合,用可见分光光度计在波长500 nm处测定吸光度。乳糜液乳化性(emulsifying activity index,EAI)、乳化稳定性(emulsifying stability index,ESI)的计算分别如公式(3)、公式(4)所示:
(3)
(4)
式中:A0,匀浆后的吸光度;N为稀释因子,100;C为样品的质量浓度,g/mL;F为原油乳状液的体积分数(25%);A0,0 min时所测吸光值;A10,10 min时所测吸光值。
1.3.6 乳糜液稳定性优化设计
根据单因素比较试验结果,依据Box-Behnken试验设计原理,考察3因素之间的交互作用并结合实际考虑。以乳化活性和乳化稳定性为响应值,设计3因素3水平的试验见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface method experiment
水平因素油脂/%大豆蛋白/%乳清蛋白/%-181.32.80101.53.01121.73.2
1.4 数据处理
实验结果每组重复3次,数据采用Excel 2017、Origin 2018和IBM SPSS Statistics 22.0进行图像绘制及处理,采用Design Expert 13.0软件对响应面数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 蛋白和油脂添加量对乳糜液白度和持水力的影响
持水力的大小反映出蛋白质分子之间的相互作用和结构状态,会影响产品的组织状态、口感以及稳定性[18-19]。白度的变化一定程度上反映了物质内部结构的变化[20-21]。由表2可知,随着油脂和蛋白添加量的增加,亮度(L*)、红色(a*)和黄色(b*)逐渐增加,金枪鱼乳糜的白度从54.49连续增加到72.77,可能是亲水基团的暴露使大豆蛋白和乳清蛋白的颜色中和掉部分暗灰色金枪鱼乳液,动植物蛋白溶解在一起形成致密的网状结构,蛋白质作为乳化剂对油脂进行乳化,增加了乳液的白度[22-23]。随着油脂和蛋白添加量的增加,持水力均呈先增大后减小的趋势,低于20%的油脂添加量可增加乳糜液的保水能力,大豆蛋白的添加量为1.5%左右时持水力达到最大值,为0.49 mL/g,乳清蛋白的添加量为3%左右时持水力达到最大值,为0.52 mL/g,表明适当的疏水基团暴露有利于蛋白质重新聚集,形成孔隙均匀的网状结构,具有较好持水力。但过量添加则作用相反,可能是由于过多的油脂会使乳糜液体系过稀,肌原纤维蛋白分子过度展开而难以再形成致密凝胶网络,不利于水分子包埋于凝胶网络,从而降低持水力[24]。
表2 蛋白和油脂的添加量对乳糜液白度和持水力的影响
Table 2 Effect of protein and oil addition on the whiteness and water retention of chylous fluid
样品添加量L∗a∗b∗白度持水力/(mL/g)油脂 5%66.08±0.22a-1.47±0.05d12.36±0.14c63.87±0.65b0.33±0.06d10%68.94±0.30c-1.70±0.01c11.83±0.12d66.72±1.22c0.43±0.06a15%70.32±0.44b-1.05±0.02bc12.22±0.04b67.88±1.02c0.47±0.01b20%74.28±0.34b-1.01±0.03b12.47±0.04b71.40±0.35b0.44±0.02e25%75.60±0.74a-1.17±0.07a12.03±0.26a72.77±0.98a0.35±0.05d大豆蛋白0.5%67.28±0.32a-1.03±0.02b12.45±0.35a64.98±1.40a0.42±0.02b1%68.54±0.42bc-1.09±0.03b12.03±0.41b66.30±2.53b0.44±0.04a1.5%69.32±0.34a-1.14±0.05a12.28±0.28b66.93±0.25a0.49±0.04c2%70.48±0.24c-1.11±0.04c12.59±0.20c67.89±1.37c0.45±0.07c2.5%70.90±0.52d-1.17±0.05d12.13±0.14d68.45±0.75d0.39±0.04d乳清蛋白1%69.28±0.44c-1.28±0.07c12.35±0.25c66.87±0.38c0.47±1.06a2%69.98±0.32a-1.30±0.05a11.89±0.27a67.68±1.96a0.49±0.03b3%70.32±0.46a-1.07±0.05b11.27±0.12bc68.23±2.01b0.52±2.04c4%71.48±0.36d-1.16±0.02d12.57±0.03d68.81±1.08d0.49±0.06c5%72.94±0.22d-1.23±0.03c12.33±0.14c70.24±0.53bc0.42±1.04d
注:同列不同上标小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2.2 蛋白和油脂添加量对乳糜液粒径的影响
乳糜液属于热不稳定体系,会依据动力学稳定性原理以一定速度分离成互不相容的油、水两相,出现絮凝、聚集、粒径偏移等现象[25-26],乳状液粒子越小,乳析速度越慢,乳析率越低,乳液也就越稳定[27]。由图1可知,随着油脂添加量的增加,乳糜液平均粒径从5%油脂添加量的531.2 nm逐渐增大到15%油脂添加量的651.2 nm,当油脂添加量达到25%时,平均粒径达到了695.01 nm,说明蛋白质在乳化体系中结合油的能力有限,过多的油会析出,导致体系不稳定。随着大豆蛋白和乳清蛋白添加量的增加,乳糜液的平均粒径均呈现先增加而减小的趋势,乳状液的稳定性也明显改善。HU等[28]在研究蛋白质量浓度对乳糜液稳定性的影响中也得到了同样的结论。结合图2,大豆蛋白和乳清蛋白的添加可以增加乳糜液蛋白浓度,乳糜液粒径减小,絮凝现象减少,蛋白分子之间结构更加致密均匀。因此,大豆蛋白添加量应高于1%,乳清蛋白应高于2%,以此来控制乳糜液平均粒径在600 nm以下,从而改善产品细腻度及适口性。
a-油脂;b-大豆蛋白;c-乳清蛋白
图1 蛋白和油脂添加量对乳糜液粒径的影响
Fig.1 Effect of the addition of different mass fractional proteins and oils on chylac fluid particle size
2.3 蛋白和油脂添加量对乳糜液乳化活性和乳化稳定性的影响
乳化活性一定程度上反映出水油结合形成乳化液的能力,乳化稳定性则反映油水混合乳状液维持稳定的能力,二者受物质颗粒大小、加工方式、加工温度和蛋白质质量浓度等因素综合影响[29]。由图2可知,随着油脂含量升高,界面面积增大,乳糜液的乳化活性也随之提高,而乳化稳定性减小,可能是由于油含量的增加使乳状液油滴形成的保护膜较薄,导致蛋白质相互聚集下沉或油滴相互聚集上浮,蛋白在油滴外围形成的刚性结构强度不大,从而失去稳定性。结合实际生产状况考虑到添加过多的油脂容易析出,且不利于人体健康,因此油脂添加应控制在10%左右。大豆蛋白和乳清蛋白的添加可显著增加乳糜液的乳化活性,说明乳糜液凝胶网络结构的形成以及在界面上的吸附和扩散作用增加,促使疏水性基团的暴露,蛋白质分子彼此靠在一起形成胶束,更迅速地转移至油-水界面,有效降低了表面张力[9,30]。但当大豆蛋白浓度继续增加至2%、乳清蛋白浓度增加至4%,即达到胶束临界浓度后,乳糜液乳化性和乳化稳定性趋于平稳。
a-油脂;b-大豆蛋白;c-乳清蛋白
图2 蛋白和油脂添加量对乳糜液乳化活性和乳化稳定性的影响
Fig.2 Effect of the addition of different mass fractional proteins and oils on the emulsification activity and emulsification stability of chylous fluid
2.4 响应曲面法优化设计
依据表3的实验数据,对响应值进行最小二乘法拟合回归分析,得到二次多元回归方程模型为:
Y1=98.75+8.66×A-5.04×B+0.103 8×C-0.392 5×AB+3.01×AC-5.50×BC-5.49×A2-14.46×B2-10.05×C2
Y2=77.33+8.68×A-3.95×B-0.692 5×C-0.742 5×AB+2.77×AC-5.28×BC-5.56×A2-12.31×B2-8.60×C2
方差分析结果见表4。
表3 Box-Benhnken试验设计方案及响应值
Table 3 Program of Box-Behnken experimental design and response value
试验号各因素编码值ABC乳化活性Y1/(mL/g)乳化稳定性Y2/%1-10171.6751.43200096.5576.98311084.0663.86401162.7845.4450-1-174.6956.85601-172.5958.4370-1186.8964.988-11072.7453.589-11066.4848.231000095.7875.5311-10-178.4757.3121-1091.8972.181310-188.7369.391410193.9774.581500098.6774.2916000100.6580.2817000102.0879.57
表4 Y1回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance for regressive equation
方差来源平方和自由度平均方差F值P值模型2 533.99281.5438.76<0.000 1∗∗A600.141600.1482.61<0.000 1∗∗B203.011203.0127.950.001 1∗∗C0.086 110.086 10.011 90.916 4AB0.616 210.616 20.084 80.779 3AC36.24136.244.990.060 7BC121.111121.1116.670.004 7∗∗A2126.911126.9117.470.004 1∗∗B2880.751880.75121.24<0.000 1∗∗C2424.891424.8958.490.000 1∗∗残差50.8577.26失拟项22.4937.501.060.459 9误差28.3747.09总和2 584.7516
注:模型
模型R1Adj=0.955 0,*P<0.05,**P<0.01。
由表4可知,该模型P<0.000 1,表明模型极显著(P<0.01);失拟项P值不显著,表明建立的模型拟合度较好;方程的校正决定系数R1Adj=0.980 3,表明约有98.03%的响应值变化能由该模型进行解释,实际实验与模型建立的方程拟合度较好,能用于分析和预测混合蛋白金枪乳糜液的工艺优化。结合图3可知,对乳糜液乳化性的影响极显著(P<0.01)的因素为A、B、BC、A2、B2、C2,其他因素均不显著。模型的F值越大对乳浊液乳化活性的影响越大。可见,各因素对乳糜液乳化活性的影响程度为:A(油脂)>B(大豆蛋白)>C(乳清蛋白)。
图3 Y1=f(A,B,0);Y1=f(A,C,0);Y1=f(B,C,0)响应曲面
Fig.3 Response surface of f(A,B,0), f(A,C,0), f(B,C,0)
由表5可知,P<0.000 1,表明模型极显著(P<0.01);失拟项P值不显著,表明建立的模型拟合度较好;方程的校正决定系数R2Adj=0.985 3,表明约有98.53%的响应值变化能由该模型进行解释,实际实验与模型建立的方程拟合度较好,能用于分析和预测混合蛋白金枪乳糜液的工艺优化。结合图4可知,对乳糜液乳化稳定性的影响极显著(P<0.01)的因素为A、B、BC、A2、B2、C2,对乳糜液乳化稳定性的影响显著(P<0.05)的因素为AC,其他因素均不显著。模型的F值越大对乳糜液乳化活性的影响越大。可见,各因素对乳糜液乳化活性的影响程度为:A(油脂)>B(大豆蛋白)>C(乳清蛋白)。
表5 Y2回归模型方差分析
Table 5 Analysis of variance for regressive equation
方差来源平方和自由度平均方差F值P值模型2 066.449229.6051.95<0.000 1∗∗A603.261603.26136.500.000 1∗∗B125.061125.0628.300.001 1∗∗C3.8413.840.868 10.382 5AB2.2112.210.499 00.502 8AC30.58130.586.920.033 9∗BC111.511111.5125.230.001 5∗∗A2130.101130.1029.440.001 0∗∗B2637.921637.92144.34<0.000 1∗∗C2311.141311.1470.40<0.000 1∗∗残差30.9474.42失拟项4.6131.540.233 60.869 0误差26.3246.58总和2 097.3816
注:模型R22=0.958 1,模型R2Adj=0.985 3,*P<0.05,**P<0.01。
图4 Y2=f(A,B,0);Y2=f(A,C,0);Y2=f(B,C,0)响应曲面
Fig.4 Response surface of f(A,B,0), f(A,C,0), f(B,C,0)
经Design-Expert 13软件分析得出最佳配方为:油脂含量9.41%、大豆蛋白1.47%、乳清蛋白2.99%;相应的模型预测乳糜液乳化活性为96.10 mL/g,乳化稳定性为74.55%。选取最佳配比制备复合蛋白乳液,测定其乳化性和乳化稳定性。乳液乳化活性为95.34 mL/g,乳化稳定性为76.87%。实际值与预测值相近,说明该模型能够较好地预测乳液稳定性条件。
3 结论
a)油脂的添加可提高金枪鱼乳糜液的持水力,但过多的油脂会使乳糜液体系过稀,结果显示持水力降低,添加量超过20%后油脂析出,粒径达到了695.01 nm,乳化稳定性降低。大豆蛋白和乳清蛋白的添加对金枪鱼乳糜体系乳化作用显著(P<0.05),适量添加可增加产品白度和持水力,疏水基团的暴露有利于蛋白质重新聚集,乳糜液粒径减小,絮凝现象减少,同时乳糜液界面面积增大,乳化活性上升,乳化稳定性趋于平稳,产品细腻度及适口性得到改善。
b)以乳糜液乳化活性和乳化稳定性为响应值,在单因素实验基础上,采用响应曲面分析法对复合蛋白金枪鱼乳糜液进行优化,建立的二次回归方程高度显著,模型拟合度好。根据模型及响应面分析,进行修正后确定较理想乳化剂的复配条件为:油脂含量9.41%、大豆蛋白含量1.47%、乳清蛋白含量2.99%,此时的乳化活性为96.10 mL/g,乳化稳定性为74.55%,乳糜液产品稳定性好,不易析出。
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