花生油含有丰富的不饱和脂肪酸和天然活性成分，如植物甾醇、生育酚等对身体有益的物质，是大多数老百姓喜欢的食用植物油，国内每年消费量在300万t左右[1]。但一些不法商贩为谋取利润，在花生油中掺入不同比例的大豆油、菜籽油和棉籽油等其他食用油[2]。根据GB/T 1534—2017《花生油》产品标准，棕榈酸C16∶0、硬脂酸C18∶0、油酸C18∶1、亚油酸C18∶2和花生酸C20∶0这5种脂肪酸是花生油中最主要的脂肪酸，且标准确定了其含量范围[3-4]。TIAN等[5]研究发现花生油中菜籽油掺入比例的增加会使油酸C18∶1含量显著增加，而棕榈酸C16∶0、硬脂酸C18∶0和亚油酸C18∶2含量显著降低。因此，可以通过研究花生油中5种脂肪酸的含量变化，来判断花生油中是否掺杂其他低价食用油。研究花生油的掺伪对于保护消费者的权益和维护市场秩序是非常重要的。
现在常用的检测花生油掺伪的方法有感官评价法、常规理化方法、色谱法和光谱法等[6]。近红外光谱法作为一种快速无损的检测手段，在食品掺假[7]、成分含量测定[8]和内部特征判别[9]等品质分析方面得到广泛应用。近红外光谱法是利用有机物中含氢基团(如C—H、N—H、O—H和S—H等)的R—H键在近红外光谱区域(780～2 500 nm)的倍频及合频吸收信息，实现对食品中油脂、蛋白质和水分等成分的快速定性和定量分析[10-11]。SUNDARAM等[12]利用近红外光谱法结合偏最小二乘法建立弗吉尼亚型带壳花生种子中脂肪酸的定量预测模型，结果显示模型的相对百分比偏差均大于3，说明这些模型可以很好地预测花生种子中脂肪酸的含量。目前利用近红外光谱对掺伪花生油的脂肪酸的快速测定研究较少。因此，本研究以不同的大豆油、菜籽油及棉籽油占比的掺伪花生油为检测对象，基于近红外光谱图特征吸收结合气相色谱法测定的脂肪酸含量，实现对掺伪花生油的快速鉴别分析。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
花生油-1，山东鲁花集团有限公司；花生油-2，金龙鱼集团有限公司；花生油-3，中粮福临门食品营销有限公司；大豆油，益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；菜籽油，山东鲁花集团有限公司；棉籽油，山东亿家福粮油有限公司；棕榈酸甲酯 (CAS 112-39-0)、硬脂酸甲酯 (CAS 112-61-8)、油酸甲酯 (CAS 112-62-9)、亚油酸甲酯 (CAS 112-63-0)、花生酸甲酯 (CAS 1120-28-1)，美国NU-CHEK公司；14%三氟化硼(BF3)-甲醇溶液，上海安谱科学仪器有限公司。
1.2 仪器与设备
7890A气相色谱仪，安捷伦科技(中国)有限公司；CP-Sil88色谱柱(100 m×0.25 mm×0.2 mm)，美国瓦里安技术中国有限公司；DA7200近红外光谱仪，瑞典波通仪器公司；AUW120D分析天平，日本岛津公司；SK8210HP超声波清洗机，上海科导超声仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品制备
将大豆油、菜籽油、棉籽油按不同的配比掺入25 ℃花生油-1中，得到不同比例的掺伪油样。以大豆油为例，大豆油掺伪比的含量分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%(质量分数)，菜籽油和棉籽油的掺伪比例同大豆油，并将样品编号分别以HdXX%、HcXX%、HmXX%命名(XX%为掺伪比)。每种配比30个平行样本，共计210个样本，全部作为校正集用于模型的建立。另调配50个未参与建模的样品用于模型的验证。将掺伪花生油置于烧杯中，充分搅拌，使其混合均匀。所有油样在4 ℃下保存，直至分析。
为确保不同品牌的花生油样品也适用于该模型，以市场销售量较大的金龙鱼、福临门为样本花生油-2、花生油-3，按花生油-1制备掺入大豆油、菜籽油、棉籽油，用建立的鉴别模型进行验证。同时，选用在花生油-1中掺入随机比例2种油样和掺入3种油样作为样品，混合均匀，用建立的鉴别模型进行验证。
1.3.2 样品甲酯化
采用BF3-甲醇法[13]甲酯化样品。称取50 mg油样置于25 mL圆底烧瓶中，加入1.5 mL 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液，超声10 min使其振荡混合，再置于40 ℃水浴锅中回流10 min。当溶液呈透明状时，向其中加入5 mL BF3-甲醇溶液，于水浴锅中沸腾回流2 min，使其完全甲酯化。再加入饱和NaCl溶液至瓶颈处，最后加入4 mL正庚烷，振荡。待分层后取上层清液进行色谱分析。
1.3.3 色谱条件
N2；进样口温度250 ℃；氢火焰离子化检测器温度300 ℃，分流比为30∶1；进样量1 μL。程序升温条件为：初温100 ℃，以5 ℃/min的速度升温至180 ℃，保持30 min，然后以3 ℃/min的速度升至240 ℃，保持8 min。
1.3.4 光谱条件
红外光谱仪预热稳定1 h后，油样通过蠕动泵注入到样品池中，在950～1 800 nm的波长范围内进行近红外透反射光谱扫描。扫描前将油样充分摇匀，避免扫描区域产生气泡。仪器分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次。以空气作参比，每个油样采集3次光谱数据，取其平均值作为最终数据进行分析。
1.4 数据处理
近红外光谱图中提取特征吸收峰和相应的波长，其对应的吸光度作为特征峰参数，吸光度的比值分别作为横、纵坐标，结合近红外特征峰的其他信息，利用Origin 9.0软件作判别分析图。
将光谱数据导入Unscrambler10.4软件中，使样品的近红外光谱数据与气相色谱测定值一一对应。采用一阶导数、二阶导数、Savitsky-Golay(SG)平滑和标准归一化法等光谱预处理方法对谱图数据进行预处理，选出最佳预处理方法，利用偏最小二乘法建立花生油中5种特征脂肪酸含量的定量模型，同时采用内部交叉验证法对该模型进行检验。所建模型用校正集相关系数
验证集相关系数
测集决定系数
校正集均方根误差(root mean squared error of calibration，RMSEC)、交互验证集均方根误差(root mean squared error of cross-validation，RMSECV)和预测集均方根误差(root mean squared error of prediction，RMSEP)等6个参数对模型进行评价。通常，
和
越大、RMSEC、RMSECV和RMSEP越小，模型的预测能力越好[14]。
2 结果与分析
2.1 五种特征脂肪酸及4种油样样品的气相色谱图
将5种特征脂肪酸混标和4种植物油样进行甲酯化处理后，进行气相色谱分析，如图1所示，4种油样的脂肪酸在10～40 min之间全部出峰，标准品和样品中主要脂肪酸之间亚油酸C18∶2、油酸C18∶1、硬脂酸C18∶0、棕榈酸C16∶0和花生酸C20∶0可以很好地分离，且峰形良好。
图1 五种脂肪酸混标及4种油样脂肪酸甲酯色图谱
Fig.1 Chromatogram five fatty acid mixtures and four oil-like fatty acid methyl ester
2.2 掺伪花生油特征脂肪酸含量的变化
对实验中4种植物油脂肪酸甲酯化后5种特征脂肪酸测定含量如表1所示，油样样品中的5种特征脂肪酸含量有所不同。
表1 四种油样的特征脂肪酸含量 单位:%
Table 1 Characteristic fatty acid content of four oil samples
脂肪酸名称缩写花生油大豆油菜籽油棉籽油棕榈酸C16∶010.2011.255.1223.55硬脂酸C18∶03.313.282.622.56油酸 C18∶138.2228.6049.5617.94亚油酸C18∶234.4548.5126.5555.26花生酸C20∶01.800.450.290.34
通过将大豆油、菜籽油、棉籽油按不同的配比掺入花生油中，得到不同比例的模拟掺伪油样，得到表2数据。
表2 不同比例的掺伪花生油中特征脂肪酸含量 单位:%
Table 2 Characteristic fatty acid content in different proportions of adulterated peanut oil
油样名称棕榈酸硬脂酸油酸亚油酸花生酸Hd10%10.353.3737.2835.861.68Hd20%10.443.4236.3237.431.50Hd30%10.553.4635.3338.681.40Hd40%10.633.5334.2640.151.23Hd50%10.783.5733.4641.351.12Hd60%10.863.6132.4342.810.91Hd70%11.053.6531.4044.300.72Hc10%11.533.20536.1336.491.65Hc20%12.863.1134.0638.521.50Hc30%14.193.0231.9940.561.36Hc40%15.522.9229.9242.591.21Hc50%16.852.8327.8544.631.06Hc60%18.182.7325.7846.660.91Hc70%19.512.6423.7148.700.76Hm10%9.663.2139.3333.661.65Hm20%9.123.1240.4632.861.50Hm30%8.583.0341.5932.071.34Hm40%8.042.9442.7231.271.19Hm50%7.512.8543.8530.481.04Hm60%6.962.7644.9829.680.89Hm70%6.422.6746.1128.890.74
由表1、表2可知，当大豆油、棉籽油和菜籽油掺入至花生油时，其特征脂肪酸的含量发生明显变化。其中，亚油酸和棕榈酸变化最为明显，因此可作为鉴别掺伪的标志物。以GB/T 1534—2017《花生油》规定的脂肪酸含量范围为参考值，当测得油样中脂肪酸含量不在此范围内，可初步判定此油样存在掺伪情况。
2.3 原始光谱的测定
由图2可看出，所有掺伪油样的近红外光谱曲线变化趋势基本一致，并且在1 205、1 395、1 415 nm有强烈的吸收峰，在1 170 nm处有较小的吸收峰。1 170 nm和1 205 nm处吸收峰为油脂中甲基、亚甲基的C—H键的二级倍频伸缩振动吸收信息[15-16]，1 395 nm和1 415 nm处吸收峰为亚甲基中的C—H键的合频伸缩振动吸收信息[17]。此外，已有研究证实食用油中普遍含有甲基、亚甲基2种基团[18]，表明这些波长下的光谱信号可以用于分析掺伪花生油中特征脂肪酸含量的变化情况。
图2 掺伪花生油红外光谱图
Fig.2 Infrared spectra of adulterated peanut oil
2.4 掺伪花生油的定性判别分析
由图2可知，1 170、1 205、1 395、1 415 nm处吸收峰的出现及吸收峰强度的差异可以反映花生油中脂肪酸含量的变化，因此将4个波长处的吸收峰确定为特征峰，相应的吸光度作为特征峰参数[19]。以(A1 170 nm/A1 415 nm)的比值作为横坐标，(A1 205 nm/A1 395 nm)的比值作为纵坐标，从而将复杂的光谱数据转换成简单直观的分布图进行分析。由图3可知，掺伪花生油的A1 170 nm/A1 415 nm值为0.60～0.66，A1 205 nm/A1 395 nm值为1.35～1.63。可以很好地表现出花生油在掺伪过程中吸光度比值的变化。而纯花生油和掺伪花生油信息点之间的分布有明显的区别，因此可以初步判别出掺伪花生油和纯花生油。
图3 掺伪花生油吸光度比值
Fig.3 Absorbance ratio of adulterated peanut oil
2.5 掺伪花生油鉴别模型的建立
如表3所示，除油酸外，其他4种脂肪酸验证集样品的真实值和近红外的预测值存在较好的相关性，其中棕榈酸模型的相关性最好(校正集和验证集的决定系数分别为0.997和0.995，均方根误差分别为0.014和0.018)。表明该方法对定量分析棕榈酸含量是可行且稳定的。
表3 五种脂肪酸定标模型一元线性方程
Table 3 Univariate linear equations for five fatty acid calibration models
脂肪酸最佳预处理方法主成分个数校正集验证集回归方程R2CRMSEC回归方程R2CVRMSECVC16∶0一阶导数+SG平滑3y=0.997 5x+0.002 70.9970.014y=0.997 9x+0.002 30.9950.018C18∶0一阶导数+SG平滑3y=0.978 5x+0.008 70.9780.021y=0.969 8x+0.013 10.9570.029C18∶1二阶导数+SG平滑3y=0.902 8x+0.434 70.9020.391y=0.581 4x+1.824 70.5500.844C18∶2二阶导数+SG平滑3y=0.971 2x+0.127 10.9710.291y=0.897 1x+0.416 80.8760.605C20∶0二阶导数+SG平滑3y=0.965 7x+0.000 60.9650.001y=0.955 5x+0.000 80.9350.001
2.6 实验模型的验证
为验证所建模型预测结果的准确性、重复性和适用性，重新调配5个油样，利用气相色谱法和鉴别模型分别测出棕榈酸含量，结果如表4。样品总体的真实值与预测值的相关系数0.999，RMSEP为0.052，表明所建立的测定棕榈酸含量的近红外模型预测效果较好。
表4 花生油样品棕榈酸(C16∶0)实测值与预测值比较
Table 4 Measured and predicted value of palmitic acid (C16∶0) of peanut oil sample
化学值/(mg·mL-1)预测值/(mg·mL-1)误差绝对值/(mg·mL-1)相对误差/%0.843 70.826 50.017 22.038 60.994 50.997 50.003 00.301 61.039 61.041 40.001 80.173 11.105 41.104 50.000 90.081 41.652 61.767 80.115 26.970 8
2.7 实验模型的应用
随机在花生油2、花生油3中选取调配10个油样和8个在花生油1中掺入多种混合油进行检测用来验证实验模型的准确性，利用气相色谱法和鉴别模型分别测出棕榈酸含量，结果如表5、表6所示，不同品牌花生油样品总体的真实值与预测值的相关系数0.997，RMSEP为0.015；在花生油掺入多种油样样品总体的真实值与预测值的相关系数0.999，RMSEP为0.014,结论表明对不同品牌花生油掺伪、多种混合油掺伪具有同样的适用性。
表5 两种花生油样品棕榈酸(C16∶0)实测值与预测值比较
Table 5 Measured and predicted values of palmitic acid (C16∶0) of two peanut oil samples
化学值/(mg·mL-1)预测值/(mg·mL-1)误差绝对值/(mg·mL-1)相对误差/%0.871 60.883 20.011 61.330 80.943 5 0.955 2 0.011 7 1.235 10.986 1 0.994 3 0.008 2 0.835 71.010 4 1.018 6 0.008 2 0.814 31.124 1 1.131 0 0.006 9 0.617 41.245 6 1.253 4 0.007 8 0.624 11.341 6 1.353 6 0.012 0 0.892 41.423 4 1.435 1 0.011 7 0.819 41.551 4 1.570 6 0.019 2 1.238 21.601 2 1.622 4 0.021 2 1.324 3
表6 花生油掺入多种油脂棕榈酸(C16∶0)实测值与预测值比较
Table 6 Measured and predicted value of palmitic acid (C16∶0) in peanut oil samples mixed with other oils
化学值/(mg·mL-1)预测值/(mg·mL-1)误差绝对值/(mg·mL-1)相对误差/%0.851 2 0.863 2 0.012 0 1.415 0 0.936 1 0.939 1 0.003 0 0.315 4 1.054 3 1.058 5 0.004 2 0.401 2 1.134 1 1.140 8 0.006 7 0.594 3 1.214 5 1.226 5 0.012 0 0.984 9 1.354 7 1.368 6 0.013 9 1.024 1 1.551 2 1.572 0 0.020 8 1.341 2 1.601 5 1.621 4 0.019 9 1.241 3
3 结论与讨论
本文研究采用BF3-甲醇方法甲酯化油样，结合气相色谱法和近红外光谱法对掺伪花生油中5种特征脂肪酸及含量，同时对掺伪花生油进行定性定量分析。结果表明花生油中掺入不同配比的菜籽油、棉籽油、大豆油时，利用气相色谱法研究花生油中5种特征脂肪酸含量呈现一定的变化规律。花生油中掺入不同配比的菜籽油、棉籽油、大豆油时，通过近红外光谱的特征波长1 170、1 205、1 395及1 415 nm处的R—H基团峰型、峰强变化的光谱图，结合特征波长吸光度的比值，可区别花生油的掺伪。同时对不同品牌花生油掺伪、多种混合油掺伪具有同样的适用性。
综上所述，通过近红外光谱能够快速检测到棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和花生酸这5种花生油中的主要脂肪酸及其含量变化，以此来快速判断花生油的掺伪问题。
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