蓝莓、树莓、黑果腺肋花楸、蔓越莓、黑莓与蓝靛果养分丰富，含有大量多酚、花青素、黄酮等生物活性物质，有良好的抗氧化性能，能够有效延缓衰老、抗肿瘤、预防和治疗心脑血管疾病等，对人体健康有促进作用，是营养价值与经济效益都极高的浆果资源。但果实采收后极易出现组织软化、腐败变质等问题，常被加工制作成果汁果酱等[1-3]。
近年来，浆果复合果汁饮料不断涌现并成为人们研究和关注的热点，它们在营养成分方面存在潜在价值。然而，浆果复合果汁易在加工过程中受到霉菌、酵母菌等微生物的侵害，针对引起果汁品质劣变的微生物，目前有效的杀菌方法主要为热杀菌技术和非热杀菌技术。传统的热杀菌会造成果汁饮料营养成分的不可逆损失和理化性质的不利变化，同时有研究证明了超高压杀菌比巴氏杀菌具有更好的杀菌效果，对果汁贮藏品质的影响较小[4]。国外已对不同种类与性质的食品(如肉类、奶类、果蔬汁、果酱等)的生产采用超高压杀菌，而我国市售果汁生产较为简单，杀菌工艺多为高温热力杀菌方法，对产品的营养成分和味道损害很大，比较不同浆果品种在食品生物和药理活性方面(如生物活性化合物、抗氧化活性和营养成分)的研究很少[5]。因此，对自然复合和非热杀菌果汁产品的研究有着巨大的发展前景[6]。
鉴于此，本研究通过对比6种小浆果果汁的基本理化指标、生物活性成分含量、抗氧化活性和香气成分，通过主成分分析等评价各类小浆果果汁之间的差异性，筛选出相对适宜复配的小浆果果汁。随后评价含蓝靛果和黑莓的复合蓝莓果汁抗氧化能力和感官特性，并综合对比超高压杀菌法和巴氏杀菌法对蓝莓复合果汁的加工影响。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器
NaOH、葡萄糖，西陇化工股份有限公司；考马斯亮蓝、NaHCO3、没食子酸、NaNO2、醋酸钠、KCl、Al(NO3)3、FeCl3·6H2O、柠檬酸、K2SO4，北京化工厂；DPPH、醋酸钠、无水乙醇、ABTS，国药集团化学试剂有限公司；福林酚试剂、芦丁，上海源叶生物科技有限公司。上述试剂均为分析纯。蓝莓、蓝靛果，辽宁省丹东有机食品公司；黑果腺肋花楸、树莓、黑莓和蔓越莓，市售。
PHSJ-3F型pH计，上海精科仪器公司；ATC手持折光仪，上海勃基仪器仪表有限公司；UV-6100紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；QP2010 plus气相色谱-质谱联用仪，岛津公司；AIRSENSE PEN3.5电子鼻系统，北京盈盛恒泰科技有限责任公司；TCP2-A色差仪，北京奥科光电仪器有限公司。
1.2 浆果汁的制备
每个浆果样品与蒸馏水以固液比1∶1(g∶mL)混合，榨汁机压榨，再经4层消毒纱布过滤，去除粗颗粒和杂质，离心浆液(4 000 r/min，10 min，4 ℃)，得到上清液。
1.3 物理化学指标测定
1.3.1 色差
颜色属性(L*表示亮度，其中0=黑，100=白；a*，b*，c*分别表示红绿色数值、黄蓝色数值和饱和度)，采用CIE标准光源D65比色法测定浆果汁的饱和度，参照BURSA
KOVA
EVI等[7]的方法进行计量。
1.3.2 pH值和总可溶性固形物(soluble solids, TSS)含量的测定
采用阿贝折光仪法测定TSS含量[8]。将15 mL浆果汁放入50 mL的离心管中，使用pH计在环境温度(25±2) ℃下测量每个样品的pH值。浆果汁滴在折射计玻璃棱镜上，用于分析TSS，表示为°Brix。
1.3.3 可滴定酸度(titratable acidity,TA)和可溶性蛋白含量(soluble protein content，SPC)的测定
参照TSEGAY等[9]的方法，采用直接滴定法测定果汁的TA。使用考马斯亮蓝比色法检测果汁的SPC，于595 nm处测定其反应2 min后的吸光度。
1.3.4 生物活性化合物及抗氧化能力测定
1.3.4.1 总酚含量(total phenol content, TPC)测定
参照BRADFORD等[10]的方法，采用福林酚比色法。将福林酚试剂(1 mol/L)与浆果汁按体积比5∶1混匀，再将Na2CO3溶液(4 mL，7.5%，质量分数)加到混合物中搅拌1 min。在常温较暗环境中保存60 min后，测定760 nm处吸光度。根据标准曲线测定没食子酸浓度当量。
1.3.4.2 总黄酮含量(total flavonoid content, TFC)测定
根据NAHEED等[11]的方法，使用亚硝酸盐-硝酸铝-氢氧化钠显色法。
首先，将0.3 mL的浆果汁用体积分数为30%的乙醇稀释至5.4 mL，分别加入0.3 mL 5%(质量分数)NaNO2、0.3 mL 10% Al(NO3)3和4 mL 1 mol/L的NaOH，振荡6 min后，在510 nm处测定吸光度。以儿茶素为标准品生成的校准曲线来计算总黄酮含量。
1.3.4.3 总花青素含量(total anthocyanin content, TAC)测定
参照KHANAL等[12]的方法，采用pH示差法。本实验制备了2种缓冲液体系，分别是0.025 mol/L KCl缓冲液(pH 1.0)和0.4 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 4.5)。首先，取1 mL浆果汁溶液，用缓冲液使之充分稀释至10倍后，于510和700 nm处计算稀释样品的吸光度值，用去离子水做空白对照。以矢车菊色素-3-葡萄糖苷当量(mg CGE/100 mL)代表，花青素质量浓度按照公式(1)计算：
ρ(花青素)
(1)
式中：A=(A510-A700)pH 1.0-(A510-A700)pH 4.5;MW，矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷相对分子质量=449.2 g/moL；ε，矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷消光系数=26 900 L/(mol·cm)-1;DF,稀释因子;L，光程，值为1 cm。
1.3.4.4 DPPH自由基清除活性测定
参照LU等[13]的方法进行测定。将1 mL不同浓度的果汁试样加入4.5 mL DPPH水溶液中，用无水乙醇(0.1 mmol/L)定容后，室温静置30 min，并于517 nm处测量其吸光度值。DPPH自由基的清除能力按照公式(2)计算：
DPPH自由基清除率
(2)
1.3.4.5 铁还原/抗氧化能力(ferric reducing/antioxidant power，FRAP)的测定
参考BAHUKHANDI等[14]的方法进行测定。FRAP化学试剂含乙酸缓冲液、2,4,6-三(4-吡啶)-1,3,5-三嗪[2,4,6-tri(4-pyridyl)-1,3,5-triazine，TPTZ]、FeCl3。混合物在37 ℃预热1次，按体积比1∶15将浆果汁加入混合物中，37 ℃水浴保存10 min后，在593 nm处测定吸光度。
1.3.4.6 ABTS阳离子自由基清除活性测定
参考ADHIKARI等[15]的方法进行测定。将ABTS工作液在使用前于734 nm处将溶液稀释至吸光度值为0.7，形成测试试剂。浆果汁用去离子水稀释至20倍，然后将0.5 mL的样液加入7 mL的ABTS试剂中，充分拌匀后，在室温下静置10 min，并于734 nm处测定吸光度。
1.3.5 挥发性化合物分析
参考ZHU等[16]的方法，采用顶空固相微萃取-气质联用法。取装有1 mL浆果汁的样品杯，置于60 ℃水浴，加热并平衡20 min后，用固相微萃取针刺穿隔膜。将纤维(PDMS/DVB)暴露于汁液顶空40 min。采用气质联用仪对挥发性化合物进行分离和检测，条件为：色谱柱型号DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱温箱初始温度40 ℃，进样口温度200 ℃，不分流进样，载气流速1 mL/min，柱温箱升温程序为 40 ℃保持3 min，5 ℃/min升至120 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，保持13 min。质谱采用全扫描的模式搜集信号，在总能量电压为70 eV，总发射电流为35 μA的电子冲击模式下工作，扫描范围为35～500 m/z，对未知挥发性化合物谱图使用NIST11数据库进行鉴定，并采用面积归一化法进行定量。
1.4 蓝莓复合果汁评定
按1.2中的方法制备蓝莓汁。根据预实验结果将蓝莓与蓝靛果或花楸果汁按10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5(体积比)混合，采用DPPH法测定混合果汁的抗氧化能力。感官分析由12名评估人员进行描述性评估，对果汁的颜色(10分)、气味(10分)、口感(10分)和稳定性(10分)进行系统评价。确定最佳复合果汁工艺配方为蓝莓汁55.66%、红提汁24.34%、黑果腺肋花楸汁10%和蓝靛果汁10%(以体积分数计)。
对上述混合汁通过不同的方式杀菌(巴氏杀菌和超高压杀菌)。巴氏杀菌试验方法：将蓝莓复合果汁样品置于无菌塑料袋中密封，选用不同巴氏杀菌条件处理样品(65 ℃/30 min、80 ℃/20 min、85 ℃/15 min和90 ℃/1 min)，处理后的样品置于4 ℃贮藏，2 h内取样进行菌落总数检测。超高压杀菌试验方法：取等量同批制得的蓝莓复合果汁置于无菌塑料袋中密封，以未经超高压处理的样品为对照，试验组分别在不同压力下(100、200、300、400、500 MPa)处理5 min，温度25 ℃，样品置于4 ℃贮藏，2 h内取样进行菌落总数检测。采用平板计数法对好氧细菌、霉菌和酵母菌进行计数。
本研究为区别巴氏杀菌和高压杀菌方法对果汁口味的影响，利用电子鼻对杀菌前后果汁的响应差异，来进行主成分分析(principal component analysis, PCA)。检测方法为：量取样品3 mL置于20 mL样品瓶中并封口，于25 ℃平衡120 min后进行电子鼻分析，采用顶空吸气法，直接将进样针头插入样品瓶开始自动检测，载气速率300 mL/min，检测时间120 s。
1.5 统计分析
所有实验均为3次重复，每次重复进行3次平行测定。使用SPSS Statistics 24分析，结论以平均值±标准差表达，并进行显著性分析(P<0.05)，相关结果进行皮尔逊分析和聚类分析。
2 结果
2.1 理化指标分析
6种果汁的基本理化指标均呈现显著性差异(P<0.05)，结果如表1所示。
表1 六种小浆果果汁的理化指标(n=3)
Table 1 Physicochemical characteristics of juices of six small berries(n=3)
指标蓝莓树莓黑莓蓝靛果花楸蔓越莓pH值2.84±0.03b2.64±0.01c2.50±0.01d2.50±0.02d3.13±0.02a2.17±0.02eTSS/%4.96±0.04b4.17±0.04d4.07±0.05e4.45±0.04c5.51±0.02a3.99±0.06eTA/[g·(100 mL)-1]0.35±0.01e0.81±0.03bc0.84±0.04b0.77±0.02c0.59±0.03d0.92±0.05aTSS/TA13.99±0.30a5.15±0.26d4.88±0.26de5.89±0.14c9.31±0.43b4.33±0.19eSFC/[mg·(100 mL)-1]51.20±3.37c59.75±1.96b40.04±0.35d35.99±1.96e102.51±0.74a59.46±2.42bL*28.54±0.17e45.13±0.40a36.81±0.21c13.57±0.21f36.34±0.12d41.04±0.02ba*42.23±0.10e57.09±0.32c61.00±0.12b49.50±0.29d65.77±0.22a65.57±0.19ab*29.84±0.40d53.06±0.24b54.24±0.62ab24.42±1.38e46.57±0.45c54.58±0.52ac*51.71±0.30f77.94±0.40d81.63±0.41b55.21±0.84e80.62±0.13c85.31±0.22a
注：同行不同上标字母代表差异显著(P<0.05)
表1显示了6种浆果汁基本技术参数，其中花楸的pH值最高，达到(3.13±0.02)，最低的为蔓越莓(2.17±0.02)；6种浆果果汁中的TSS分别为(4.96±0.04)%、(4.17±0.04)%、(4.07±0.05)%、(4.45±0.04)%、(5.51±0.02)%和(3.99±0.06)%。蔓越莓的TA值最高为(0.92±0.05)g/100 mL，其次是黑莓和蓝靛果，而蓝莓最低为(0.35±0.03) g/100 mL，每组的SPC值也有显著性差异(P<0.05)。水果的固酸比值由TSS和TA的比例确定，这意味着比值越高的果汁具有更好的口感，表中蓝莓的固酸比(13.99±0.30)最高，而蔓越莓最低(4.33±0.19)，说明蓝莓具备较好鲜食价值，而蔓越莓需要进一步深加工。此外，各种浆果汁的颜色都呈现显著性差异(P<0.05)，树莓的L*值、花楸的a*值、蔓越莓的b*值和c*值分别最高； 蓝靛果的L*和b*值、蓝莓的a*和c*值分别最低。酚类化合物的存在会改变浆果及其产品的颜色，花青素是浆果皮呈现橙色、粉色、红色、蓝色和紫色的主要原因；黄酮醇可能由于花青素和黄酮醇之间分子缔合作用而引起共色素效应[17]。
综上所述，6种小浆果汁的各种基本理化指标各有不同，所以应该按照小浆果本身的特点(例如成熟度、酸度、颜色等)来挑选不同的小浆果进行产品加工，以便于更好地使用优质的小浆果。
2.2 生物活性物质对比
图1呈现了小浆果汁中3个典型的生物活性成分含量，分别为花青素、总黄酮和总酚。多酚化合物还具有改善身体健康的特点，能最大限度地降低人们患代谢性病症(如糖尿病和肥胖)、冠心病，以及各种慢性病症的可能性。其中，花青素-3-葡萄糖苷是浆果总花青素的主要成分，花青素是决定成熟果实颜色的重要组成部分，它也可以通过不同哺乳动物细胞的细胞膜快速运输，是浆果中最有效的抗氧化剂[18]。
图1 六种小浆果果汁生物活性物质含量图
Fig.1 Content of bioactive components of juices made from six small berries
注：不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)(下同)
总体而言，3种物质中总酚含量相对最高，而花青素含量最低，6种小浆果果汁的3种活性成分含量均呈现显著性差异(P<0.05)。如图1所示，蓝靛果的TAC、TFC和TPC值最高，而蓝莓的TPC值最低，浆果中存在大量的花青素，且多酚类化合物的含量会因多种因素而发生显著变化，包括基因型、天气条件、收获时间、销售时间和实验方法等。
2.3 抗氧化活性对比
如图2所示，6种小浆果汁的抗氧化能力可以采用3种不同的方式测定，分别为自由基清除能力(DPPH和ABTS+)和金属还原能力(FRAP)，它们能够更加全面可靠地体现小浆果汁的抗氧化活性。不同小浆果汁间抗氧化能力存在显著差异(P<0.05)。
图2 六种小浆果果汁抗氧化性对比
Fig.2 Comparison of antioxidant properties of juices made from six small berries
DPPH是一种稳定的有机氮自由基，它可以通过氢原子转移的路径被清除，在515～520 nm范围内具有最大的紫外可见吸收[19]。各小浆果汁中，蓝靛果抗氧化活性最高，蓝莓的抗氧化活性最低，黑莓对DPPH自由基的清除能力强于蔓越莓和蓝莓，这与SLATNAR等[20]的研究结果一致。
ABTS测定法是基于在抗氧化剂存在或缺乏的情况下产生ABTS阳离子自由基。结果表明，蓝靛果组和花楸组的抗氧化活性相似，分别为(4.24±0.01)mg Trolox/mL和(4.21±0.01)mg Trolox/mL。
FRAP法是利用对Fe3+/Fe2+离子对的还原能力，直接估算浆果汁中还原剂的含量。新型的蓝靛果和花楸表现出更高的Fe3+还原能力，而蓝莓最低为(1.25±0.05)mg Trolox/mL。
综上，新型浆果汁(如蓝靛果和花楸)较普通的小浆果(如蓝莓和蔓越莓)其抗氧化活性更好。采用3个不同的评估方式能够更加全面、精确地描述其抗氧化能力，但由于不同的抗氧化体系之间存在着不同的对应机制，从而造成6种浆果汁的抗氧化水平差异，其成因仍然值得进一步研究和挖掘。
2.4 关键指标相关性分析
如图3所示，DPPH、ABTS和FRAP值与各浆果汁样品中TPC、TFC和TAC存在相关性，DE SOUZA等[21]的研究也发现总抗氧化能力与总酚含量呈正相关。此外，LI等[22]通过对13个蓝莓品种抗氧化能力的研究，发现多酚、花色苷和类黄酮含量与蓝莓抗氧化能力呈显著正相关，另一方面，TSS与pH呈正相关，与TA呈负相关，与本文研究发现一致。
图3 理化参数的相关分析
Fig.3 Correlation analysis of the physicochemical parameters
2.5 特征风味物质
香气也是评价浆果汁品质的关键指标之一，本研究共从浆果汁中识别出了56种挥发性物质，蓝靛果、蓝莓、树莓、黑莓、蔓越莓和花楸果汁中的挥发性物质，依次是26、14、18、22、17和15种，这些化合物一般可分成7类(图4)，水果中的芳香挥发物则大多为酯类、醛类和萜类物质，醛类和酯类是蓝莓和蔓越莓香味的最主要来源[23]。
由图4可知，蓝莓的主要香气成分为醇类和酯类，分别占总含量的60.84%和21.87%；与蓝莓相似，树莓中醇类和酯类分别占71.50%和18.26%，蓝靛果、花楸和蔓越莓中醛的含量比其他果汁中要多。在6种浆果汁中，蓝靛果的芳香物质较另外5种浆果汁中更为均衡，是因为其含有更多的芳香物质类型，且不同果汁样品有不同的香气特征。值得注意的是，化合物的数量和它的气味阈值也决定了食物特有的味道(如黄酮醇对葡萄酒)。
图4 六种小浆果果汁香气成分种类及数量图
Fig.4 Classification and quantity of aroma components of six small berry juices
2.6 二元混合果汁抗氧化分析
基于以上研究，进一步采用二元混合果汁复配形式。本研究为打造一款以蓝莓为主体的天然营养健康的复合果汁，选择生物活性物质和抗氧化活性更高的蓝靛果和花楸制作二元混合果汁。
如图5所示，抗氧化能力(DPPH值)随蓝靛果浓度的增加有增加的趋势，在蓝莓与蓝靛果比例为5∶1时最高(P<0.05)，但感官评分逐渐降低。混合果汁(蓝莓和花楸)抗氧化能力的变化趋势(图6)与混合果汁(蓝莓和蓝靛果)相似，随花楸浓度的增加而增加。
图5 蓝靛果汁比例对蓝莓汁感官评价及抗氧化活性影响
Fig.5 Effect of the ratio of blue honeysuckle on sensory evaluation and antioxidation of blueberry juice
图6 黑果腺肋花楸汁比例对蓝莓汁感官及抗氧化活性影响
Fig.6 Effect of the ratio of chokeberry on sensory evaluation and antioxidation of blueberry juice
由图5可知，合理加入蓝靛果可以增加浆果汁的芳香和风味；DPPH的抗氧化活性随加入量提高而增加，由于蓝靛果中含有较多的生物活性物质，有较强的抗氧化活性性能，所以加入蓝靛果可以提高果汁的综合营养与功能价值。当蓝靛果的加入量约为10%～20%时就可以增加二元混合果汁的综合营养风味。
由图6可知，加入了不同比例的花楸也会造成蓝莓二元混合果汁在抗氧化活性和感官评价上产生显著性差异(P<0.05)。适度地加入花楸可以丰富蓝莓的香味与营养，而过度加入同样会造成果汁苦涩味加重；DPPH的抗氧化活性随加入剂量提高而上升，这也是因为花楸具有较多的活性物质，从而可以增加果汁的营养与功能价值。当剂量在10%～20%之间时，二元混合果汁感官综合评价和抗氧化活性都相应较强。
2.7 超高压及热处理杀菌工艺条件优化
果汁灭菌技术是果汁加工过程中的一个重要环节。热处理是传统的灭菌方法之一，它可能导致营养损失和感官变化，因此，本研究中使用了多种巴氏杀菌方法(图7-a)。与其他3种方法相比，90 ℃/1 min(高温短时)处理的抑制效果最好。
本文研究了高压处理对果汁理化特性的影响，优化了高压与壳聚糖联合处理抑制微生物生长的实验条件(图7-b～图7-d)[24]。混合果汁的初始微生物负荷为400～500 CFU/100 mL。研究发现，随着压力的增加，微生物数量逐渐减少，壳聚糖的加入可以使杀菌效果更好,这可能是由于壳聚糖及其衍生物分子链上的活性基团—NH2可发生质子化，形成有效抑菌基团—NH3+吸附细菌细胞并与其细胞壁负电荷相互作用,使微生物胞内细胞质流失,从而发挥良好的抑菌作用[25]。当压力为400 MPa时，微生物负荷下降至最低，微生物数量也随着壳聚糖浓度的增加而减少(图7-c)。对于加压时间(图7-d)，400 MPa/0.5%壳聚糖处理5 min后，好氧细菌计数仅为(10±4)CFU/100 mL。90 ℃/1 min和400 MPa，0.5%壳聚糖处理均未发现霉菌和酵母[对照组为(107±26)CFU/100 mL]。
a-巴氏杀菌；b-高压(HPP)；c-壳聚糖(CH)处理；d-保压时间
图7 不同参数对蓝莓复合果汁菌落总数的影响
为了更好地区分不同处理后的果汁样品差异，对挥发性成分进行电子鼻系统响应值的PCA评分(图8)。在第1主成分(PC1)方向上，最孤立的组为热处理组(90 ℃/1 min)，第1主成分(PC1)的方差贡献率为60.33%，第2主成分(PC2)方差贡献率为28.31%，第3主成分(PC3)方差贡献率为10.38%，对于蓝莓复合果汁风味的贡献率之和大于99%，远超85%。这种差异可能与W7(对硫化成分硫化氢等灵敏)和W9(对芳香成分、有机硫化物灵敏)传感器的响应值有关。它的机理现阶段仍不清楚，但有研究表明高压处理不能破坏共价键但热处理可以引起分子结构的改变，如二硫键。
超高压和壳聚糖的单独使用以及协同使用均对蓝莓复合果汁杀菌效果显著，增大压力、增加壳聚糖浓度和延长保压时间均可以有效提高杀菌效果。超高压处理蓝莓复合果汁的最佳工艺为预先协同添加0.5%壳聚糖处理，然后采用室温400 MPa处理5 min；巴氏杀菌条件为90 ℃处理1 min。
图8 不同杀菌处理果汁与原汁样品的PCA图
Fig.8 PCA diagrams of different sterilized juice and raw juice samples
3 结果与展望
浆果，如树莓、蓝莓和蔓越莓，都是膳食抗氧化剂的丰富来源，不同浆果汁的理化特性和香气成分存在显著差异。对于混合了花楸或蓝靛果的蓝莓果汁，感官评分和抗氧化能力随花楸或蓝靛果浓度的增加有相似的变化。新型浆果汁，比如蓝靛果和花楸，相比于其他的4种浆果汁氨基酸和多酚类物质的含量更高，抗氧化活性更强，香味成分和品种也更多，但由于其苦涩味致使感官评分相对较低，而蓝莓的感官评分则相对高。因此，通过对主成分和聚类分析最终筛选蓝莓、花楸、蓝靛果为复合果汁原料。本研究优化了高压与壳聚糖联合处理抑制微生物生长的实验条件，最终确定400 MPa保压5 min、添加0.5%壳聚糖为最终灭菌条件。
迄今为止，关于混合浆果汁抗氧化能力测定的数据较少，本研究可为后续科研和工业发展提供指导。然而，关于酚类化合物在人体中生物利用度、代谢和生物活性方面等问题仍需继续探究。同时，更好地理解食用浆果对健康产生积极影响的机制后，未来有望将不同浆果汁或相关产品应用于药产品中。
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