奶豆腐(Hurood)，蒙古语称“胡乳达”，是蒙古族最具代表性的传统发酵乳制品。奶豆腐在内蒙古锡林郭勒盟和呼伦贝尔市等地区有着悠久的制作和消费历史。奶豆腐以牛奶、羊奶或马奶等为原料，经自然发酵而成的传统手工干酪产品，其传统的制作工艺是：原料乳不杀菌，待静置自然发酵后，收集上浮的奶油，剩下的凝乳用温火加热至乳清分离，再排出乳清，将凝块高温加热并不断搅动至黏稠状后，趁热入模成型[1-2]。奶豆腐的颜色从白色到淡黄色，营养丰富，风味独特，是蒙古牧民家庭最常见的乳制品。
奶豆腐至今仍以原始的手工制作为主，这种简单粗放的家庭作坊式生产，严重影响产品的品质和质量安全。奶豆腐的传统制作工艺主要存在以下问题和不足：一是多种微生物参与发酵。未经杀菌的原料乳的微生物构成复杂，既有乳酸菌、酵母等有益微生物[3-4]，也有大量杂菌微生物[5]，同时一些环境中的微生物也可以通过制作器具引入，共同参与发酵；杂菌微生物的增殖和代谢，显著影响了奶豆腐的口感、风味和质地。二是发酵时间长。奶豆腐发酵过程在夏季需要1～2 d，其他季节需要3～5 d。三是奶豆腐出品率较低。由于加工工艺没有严格的参数可以借鉴，仅凭个人经验进行操作，导致蛋白质损失较严重。四是多数传统手工作坊式的制作环境，无法保障奶豆腐产品的质量和卫生。此外，也有一些研究相继报道了通过乳酸菌辅助发酵剂、添加CaCl2、控制凝乳加热温度等优化了奶豆腐的加工工艺，缩短了发酵时间，提升了奶豆腐的品质[6-7]。但目前仍需要对奶豆腐的传统加工工艺深入研究，建立标准化的操作规程和规模化生产工艺，制定产品标准，丰富产品种类。因此，本研究在奶豆腐传统制作工艺的基础上，采用酸凝或乳酸菌发酵代替自然发酵，改进了奶豆腐的生产工艺，开发了奶豆腐新产品，实现了传统奶豆腐的品质升级。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生牛乳，市售；无水柠檬酸(食品级)，河南万邦实业有限公司；DNA提取试剂盒(DNeasy PowerSoilKit)，美国Bio/QIAGEN公司。
1.2 仪器与设备
MLS-3780高压蒸汽灭菌锅，日本Sanyo公司；BCN-1360B无菌超净工作台，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；HZQ-Q电热恒温培养箱，上海一恒实验设备有限公司；Sorvall Evolotion RC高速冷冻离心机，美国Thermo公司；Freezone 6真空冷冻干燥机，美国Labconco公司；HYCV-407干酪槽，黑龙江赫益乳业科技有限公司；Testo 205 pH计，德国Testo公司；TA.XT plus物性分析仪，英国Stable Micro Systems公司；AR1500ex流变仪，美国TA仪器公司；NEXUS GRADIENT梯度PCR扩增仪，德国Eppendorf公司；DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂；1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司。
1.3 乳酸菌发酵剂的制备
乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)AS185由吉林省农业科学院农产品加工研究所分离自传统农家黄豆酱，现保藏于中国典型培养物保藏中心(M 2018114)。冻存菌株经连续传代活化3次后，按体积分数3%接种量接种于改良M17液体培养基中，37 ℃静置培养16 h后，离心(4 000 r/min，10 min，4 ℃)收集菌泥，并用质量分数0.85%的灭菌生理盐水洗涤2次；向菌体中加入冻干保护剂，进行真空冷冻干燥(-80 ℃，10 Pa，20～24 h)，即获得乳酸菌发酵剂，其活菌数达到12.28 lg CFU/g。
改良M17液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，酵母膏2.5，磷酸甘油二钠10.0，MgSO4 0.25，异抗坏血酸钠0.5，pH为7.1～7.2，115 ℃高压灭菌20 min。
1.4 实验方法
1.4.1 奶豆腐制作工艺流程
奶豆腐加工工艺如图1所示。
图1 奶豆腐工艺流程图
Fig.1 Flowchart of Hurood cheese processing
1.4.2 理化指标测定
参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》进行脂肪含量测定，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》进行蛋白质含量测定，参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》进行水分含量测定；用Testo 205 pH计直接进行pH值测定。
1.4.3 奶豆腐凝块微生物多样性分析
分别取热缩前的奶豆腐凝块1.0 g，采用DNeasy PowerSoilKit试剂盒，按照试剂盒说明书提取微生物基因组DNA；利用16S rRNA 基因V3～V4区通用引物(338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增[8]，并使用质量分数2%的琼脂糖凝胶回收PCR产物；纯化后的PCR产物由上海派森诺生物科技股份有限公司利用MiSeq Reagent Kit V3 (600 cycles)进行双端测序。
1.4.4 奶豆腐质构特性测定
取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的奶豆腐样品，室温放置20 min后，利用物性分析仪测定硬度、弹性、黏聚性、胶着度、咀嚼度和回复性[9]。选择P/0.5探头，测量前探头下降速度1.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，测量后探头回程速度10.0 mm/s，压力20%，下压变形时间10.0 s，自动触发，触发力2 g。
1.4.5 奶豆腐流变性质测定
将奶豆腐样品切成直径为20 mm，厚1 mm的圆片，利用流变仪测定弹性模量(G′)和黏性模量(G″)随温度和频率的变化[10]。参数设置：选择不锈钢平板探头(Φ 20 mm)，平板与底盘间隙1 mm，小振幅振荡模式；扫描频率0.1 Hz，温度25～80 ℃，升温速率5 ℃/min；扫描温度25 ℃，频率0.1～10 Hz。
1.4.6 奶豆腐游离氨基酸测定
采用HPLC进行游离氨基酸含量的测定[11]。选择C18 SHISEIDO色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；进样量10 μL；流动相为0.1 mol/L无水乙酸钠-乙腈溶液(pH=6.5)和体积分数80%的乙腈水溶液；柱温40 ℃；检测波长254 nm。
1.4.7 奶豆腐感官评定
参考文献[9]和[12]，并略作修改。选取20名对色、味、质属性敏感并具有干酪品鉴基本知识的人士组成评定小组(男∶女=1∶1)，对奶豆腐产品的颜色均匀性、光泽度、硬度、弹性、胶黏性、气味、滋味以及加热后拉丝性和整体可接受度进行10分制的感官评定。分数越高，代表程度越高。
1.5 数据分析
每组实验重复3次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 19.0统计软件对数据进行差异显著性分析，采用Canoco 4.5软件进行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，采用GraphPad Prism 7.0软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 奶豆腐制作工艺关键点分析
在奶豆腐制作中，酸化凝乳是最主要的关键工艺点，主要是利用酪蛋白等电点沉淀原理。
在传统奶豆腐制作中，原料乳不经杀菌处理，而是利用原料乳本身的微生物进行室温自然发酵产酸凝乳。但发酵时间需20 h以上，其酸度才可达到凝乳要求，即pH值达到了蛋白质等电点4.6。
在酸凝奶豆腐制作中，省去了自然发酵产酸的过程，而是利用质量分数10%柠檬酸直接将原料乳pH调节至4.6，即为直接酸化凝乳。
在乳酸菌奶豆腐制作中，先用质量分数10%柠檬酸将原料乳pH调节至5.0后，再接种产酸菌株乳酸片球菌AS185，经37 ℃、5 h发酵后酸度即可达到pH 4.6，这主要是利用了产酸菌株乳酸片球菌AS185进行适酸(pH 5.0)适温(37 ℃)发酵产酸凝乳。
可见，不论是传统奶豆腐的自然发酵，还是酸凝或乳酸菌奶豆腐的调酸或乳酸菌发酵，都是在pH达到4.6时终止发酵或调酸，然后再经50 ℃加热处理，蛋白质在其等电点的热环境下才会出现絮状凝乳，析出乳清。但与传统奶豆腐制作相比，酸凝或乳酸菌奶豆腐主要在发酵产酸凝乳方式上进行了改良，进而缩短了制作时间。
2.2 奶豆腐凝块中微生物多样性分析
通过16S rRNA高通量测序，对3种奶豆腐凝块中的微生物群落多样性进行了分析，酸凝或乳酸菌奶豆腐与传统奶豆腐凝块的微生物群在结构和组成上有很大差异(图2)。在Chao1和Shannon多样性指数上(图2-a)，酸凝奶豆腐的指数最高，且显著高于乳酸菌发酵奶豆腐(P<0.05)；门水平上(图2-b)，传统奶豆腐和酸凝奶豆腐主要由厚壁菌门(Firmicutese)和变形菌门(Proteobacteria)组成，相对丰度分别为65.78%和34.07%及58.96%和30.34%；乳酸菌发酵奶豆腐主要由厚壁菌门组成，相对丰度为99.21%。在属水平上(图2-c)，酸凝奶豆腐优势菌群较为丰富，如乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和假单胞菌属(Pseudomonas)；乳酸菌发酵奶豆腐优势菌群主要为片球菌属(Pediococcus)；传统奶豆腐优势菌群以链球菌属(Streptococcus)和志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)为主。由此可见，前期不同的凝乳方式对凝块中微生物多样性影响较大，进而也会对后期产品的品质及风味产生间接影响。
a-多样性指数；b-物种组成相对丰度(门水平)；c-物种组成热图(属水平)
图2 奶豆腐凝块微生物的多样性
Fig.2 Microbial diversity in curd of Hurood cheese
2.3 基本理化指标分析
3种不同工艺制作的奶豆腐在脂肪、蛋白质、水分含量及pH值等理化指标差异较大(表1)。
表1 奶豆腐的基本理化指标
Table 1 Physicochemical composition of Hurood cheese
样品脂肪/%蛋白质/%水分/%pH传统奶豆腐4.62±0.20c30.64±1.08a54.22±0.93a4.45±0.02c酸凝奶豆腐11.93±0.22b22.76±0.89b54.63±0.89a5.02±0.01a乳酸菌奶豆腐12.48±0.18a23.34±0.82b52.38±1.39a4.95±0.03b
注：同一列不同字母表示差异显著(P<0.05)
由表1可以看出，传统豆腐的脂肪含量明显低于其他2种奶豆腐，蛋白质含量较高，pH值较低；而酸凝奶豆腐和乳酸菌发酵奶豆腐的脂肪、蛋白质含量和pH值接近；3种奶豆腐水分含量无差异。说明凝乳方式不同对产品的脂肪和蛋白质含量有较大影响。
2.4 质构特性分析
利用物性分析仪对3种奶豆腐的硬度、弹性、黏聚性、胶着度、咀嚼度和回复性进行了测定(图3)。由图3可以看出，酸凝或乳酸菌奶豆腐的硬度、胶着度和咀嚼度显著低于传统奶豆腐，存在显著性差异(P<0.01)，酸凝奶豆腐的硬度、胶着度和咀嚼度均为最低。在弹性、黏聚性、回复性方面，3种奶豆腐之间的差异不显著(P>0.05)。说明经自然发酵后的传统奶豆腐的硬度高，胶着度高，咀嚼度高，口感差；而经酸凝后，由于酪蛋白凝乳沉淀较好，会使得奶豆腐的硬度和胶着度降低、更易咀嚼。
a-硬度；b-弹性；c-黏聚性；d-胶着度；e-咀嚼度；f-回复性
图3 奶豆腐的质构特性
Fig.3 Texture characteristics of Hurood cheese
注：*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)
2.5 流变学特性分析
采用流变仪对3种奶豆腐进行了弹性模量(G′)和黏性模量(G″)的测试(图4)。从振动频率扫描结果(图4-a)可知，3种奶豆腐的G′>G″，均随振动频率的增加而升高，且酸凝或乳酸菌奶豆腐的黏弹性模量值低于传统奶豆腐。由此说明，酸凝或乳酸菌奶豆腐的蛋白水解程度高，质地柔软，这也与酸凝或乳酸菌奶豆腐中游离氨基酸含量高、硬度低和胶着度低的结果一致。从温度扫描结果(图4-b)可知，随温度的升高，3种奶豆腐各自的G′和G″变化均呈下降趋势；在开始升温阶段，均是G′>G″；当温度达到65 ℃时，传统奶豆腐的G′和G″值出现了近似相等，但G′>G″，仍为固态；当温度达到73 ℃时，酸凝或乳酸菌奶豆腐的G′和G″出现了相等，随后G′略低于G″，即由固态开始转向液态，说明酸凝或乳酸菌奶豆腐经73 ℃加热后开始处于熔融状态。由此说明，酸凝或乳酸菌奶豆腐的熔化温度要高于传统奶豆腐，且达到一定温度时，其熔化性和流淌性较好。
a-振动频率扫描；b-温度扫描
图4 奶豆腐的流变学特性
Fig.4 Rheological properties of Hurood cheese
2.6 游离氨基酸含量分析
对这3种奶豆腐进行了17种游离氨基酸分析(表2)，发现3种奶豆腐氨基酸的数量和含量均有显著差异(P<0.05)。由表2可以看出，与传统奶豆腐相比，酸凝或乳酸菌奶豆腐中缺少了组氨酸，乳酸菌奶豆腐中还缺少苏氨酸，3种奶豆腐中游离氨基酸数量分别是15、14、13种；传统奶豆腐中苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸含量居高，酸凝或乳酸菌奶豆腐中苯丙氨酸、谷氨酸、丙氨酸含量居高；但就氨基酸总量而言，酸凝奶豆腐的氨基酸总量最高，存在显著性差异(P<0.05)，传统奶豆腐与乳酸菌奶豆腐之间无显著差异(P>0.05)。由此说明，传统奶豆腐与酸凝或乳酸菌奶豆腐的生产工艺、微生物种类及其产生的蛋白酶存在差异，蛋白质水解或者肽链断裂方式不同产生的氨基酸种类和含量不同，这也显著影响奶豆腐的风味和质地。
表2 奶豆腐中游离氨基酸含量 单位：mg/kg
Table 2 Mass fraction of free amino acids in Hurood cheese
氨基酸传统奶豆腐酸凝奶豆腐乳酸菌奶豆腐天冬氨酸3.33±0.11c14.94±0.09a3.77±0.32b谷氨酸7.03±0.06c63.40±0.27a41.91±0.07b丝氨酸2.15±0.06a2.02±0.06b1.08±0.02c丙氨酸1.86±0.08c7.50±0.02b9.91±0.06a组氨酸0.36±0.02a--精氨酸3.83±0.09b57.19±1.59a0.47±0.05c苏氨酸0.68±0.03a0.43±0.04b- 丙氨酸8.45±0.03c37.16±0.11a10.02±0.07b脯氨酸11.38±0.16a6.15±0.06b1.35±0.03c酪氨酸1.96±0.06b2.05±0.03a1.57±0.04c缬氨酸5.06±0.04b5.39±0.04a2.76±0.07c蛋氨酸---胱氨酸---异亮氨酸23.07±0.03a5.26±0.04c7.83±0.02b亮氨酸7.65±0.04a14.64±0.08b-苯丙氨酸62.83±0.11c73.75±0.09a67.46±0.08b赖氨酸11.20±0.07a1.75±0.04b1.28±0.07c总量150.83±0.05b291.63±1.96a149.40±0.35b
注：同一行不同字母表示差异显著(P<0.05)
2.7 感官评定
对3种奶豆腐的感官属性进行了综合评定(图5)。由图5可以看出，酸凝或乳酸菌奶豆腐的感官得分均高于传统奶豆腐，尤其是在光泽度、硬度、滋味、加热后的拉丝性和整体可接受度方面。此外，感官评定综合发现，传统奶豆腐外观质地较松散，口味偏酸，入口质地粗糙；酸凝或乳酸菌奶豆腐品质细腻，酸度适中，口感细腻，加热后拉丝性好。
图5 奶豆腐的感官评分
Fig.5 Sensory score of Hurood cheese
2.8 冗余分析
对3种奶豆腐的基本理化指标(脂肪、蛋白质、水分、pH)、具有差异显著的质构参数(硬度、胶着度、咀嚼度、回复性)及含量较高的游离氨基酸(谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸)进行了冗余分析，结果如图6所示。RDA1和RDA2的总方差分别为77.15%和6.34%。酸凝发酵对奶豆腐中的丙氨酸(Ala)和精氨酸(Arg)产生了主要影响；乳酸菌发酵影响了奶豆腐的脂肪(Fat)含量和pH值及其苯丙氨酸(Phe)和谷氨酸(Glu)的产生；自然发酵则对奶豆腐的蛋白质(Pro)、异亮氨(Ile)、水分(Moisture)含量及硬度(Harthness)、胶着度(Conglutination)、咀嚼度(Chewiness)和回复性(Restorative)产生了重要影响。同时也可发现，奶豆腐产品的质构特性受凝乳方式影响较大。
图6 冗余分析
Fig.6 RDA analysis
3 讨论
未经杀菌原料乳的质量在奶豆腐生产过程中起重要作用。特别是原料乳中复杂的天然菌群直接参与奶豆腐的发酵，会显著影响奶豆腐的品质。原料乳中存在的微生物，一类是有助于发酵凝乳和提升奶豆腐品质的有益微生物，如乳杆菌、乳球菌、肠膜明串珠菌和酵母菌等，许多研究人员已经成功地从传统的自然发酵干酪制品中分离和鉴定了一些益生菌[13-14]；另一类则是对产品品质产生不利影响的杂菌。因此，奶豆腐加工过程中对杂菌的控制显得尤为重要。本研究正是基于上述考虑，采用酸凝、调酸结合乳酸菌发酵代替传统的自然发酵方式，通过调酸和缩短发酵时间抑制杂菌微生物的生长，促进乳酸菌等耐酸有益微生物的生长，来控制奶豆腐制作过程。研究结果表明，获得的酸凝或乳酸菌奶豆腐的品质优于传统自然发酵奶豆腐。一些研究也报道了乳酸菌作为附属发酵剂用于传统干酪加工，改善了干酪口感风味，提升了干酪品质[15-16]。另外，很多干酪的加工原料乳也不杀菌，例如哈罗米(Halloumi)干酪，但其凝乳后的凝块需经高温蒸煮处理，即达到杀菌目的，原料乳不杀菌有助于干酪质构和风味的形成[17-18]。我们也尝试将原料乳巴氏杀菌后，接种乳酸菌发酵剂，控温发酵改良传统奶豆腐工艺，但生产的奶豆腐品质不如传统奶豆腐，这说明原料乳中的微生物、活性酶等显著影响奶豆腐的口感、风味和质构。
我国的传统干酪大多是酸凝干酪，依靠原料乳和加工环境引入产酸微生物，主要是乳酸菌发酵产酸凝乳，如奶豆腐、奶干、曲拉、奶疙瘩等。也有利用木瓜等原料制取酸水加热凝乳生产的乳扇等。近年来，一些研究报道了采用柠檬酸、乳酸、醋酸等有机酸直接调酸凝乳生产酸凝干酪，优化了产品的加工工艺，丰富了干酪产品种类[19-20]，也有研究对比了酸凝和酶凝法加工干酪的出品率、感官品质和蛋白降解等[21-22]。
本研究采用直接酸化凝乳和调酸结合乳酸菌发酵凝乳两种方法开发了2款新型奶豆腐产品，新产品在流变特性、质构、游离氨基酸、感官和微生物多样性等方面均优于传统工艺奶豆腐。本研究结果进一步说明了酸凝法生产有其独特的技术优势，例如工艺简单、成本低廉、产品口感风味易于接受等。本研究也发现，直接酸化凝乳生产的奶豆腐品质优于先调酸再乳酸菌发酵凝乳法，这可能是因为凝乳后凝块中微生物多样性不同所致。直接酸化法是在开放的环境下将原料乳pH值迅速下降至4.6时进行凝乳，致使凝块中的微生物多样性较为丰富；而先调酸再进行乳酸菌发酵凝乳，在其缓和的发酵过程，乳酸菌种的不断产酸，成为优势菌，将会抑制其他微生物的生长。由此也进一步说明，在奶豆腐制作过程中，微生物环境对奶豆腐产品的品质有较大相关性。
4 结论
本研究遵循奶豆腐的传统制作工艺，采用酸凝或乳酸菌发酵代替自然发酵，缩短了奶豆腐的发酵时间，有效控制了有害微生物，提升了奶豆腐的品质。其中，酸凝奶豆腐的生产工艺简单，口感、风味等显著优于传统奶豆腐，可作为新型奶豆腐在牧区进行推广应用，不但可提升奶豆腐生产效率，节约成本还有利于促进牧民增收。
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