用于干预溃疡性结肠炎的异甘草素纳米颗粒研究

异甘草素(isoliquiritigenin, ISO)是一种来源于甘草、具有查尔酮结构的膳食功能因子,被证明在抗肿瘤、增强免疫、减轻炎症等方面具有药理作用[1-2]。研究表明,ISO能够通过抑制MAPK途径改善葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)诱导的结肠炎[3],对肿瘤坏死因子造成的刺激有回调作用,上调结肠抗炎介质PPARg蛋白的表达[4],在肠道炎症性疾病的治疗过程中表现出低毒性和有效的干预作用,具有治疗肠道黏膜炎症的开发潜力。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性且非特异性的肠道疾病,主要影响结肠黏膜和黏膜下层,炎症反应会增加并导致嗜中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞浸润,病程长且易反复发作,现有药物的治疗多伴随不同程度的副作用[5],因此,使用低毒高效的膳食功能因子干预手段成为迫切的需求。但ISO在水中的溶解能力较差,生物利用度低,限制了此类膳食功能因子营养制剂的临床开发利用[6]。

目前对异甘草素制剂的递送系统开发主要集中在脂质体、微乳、纳米颗粒等复合物,其中纳米颗粒可以提供更强的药物负载能力,改善难溶药物的溶解度,提高生物可及性,从而达到更好的靶向治疗效果[7-8]。马启珍等[9]使用卵磷脂作为稳定剂制备纳米结晶,提高了异甘草素的体外释放速度,但并未考虑包埋效率与消化过程中的递送行为,应用潜力低。刘勇华等[7]选用沉淀-高压均质法制备纳米混悬剂,稳定性高,但依赖表面活性剂提高稳定性,影响药剂的分散能力。谢育娇[6]使用三嵌段聚合物复配制备高稳定性的异甘草素混合胶束,但制备过程引入了有机试剂,制备成本高。因此,需要开发一种制备方法简单、天然低毒的纳米颗粒递送系统,提高ISO在体内的吸收利用能力。研究表明,玉米醇溶蛋白(zein)的两亲性使其具有较高的自组装能力,具备有效包裹小分子生物活性物质的能力,但其消化稳定性差,导致生物可及性低,给药效率受到限制。多糖与zein纳米颗粒之间的静电相互作用会影响溶液中纳米颗粒的聚集状态,从而改变暴露表面积,能够提高zein纳米颗粒的消化稳定性,增强天然产物的封装效率[10]。果胶作为一种广泛应用在食品和医药领域的多糖,在酸性条件下的稳定性能保护果胶到达下消化道后被利用,是构建口服药物纳米颗粒的重要原料[11]。

本研究采用反溶剂沉淀法制备负载异甘草素的zein-果胶复合纳米颗粒,以纳米颗粒分散体稳定性对相关参数进行优化,探索纳米颗粒的基本理化性质,并通过比较体外模拟消化水平及对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)小鼠的干预效果评价zein-ISO纳米颗粒改善作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

果胶,苏州赛迈尔生物科技有限公司;玉米醇溶蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胆盐,上海源叶生物科技有限公司;异甘草素、葡聚糖硫酸钠(相对分子量为40 000),上海麦克林生化科技股份有限公司;甲醇(色谱纯)、其他试剂(分析纯),国药集团化学试剂有限公司。

8周龄C57BL/6 J小鼠(雄性),体重18～20 g,江苏华创信诺医药科技有限公司,动物生产许可证号[SCXK(苏)2020—0009]。所有动物实验均得到中国无锡江南大学动物伦理委员会的批准(伦理审核编号:JN.No20221215c0560110[533])。饲养于江南大学实验动物中心[许可证号:SYXK(苏)2021—0056],温度(20～24 ℃)、湿度(40%～70%)、人工光照-黑暗12 h循环。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器,德国IKA公司;真空旋转蒸发仪,上海申顺生物科技有限公司;真空冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Zetasizer nano ZS型纳米粒度及Zeta电位仪,英国Malvern公司;D2 PHASER型X-射线衍射仪,德国布鲁克AXS公司;SU 8100型场发射扫描电子显微镜,日本日立公司;IS10型傅立叶红外光谱仪,美国Nicolet公司;高效液相色谱,日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 纳米颗粒制备

称取一定量的玉米醇溶蛋白溶于一定浓度的乙醇溶液中,加入ISO,磁力搅拌30 min充分溶解,形成zein-ISO溶液。将制备好的溶液用注射器快速注入pH为4的水中,在900 r/min转速下,磁力搅拌5 min。利用旋转蒸发仪去除溶液中的乙醇,旋蒸结束后,添加pH为4的水补充乙醇的损失。将果胶溶于70 ℃的热水中,用1 mol/L的HCl将果胶溶液的pH调至4,果胶的最终质量浓度为1 g/L。最后将纳米颗粒分散液倒入果胶溶液中,磁力搅拌30 min后4 000 r/min离心10 min,倒出上清液,即可获得负载ISO的zein-果胶纳米颗粒[12]。

1.3.2 制备方法的优化

以纳米颗粒粒径、电位以及分散指数(polydispersity index,PDI)为主要指标,考察不同因素对纳米颗粒分散体稳定性的影响。

1.3.2.1 zein质量浓度对纳米颗粒的影响

取zein分别溶于10 mL 体积分数为80%的乙醇溶液中,制得10、20、30、40、50 g/L的zein溶液,随后按照zein∶ISO=10∶1的质量比加入ISO,后续操作参考1.3.1节。

1.3.2.2 乙醇浓度对纳米颗粒的影响

配制体积分数分别为70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液后移取相同体积溶解100 mg玉米醇溶蛋白,制备质量浓度为10 g/L的zein溶液,随后按照zein∶ISO=10∶1的质量比加入ISO,后续操作参考1.3.1节。

1.3.2.3 ISO添加量对纳米颗粒的影响

取100 mg zein溶解于10 mL 体积分数为80%的乙醇溶液中,分别加入不同质量的ISO(4、6、8、10、12 mg),后续操作参考1.3.1节。

1.3.2.4 zein与果胶质量比对纳米颗粒的影响

取100 mg zein溶解于10 mL 体积分数为80%的乙醇溶液中,随后按照zein∶ISO=10∶1的质量比加入ISO,室温下磁力搅拌5 min,取上述溶液各5 mL快速注入20 mL,pH=4的水中,旋转蒸发,再按照zein-ISO溶液∶果胶溶液=10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2的体积比将纳米溶液倒入果胶溶液中,磁力搅拌30 min后4 000 r/min离心10 min,倒出上清液。

1.3.3 纳米颗粒的理化性质表征

利用纳米粒度及Zeta电位仪测定纳米颗粒的粒径、PDI及电位。用pH=4的水稀释相应的纳米体系,取1 mL样品放入样品池进行检测。参数设置:平衡时间为30 s,温度为25 ℃。

利用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察纳米颗粒的微观结构。取3 μL纳米颗粒分散液滴加硅片上,随后放置于干燥器中,室温下自然干燥,将硅片用导电胶固定在样品盘上,使用SEM在3.0 kV加速电压下选择合适的倍数进行观察并拍照。

利用X-射线衍射(X-ray diffraction,XRD)评价纳米颗粒结构。取适量冻干粉末放置于硅片上,放入衍射仪中进行测定。仪器参数设置:扫描角度为5°～50°,扫描步长为0.05°,扫描时间0.5 s。

通过傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)对冻干后的样品进行红外曲线测定。仪器参数设置:扫描波长范围为650～4 000 cm-1,扫描次数为32次,分辨率为4 cm-1。

1.3.4 包埋率和装载率的测定

参照郭远治[13]、YANG等[14]的方法测定包埋率和装载率。将制备完成的zein-ISO离心30 min后,用甲醇稀释上清液,在ISO的最大吸收波长下通过紫外-分光光度法测定吸光度。ISO在372 nm处有吸收峰,与谢育娇[6]的研究结果相同。后续实验中选择372 nm作为ISO紫外分光光度法的检测波长。根据甲醇中分别溶解ISO的标准曲线对ISO的含量进行测定。包埋率和装载率分别以公式(1)和公式(2)计算:

1.3.5 纳米颗粒的体外模拟消化

根据YANG等[14]的方法稍作修改进行体外胃肠模拟消化。将ISO与等量zein-ISO(以ISO计)纳米颗粒分别分散在30 mL的蒸馏水中并按照1∶1的体积比与30 mL模拟胃液(主要成分为胃蛋白酶3.2 mg/mL和NaCl 2 mg/mL)进行混合。用1 mol/L的HCl将溶液pH调至1.2后,放置于37 ℃恒温水浴消化120 min,分别在30、60、90、120 min时收集1 mL 样品并以1 mL模拟胃液补齐,高速离心取上清测定ISO浓度。用1 mol/L NaOH溶液将pH调至7.5以终止胃消化。之后继续加入60 mL模拟肠液(主要成分为K2HPO4 6.8 mg/mL,胰蛋白酶2 mg/mL,胆盐 10 mg/mL和NaCl 8.8 mg/mL)混合,最终溶液pH控制在7.5左右,接着消化2 h,分别在150、180、210、240、300、360 min时收集1 mL样品并以1 mL模拟肠液补齐,高速离心后取上清测定ISO浓度,具体方法见1.3.4节。对每个取样点的游离ISO浓度进行测定后,以公式(3)计算胃肠模拟消化过程中ISO的释放率:

1.3.6.1 动物分组与给药

动物实验共14 d。第1～7天,预适应饲养,使用普通饲料与普通饮用水喂养所有动物。预适应饲养结束后,将40只C57BK/6 J雄性小鼠随机分为5组,分别为空白对照组(CON组)、造模组(DSS组)、玉米醇溶蛋白组(zein组)、异甘草素组(ISO组)、玉米醇溶蛋白-异甘草素纳米颗粒组(zein-ISO组),每组8只。第8～14天,各实验组小鼠均用普通饲料喂养,除空白对照组继续使用普通饮用水喂养外,其他各组使用30 g/L的DSS溶液作为饮用水喂养。同时,ISO组与zein-ISO组每日分别灌胃ISO与zein-ISO,灌胃剂量以ISO计为20 mg/kg·bw;zein组每日灌胃等量zein(以zein-ISO中zein计),上述灌胃样品均溶于200 μL PBS缓冲液中,CON组和DSS组每日灌胃等体积PBS缓冲液。第15天,实验结束,处死动物。

1.3.6.2 动物处死与取材

实验结束后,采用异氟烷麻醉小鼠,摘眼球取全血,颈椎脱臼法处死。然后立即解剖截取结肠,将结肠置于冰盒上,使用生理盐水冲洗肠道内容物,滤纸吸干,将结肠自然伸展平铺在A4白纸上,测量各组结肠长度并拍照。

1.3.6.3 疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分测定

参照ZHANG等[15]的方法对各组小鼠进行DAI评分标准做出修改,记录每只小鼠的DAI评分,以评估结肠炎疾病的状态,通过各组小鼠体重、粪便性状、粪便的隐血情况在内的综合指标,用作评估DAI评分。具体评分细则如表1所示。

1.3.6.4 结肠组织生化指标检测

取各组结肠组织加入适量生理盐水制备组织匀浆,离心后取上清液。按试剂盒说明书测定肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)。

1.3.7 血液中ISO浓度的测定

参照冯颖淑[16]的方法检测血浆中ISO浓度。小鼠眼球取血于肝素钠提前处理过的离心管中,离心取上层血浆。取100 μL血浆于2 mL离心管中,加入甲醇1.5 mL,涡旋1 min,20 ℃,5 000 r/min离心10 min后取上清,40 ℃氮气吹干,加入100 μL甲醇复溶后转移至进样瓶中。使用HPLC检测ISO的浓度,检测条件为:色谱柱为Galaksil(EF-C18Bio,5 μm),柱温为30 ℃,流速为0.8 mL/min,流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液(体积比为60∶40),检测波长为372 nm,进样量:20 μL。

1.4 数据处理

所有试验测定3次,采用Graphpad prism 8.0和Origin 2022软件作图。实验数据采用平均值±标准差(SD)表示,采用SPSS 23软件进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan检验分析实验数据。

2 结果与分析

2.1 优化结果

2.1.1 zein质量浓度对纳米颗粒分散体稳定性的影响

如图1-a所示,粒径与PDI随着zein溶液质量浓度的增大,呈现先减小后增大的趋势。在zein溶液质量浓度保持在20～40 g/L时,纳米颗粒溶液的PDI均小于0.3,此时粒径的分布均一性较好。这可能是因为在质量浓度逐渐升高的过程中,zein溶液通过自组装的方式,逐渐形成粒径较小且较为均一、分散的纳米颗粒;自组装过程结束后,随着质量浓度逐渐升高,过多的zein会包裹在外围,使体系中的纳米颗粒粒径变大[17]。此外,在zein溶液质量浓度为20 g/L时,zein-ISO纳米颗粒电位绝对值最大,体系最稳定;当zein质量浓度进一步提高,zein-ISO纳米颗粒电位逐渐稳定至-30 mV。因此,选择质量浓度为20 g/L的zein溶液制备zein-ISO纳米颗粒,此时体系稳定,粒径更小。

2.1.2 乙醇溶液体积分数对纳米颗粒分散体稳定性的影响

如图1-b所示,随着乙醇溶液体积分数增大,粒径与PDI均呈现先减小后变大的趋势。赖婵娟等[18]的研究表明,随着乙醇溶液体积分数升高,zein纳米颗粒的粒径表现出类似的变化趋势。溶液中存在溶剂与蛋白之间的作用,乙醇溶液体积分数不同造成其亲水/疏水性不同,由此导致玉米醇溶蛋白结构在溶液中展开以及聚集的程度也不同,产生了不同大小的纳米颗粒。当乙醇溶液体积分数达到80%时,纳米颗粒粒径与PDI最小,分布均一性较好。此外,此时纳米颗粒的电位为-31.5 mV,体系稳定性好。因此选用体积分数为80%的乙醇溶液制备zein-ISO纳米颗粒。

2.1.3 ISO添加量对纳米颗粒分散体稳定性的影响

如图1-c所示,随着ISO的添加量增多,zein-ISO纳米颗粒粒径先减小后变大,PDI逐渐增加,但趋势不明显。当ISO添加量为4～10 mg时,纳米颗粒粒径均低于150 nm,随着ISO的含量增加,纳米颗粒电位逐渐升高,说明芯材过多,体系不稳定,zein和果胶无法包埋体系中所有ISO。这一结果与RODRIGUEZ-FELIX等[19]的研究相似。因此选择ISO添加量为6 mg,此时zein-ISO纳米颗粒粒径为127.5 nm,电位为-32.1 mV,形成的纳米颗粒溶液较为稳定。

2.1.4 zein与果胶质量比对纳米颗粒分散体稳定性的影响

多糖对于纳米颗粒体系的稳定有着重要作用。如图1-d所示,随着体系中果胶含量增加,纳米颗粒粒径和PDI先减小后增大,在zein与果胶质量比为2∶1时粒径最小,在144 nm左右。此外,果胶浓度较低时,纳米颗粒的电位绝对值相对较小,静电作用弱,无法维持体系稳定,可能造成颗粒的聚集。随着果胶比例增加,电位达到-31.1 mV,能够得到粒径较小且均匀的纳米颗粒(PDI在0.2左右)。果胶是一类来源丰富的天然阴离子多糖,溶解在水中形成带负电荷的酸性溶液[20],zein的等电点在6.2附近[21],缔合相互作用发生在果胶电离(带负电荷)和蛋白带正电荷(低于其等电点)的条件下[22]。在酸性条件下,果胶可以吸附在zein的表面,并通过静电作用、空间位阻作用提高体系的稳定性,果胶比例的上升促进了这一相互作用。但果胶比例过大可能会导致多余果胶发生交联或者果胶重复包裹蛋白,使粒径变大。这与ZHANG等[23]通过反溶剂法制备玉米醇溶蛋白-黄原胶纳米颗粒的发现相似。因此,后续实验选择zein∶果胶=2∶1的质量比制备zein-ISO纳米颗粒。

2.2 zein-ISO纳米颗粒理化性质表征

根据2.1节的结果,选择zein溶液质量浓度20 g/L、乙醇溶液体积分数80%、ISO添加量为6 mg、zein与果胶质量比为2∶1制备zein-ISO纳米颗粒,并对样品的理化性质进行表征。

2.2.1 纳米颗粒分散体稳定性

zein和zein-ISO纳米颗粒粒径、电位以及PDI的结果如图2所示。酸性环境为果胶-蛋白相互作用提供了良好的反应条件,优化工艺得到的zein纳米颗粒平均粒径大小为102.3 nm,PDI<0.15,电位绝对值大于30 mV,体系稳定。使用反溶剂法制备纳米颗粒的粒径大小,通常与蛋白浓度、乙醇浓度、搅拌速度等因素相关[24]。随着ISO加入,纳米颗粒粒径变大,LI等[25]利用zein包埋姜黄素的过程中发现同样的趋势,此时ISO成功包封在纳米颗粒中。zein-ISO的PDI也呈现变大的趋势,电位绝对值有所下降。但2种纳米颗粒的电位均小于-30 mV,说明成功制备了较为稳定的zein-ISO纳米颗粒。

2.2.2 微观形态特征

扫描电镜观察到的zein原料、zein和zein-ISO纳米颗粒微观形态特征如图3所示。zein原料是不规则形状,类似于块状,表面带孔,这与孙丽君等[26]观察到的结果是一致的。zein和zein-ISO纳米颗粒都呈现较为均一的球状纳米结构,形态相差不大,粒径均分布在100～200 nm,与纳米粒度激光仪的测定结果一致。这一对比说明利用反溶剂法制备纳米颗粒是可行的。

对比分析纳米颗粒(zein、zein-ISO)、芯材ISO、果胶(pectin)和物理混合物ZPI(zein+pectin+ISO)的冻干样XRD图谱,如图4所示。由图4可以发现,zein在9°和20°处显示出2个宽峰,果胶在13.3°和21.5°处出现衍射峰,证明二者均为无定形结构[27-28]。ISO在7.9°、11.7°、14.9°、17.3°、21.3°、24.5°、26.7°等多处出现多个尖锐的衍射峰,说明纯ISO呈现高度结晶状态[29]。物理混合物ZPI的衍射图谱中同时存在zein的特征峰(9°和20°)和ISO的部分特征峰(15°～30°)。与此相比,zein-ISO与zein衍射图谱的相似性表明,反溶剂法使ISO成功负载在zein纳米颗粒内部,以无定形形式存在,有助于提高化合物的水溶性[30]。

通过比较纳米颗粒(zein、zein-ISO)、芯材ISO、果胶(pectin)和物理混合物ZPI的FTIR图谱,分析ISO、玉米醇溶蛋白与果胶之间的相互作用,如图5所示。zein在3 320 cm-1、1 653 cm-1和1 535 cm-1处存在特征峰,分别代表氢键以及N—H拉伸振动、C

O伸缩振动引起的酰胺Ⅰ带和C—N伸缩振动、N—H弯曲振动引起的酰胺Ⅱ带[31]。果胶位于3 370 cm-1的特征吸收峰代表了O—H伸缩振动,在2 939 cm-1对应于甲酯基团或—CH2的伸缩振动,1 722、1 610 cm-1对应于羧基和甲酯基团中碳基部分的伸缩振动[32]。ISO的FTIR图谱显示3 472、1 632、1 604、1 448、1 224、792 cm-1等处存在特征吸收峰。在zein中添加ISO后,O—H伸缩振动吸收峰偏移到3 295 cm-1,表明玉米醇溶蛋白与ISO之间存在形成了氢键,与WANG等[33]的研究相似;酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带吸收发生了明显的变动,移动到1 649、1 518 cm-1,说明复合纳米颗粒形成过程中存在静电相互作用[34];除此之外,二者的FTIR图谱基本一致,ISO的特征吸收峰几乎消失或与zein的特征吸收峰重叠。与zein-ISO相比,物理混合物ZPI的图谱在810 cm-1处多了一处特征吸收峰,对应于芳环面外C—H弯曲振动。推测ISO存在于zein的疏水部位中,从而限制了ISO结构上化学基团的伸展[35],同时证明ISO成功包裹在zein纳米颗粒中。

2.3 体外模拟消化稳定性

体外模拟消化广泛应用于预测生物活性物质生物可及性,具有条件易控制、相对便宜、快捷等优点。ISO通过溶解在消化液中被机体吸收利用,所以使用模拟消化后ISO在消化液中的溶解占比表示ISO的生物利用度,具体操作步骤及释放率计算方法见1.3.5节。

随着体外模拟消化进行,2种纳米颗粒的释放率变化如图6所示。由图6可见,模拟胃消化结束时,有23.28%游离的ISO被释放,zein-ISO纳米颗粒中只有18.85%被释放。这可能是因为此时pH值低于果胶的pKa,造成纳米颗粒外层果胶的质子化,影响了胃蛋白酶对玉米醇溶蛋白纳米颗粒的消化水解。在模拟肠液消化阶段,zein-ISO纳米颗粒的释放率显著高于游离ISO。此时模拟肠液为中性环境(pH=7.5),果胶与zein之间的静电相互作用减弱,在胰蛋白酶的作用下,zein纳米颗粒被水解,促进了ISO的释放[36]。体外模拟消化结束时,zein-ISO纳米颗粒的总释放率达到了72%,明显高于游离ISO(34.4%),并且在肠液中的释放率(53.15%)高于胃液(18.85%)。以上结果说明,zein纳米颗粒包埋可提高ISO在消化液中的生物利用度,肠道可能是ISO释放的主要部位,zein-ISO纳米颗粒具有靶向肠道释放和缓释的潜力。

2.4 包埋率和装载率

对纳米颗粒中ISO的包埋率和装载率进行了测定,zein-ISO纳米颗粒的包埋率达到了91.66%,但装载率较低(5.52%)。可能是因为在该纳米颗粒的形成过程中,单位质量的壁材能装载的溶解状态的ISO有限,改进纳米颗粒载药方式可能会使装载率上升。如林爽[37]通过对比核壳结构EGCG/Cys(Rapa)载药纳米颗粒与均匀分散结构EGCG/Cys(Rapa)载药纳米颗粒的载药率发现,核壳结构纳米颗粒直接以药物形核,因此有较高的载药率。

2.5 干预结肠炎作用评价

2.5.1 对结肠炎小鼠体重的影响

造模期间,各组动物体重变化如图7所示。CON组小鼠体重稳步上升,DSS组小鼠体重持续下降约10.2%。与CON组相比,DSS组在最后一天的体重显著降低(P<0.001)。与DSS组相比,zein组小鼠体重没有显著变化(P≥0.05),ISO和zein-ISO组能显著缓解小鼠体重的下降(P<0.001),其中zein-ISO组的恢复效果更接近CON组。结果表明,被包封在纳米颗粒中的ISO比直接灌胃ISO在缓解结肠炎小鼠体重下降方面更有效。

2.5.2 对结肠炎小鼠DAI评分及结肠长度的影响

如图8-a所示,与CON组相比,DSS组小鼠DAI评分显著升高(P<0.001)。与DSS组相比,ISO、zein-ISO组的DAI评分均显著降低(P<0.001)。zein处理后,小鼠DAI评分有下降的趋势,但不显著。灌胃zein-ISO比ISO更有利于降低DAI评分,这可能是因为纳米颗粒中壁材的保护作用在一定程度上减少了ISO在胃中的释放,并且适宜的颗粒粒径范围有利于其选择性透过肠上皮细胞,更容易穿透黏液层[38],减轻DSS诱导的结肠炎损伤。这与XIAO等[39]的研究结果相似。结果表明,DAI评分升高是DSS诱导小鼠结肠炎的重要表现,各干预组不同程度地缓解了DAI评分的升高,但在灌胃相同浓度下负载在纳米颗粒中的ISO的缓解效果优于游离的ISO。

DSS诱导后会使结肠长度变短,所以从结肠长度可以直观观察DSS诱导的结肠炎严重程度。量取各组小鼠结肠长度后进行比较,结果如图8-b、图8-c所示。CON组小鼠结肠平均长度为8.52～0.59 cm,粪便成型度较高。DSS诱导后小鼠结肠平均长度显著缩短(P<0.001)至6.33～1.35 cm,结肠蜷缩弯曲且肉眼可见肿胀充血。与DSS组相比,ISO组小鼠结肠长度显著增加(P<0.05);zein-ISO组小鼠结肠长度几乎与CON组一致,达到了极显著水平(P<0.001)。以上结果说明,纳米颗粒包裹ISO更能改善结肠长度缩短的疾病状态,这些趋势与DAI评分基本一致。

2.5.3 zein-ISO对结肠炎小鼠结肠组织炎症因子水平的影响

结肠组织中的炎症因子水平也是侧面体现结肠炎严重程度的表观指标之一。对小鼠结肠组织炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平进行评价,结果如图9所示,与CON组相比,DSS诱导后小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著升高(P<0.001),说明在DSS的作用下,促进多种炎症细胞因子的释放,从而调节T细胞的增殖、生长和分化,加速炎症反应的发生[40]。与DSS组相比,zein组各炎症因子水平并无显著差异。ISO组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β的水平明显下降(P<0.05),IL-6的水平显著降低(P<0.01)。zein-ISO极显著降低了小鼠结肠组织中这些炎症因子的水平(P<0.001)。负载在纳米颗粒中的ISO比游离的ISO在结肠组织抗炎方面表现的更好,与ZHANG等[41]的研究一致。结果表明,zein-ISO可通过下调结肠炎小鼠结肠组织中炎症细胞因子的表达,缓解小鼠的溃疡性结肠炎,效果明显优于游离的ISO。

2.5.4 血液吸收情况

通过检测给药小鼠血液中ISO的浓度反映不同形式ISO给药后的机体吸收情况。以20 mg/kg的剂量灌胃ISO和zein-ISO后,zein-ISO组血液中ISO质量浓度[(2.68±0.13) μg/mL]比ISO组[(0.48±0.01) μg/mL]高了4.58倍。这一结果与ZHANG等[42]相似,用负载异甘草素的纳米结构脂质载体处理的大鼠的异甘草素血浆浓度显著高于用异甘草素溶液处理的大鼠。结果表明经过纳米颗粒包裹后能有效增加ISO在小鼠体内的吸收,为提高难溶性天然产物的生物可及性提供了思路。

3 结论

本研究选用zein与果胶作为包覆材料,使用反溶剂沉淀法成功制备了负载ISO的复合纳米颗粒。单因素优化试验表明,选择zein溶液质量浓度20 g/L、乙醇溶液体积分数为80%、ISO添加量为6 mg、zein与果胶质量比为2∶1,制备得到的zein-ISO纳米颗粒包埋率达到了91.66%,具有较高的溶解性与稳定性,在扫描电镜下呈大小均一的规则球状。体外模拟消化实验表明,zein-ISO纳米颗粒可以提高ISO在肠道的释放率,具有使其靶向肠道释放和缓释的潜力。动物实验结果显示,zein-ISO纳米颗粒可以提高ISO在小鼠血液中的浓度,更显著地降低结肠组织中炎症因子水平,有效地干预了溃疡性结肠炎。zein-ISO为水不溶性膳食功能因子的纳米颗粒开发提供了新的思路。

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