牦牛是一种草食性反刍家畜，主要生活在我国甘肃天祝甘南等高寒地区[1-2]。牦牛乳被称为天然浓缩乳[3]，含有大量的蛋白质、必需氨基酸、脂肪及乳糖[4]。牦牛乳中干物质含量高达17.86%～18.36%；乳脂含量达到6.50%～7.50%(最高可达10%)，平均比荷斯坦牛乳高出1倍以上[5]，是高原地区牧民主要营养来源。已有研究证实，牦牛乳中的风味几乎全部来源于乳脂肪[6]。而脂蛋白脂肪酶(lipoprtein lipase,LPL)与乳中乳脂肪球(milk fat globules，MFG)结合，造成牦牛乳乳脂肪球膜(milk fat globule membrane，MFGM)的大量破裂，在LPL的作用下，乳脂肪的甘油三酯(triglyceride，TG)被水解，产生大量的中、短链游离脂肪酸等挥发性成分转化的甲基酮、酯、醇和醛等风味物质可以直接影响牦牛乳的风味[7]。这种特殊风味是牦牛乳的重要标志[8]。牦牛乳中的饱和脂肪酸含量较高，多不饱和脂肪酸含量较低，与普通牛乳有明显差异[9]，这些差异导致牦牛乳的乳香风味与普通牛乳有较大的区别。LUO等[10]发现，与普通牛乳相比，MFGM中存在脂质结构域，且MFGM数量更多，粒径分布范围更宽。牦牛乳脂肪颗粒大，且表面富含乳脂肪球[11]。因牦牛乳具有较大的脂肪颗粒，使其MFGM在剪切力的作用下表现得更加脆弱和敏感[12-14]，加之牧区放牧地点分散，产区交通不便，生鲜牦牛乳收集困难，收购、冷藏、运输都存在诸多问题，导致新鲜牦牛乳在到达加工场所之前很容易发生风味劣变。
因为牦牛乳具有极高的营养价值，已成为高端乳品的重要原料，产量逐年上升，人们对牦牛乳的关注也明显增加，但目前对牦牛乳的研究还处于初步阶段。牦牛乳与普通牛乳的风味有很大的差异，为了对牦牛乳的进一步开发利用提供理论基础，研究牦牛乳其特殊的风味就显得尤为重要。而牦牛乳的风味几乎全部来源于乳脂肪，为更好地保存和调控牦牛乳的特殊风味，本文对作用于牦牛乳脂肪而产生脂肪酸进而影响风味的内源性LPL自身的性质、分离提纯方法以及影响牦牛乳风味的机制进行了综述。
1 内源性LPL的发现
LPL的发现至今已30多年，最初被称为澄清因子[15]。脂蛋白脂肪酶全称为三脂酰甘油蛋白脂酰基水解酶，但习惯上将它称为脂蛋白脂肪酶[16]。LPL是脂蛋白代谢的中心酶，介导循环乳糜微粒(chylomicron，CM)和极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)LPL中的TG结合降解为甘油和脂肪酸[17]。除脂蛋白脂类外，LPL还能催化水溶性短链脂酰酯底物的水解，如对硝基苯乙酸酯和对硝基苯丁酸酯[18-19]。为了最大程度水解长链脂肪酸酯，该酶需要载脂蛋白C-Ⅱ[20-21]，这是富含甘油三酯脂蛋白和高密度脂蛋白的一种蛋白质成分[22]；载脂蛋白C-Ⅱ不能增强水溶性底物或短链甘油三酯(如三丁基甘油三酯)的水解。在哺乳动物中，这种酶在脂肪组织、心脏、肌肉和泌乳乳腺中产生，在许多其他组织中也有少量产生。
LPL基因位于染色体8p22上，跨度30 kb，分为10个外显子。在20世纪80年代，已成功从人、鸡、牛和小鼠中克隆到了LPL基因, 并进行了序列分析。通过比较人与其他哺乳动物和畜禽类动物LPL基因的一级结构发现具有高度的同源性，且人类 LPL、肝脂酶以及胰脂酶的氨基酸序列也具有高度同源性, 推测三者可能起源于同一个基因家族, 具有共同的作用机制。
2 LPL的分离纯化
最早分离脂蛋白脂肪酶是从20世纪70年代开始，用物理方法处理，将脱脂乳离心得到悬浮液，将悬浮液进行冷冻干燥，得到干燥的粉状物，但该方法得到的粉状物酶活力较低[23]。OLIVECRONA等[24]通过利用丙酮-乙醚沉淀脱脂乳中的LPL，虽然得到的酶活力较低，但提供了新的方法。后来，OLIVECRONA等[25]对试验进行改进，首次成功采用亲和层析的方法从乳中大量地分离出LPL，利用肝素与琼脂糖依靠共价键结合合成肝素-琼脂糖凝胶，做为基质，利用NaCl溶液进行梯度线性洗脱，收集LPL后进行酶比活力、回收率以及纯化倍数分析。结果表明，LPL比活力为165，回收率达到50%，LPL被纯化2 000倍。EGELRUD等[26]将2种方法结合起来，利用凝乳酶将脱脂乳中的蛋白沉淀下来，将得到的上清液采用(NH4)2SO4盐析的方法将蛋白继续沉淀，离心后得到悬浮液，将该悬浮液上样后，用肝素-琼脂糖凝胶进行分离，用NaCl溶液作为流动相对LPL进行线性梯度洗脱，分析其回收率、纯化倍数和LPL的分子质量，结果表明大约有67%的LPL被洗脱出来，共收集洗脱液100～170 mL，LPL纯化倍数达到5 000～7 000倍，分子质量为62 k～66 kDa。LPL的酶活力能被1.0 mol/L的NaCl溶液抑制，但能被牛血清激活。
不同物质对酶活力的影响不同，不同样本中的LPL对乳的自发脂解作用也不一样[27]。为了定量不同样本中的LPL， GOERS等[28]建立了直接夹心酶联免疫吸附试验法，使用亲和纯化的抗牛LPL鸡免疫球蛋白。该夹心酶联免疫吸附试验包含一个与微滴度井结合的捕获抗体和一个生物素化的第二抗体用于检测捕获的LPL。GERSHENWALD等[29]描述了一种非竞争性酶联免疫吸附试验方法，该方法用禽类脂肪LPL蛋白预涂板。BABIRAK等[30]利用单克隆抗体(mAb) 5D2作为一抗和二抗，建立了一种夹心免疫分析法，用于定量人血浆中免疫反应性LPL二聚体。酶联免疫吸附试验，首次用于定量不同生物标本中的LPL[31]，由于类似的敏感性和特异性，酶联免疫吸附试验逐渐被取代，LPL的定量目前采用不同的酶免疫分析放射免疫检定法。灵敏的非放射性同位素方法也可以用于检测肝素后LPL，使用酶法测定释放的游离脂肪酸[32]。
3 LPL的结构与功能
LPL是一种含有2个N-联寡糖的糖蛋白，它作为同型二聚体存在，分子质量为60 kDa[33]。早在1987年，WION等[34]就克隆得到了人类LPL的全长cDNA序列, 其开放读码框(open reading frame,ORF)包含1 428 bp，编码475个氨基酸的蛋白质, 包括1个由27个氨基酸残基组成的疏水信号肽。1989年DEEB等[35]最先从基因文库中分离出LPL基因，并测定了它的全部核苷酸序列。
LPL的一级结构为在一个多肽链中有450个氨基酸残基，在多肽链中可以识别多个功能区域。比较不同样本的LPL一级结构，发现人和其他哺乳类动物的LPL的二硫键高度相似以及序列同源性，特别是形成PL催化结构域的链，表明这些脂肪酶的整体结构，特别是催化结构域内的结构非常相似。
目前LPL的二级结构尚不明确，根据人胰脂酶结构推测出LPL分子三维结构，存在C端和N端2个结构域[36]。Asn43是N端区一重要的糖基化位点，该位点维持着LPL的正常三维结构，在酶活性表达中是必需的[37]。C端区呈一个折叠的柱状连接在球形的N端区，C端区的功能尚有争议，多数认为与介导酶与底物接触，形成活性的LPL同源二聚体以及间接参与酶解过程。LPL催化活性中心的3个氨基酸分别为Ser132、His241和Asp156，调节底物与LPL的结合[38]。在LPL的氨基端域的中心同源区域内，有更多的极性残基疏水。因此，他们破坏密码子位于外显子4、5和6的LPL基因代码的高度保守的残留物形成LPL的催化域的一部分，在这个LPL的关键地区会直接影响酶的活性部位、中断构象和折叠。研究表明，该区域少部分氨基酸的取代(75、176、188、195和244)可能会影响活性LPL同型二聚体的形成和稳定性[39]。与氨基端不同，LPL羧基端结构域的功能突变很少，这表明该区域的氨基酸替换具有更好的耐受性。在LPL 382和LPL 447中，单点突变导致一个提前终止密码子的引入和一个截断酶的合成[40]。LPL 447[41]对三油酸和三丁酸底物都保持了显著的活性，而LPL 382是无功能的。这些结果证明了LPL的氨基端结构域在LPL催化功能中的重要作用，以及LPL的氨基端和羧基端在活性LPL同二聚体的形成和维持中的重要作用。
LPL包含19个酪氨酸和8个色氨酸残基[42]。除二肽、Glu- Lys (位置423 - 424)和2 Lys (位置416和488)外，大部分胰蛋白酶肽被分离和分析。用气相色谱仪对LPL的NH2末端进行序列测定，确定其NH2末端为Asp，而COOH末端为Gly，经羧肽酶Y断裂。该酶含有10个半胱氨酸残基，均存在于二硫键中。它们形成于Cys29与Cys42、Cys218与Cys241、Cys266与Cys285、Cys277与Cys280、Cys420与Cys440之间。LPL和其他脂肪酶的区别在于活性位点Ser134旁的基本残基，上游5残基，下游6残基。
像人类脂肪酶一样，LPL包含一个由217～238个残基组成的盖子，它覆盖了催化位点，需要重新定位以允许底物进入催化域。对盖子的二级结构进行分析，发现了2个由7个和11个氨基酸残基组成的高度两亲性螺旋，这是乳化底物水解所必需的[43]。在其不活跃状态下，LPL盖子是关闭的，防止LPL经二聚物底物进入催化位点[44]。初始LPL的脂蛋白基质相互作用,可能由羧基末端域，结果在一个构象变化导致LPL的盖子和接触的疏水性或非极性盖子残留物,这一过程称为界面激活[45]。脂肪酶的X射线结晶学也证明了类似的机理。正如其所证明的那样，LPL盖子的重新定位可能导致大面积的疏水区域暴露，并形成一个由作为脂肪酶主链一部分的氨基酸疏水侧链或盖子的两亲螺旋排列的裂缝。脂肪酸链与疏水峡谷结合，允许甘油三酯底物进入催化位点，最终导致甘油三酯水解。
4 影响内源性LPL活性的因素
当前研究者对内源性LPL活性的影响因素及调控方式进行了研究，其内在影响因素主要包括乳脂肪大小、酪蛋白、物理性质(pH值和离子强度等)；外在影响因素主要包括贮藏温度、耐热性、底物特异性、脂肪球膜完整性、抑制剂、激活剂、机械处理(均质、搅拌等)，这些因素均会影响内源性LPL的活性，进而影响牦牛乳的脂解作用和劣变风味物质的产生。
4.1 内在因素
4.1.1 酪蛋白
研究表明，牦牛乳大部分的LPL活性与酪蛋白组分有关[46]，LPL在乳血清中的稳定性不如与酪蛋白胶束结合的稳定性，尽管在超过25 ℃的温度下，稳定性差异不明显。ANDERSON[47]发现，乳中的脂肪酶活性(以三丁酸酶活性测定)在2 ℃下更不稳定，三丁酸酶是通过加入NaCl从酪蛋白胶束中分离出来的，这表明与胶束的结合使酶具有一定的稳定性。LPL与胶束的解离降低了酶的稳定性，从而导致血清LPL稳定性较低。血清和酪蛋白LPL之间的稳定性差异在较高的温度下降低了，因为在较高的温度下，酪蛋白以胶束形式存在的比例会更大[48]。研究表明，乳血清中可能含有影响LPL稳定性的因素。解离的LPL在这个因素的存在下可能不太稳定。
4.1.2 物理性质
温度和pH能够有效影响LPL的活性，在一定范围内，随着温度和pH的不断升高，LPL的活性先升高，达到某一最大点后逐渐下降[49]。其活性在pH 7.0～8.5时最活跃，在强酸强碱条件下易失活。LPL在pH 5.0～7.0酶活性较稳定。
4.2 外在因素
4.2.1 贮藏温度
LPL对温度敏感，85 ℃杀菌10 s，便会完全失活；在50 ℃时，其活性保持稳定，但在pH 6.5处理15 min时，LPL失去活性；在25 ℃放置24 h，一方面会使得LPL失活，另一方面，有研究报道认为纯化的LPL在31 ℃会出现氧化的现象[50]。在高温，短时间巴氏杀菌(72 ℃,15 s)灭活了大部分牛乳中的酶[51]，因此，LPL在巴氏杀菌乳和巴氏杀菌乳衍生产品中引起的脂解作用很小。
4.2.2 底物特异性
底物的特异性对LPL活性有一定的影响。加入人血清可提高脂肪酶活性。牛血清白蛋白也能提高脂肪酶活性[52]，但其最大活性低于人血清。另一方面，鸡蛋白蛋白的添加抑制了脂肪酶的活性。高浓度NaCl对LPL活性有强烈的抑制作用[53]，而对脂肪酶活性有增强作用。而在日本黄鼠中，该酶能水解甘油三酯，不需要添加血清。而且有研究表明，该酶对血清辅助因子没有绝对的需求，而血清辅助因子只是为了达到最大的反应速率。LPL活性测定的主要是反应混合物中是否存在血清。这说明NaCl作用于酶、血清辅因子和底物之间的相互作用，而不是作用于酶的活性部位。此外，鞘磷脂(sphingomyelin，SM)强烈抑制脂蛋白脂肪酶介导的脂肪分解在单层膜[54]和乳状颗粒[55]中。研究表明，SM抑制LPL活性是通过增加头基的堆积和增大乳剂表面单分子层的疏水脂脂相互作用，而不是通过SM和LPL之间的特定相互作用[56]。NO-1886(通用名Ibrolipim)是日本大冢制药厂开发的一种新型LPL激活剂。GELDENHUYS等[57]研究了一种具有LPL激活特性的新型小型有机化合物的鉴定该先导化合物名为C10 d，通过体外高通量筛选鉴定，与NO-1886相比，其LPL激活能力是NO-1886的2倍。
4.2.3 脂肪球膜完整性
MFGM是目前最受关注的功能性乳制品之一。它是由乳腺上皮细胞分泌的一种复杂的生物膜，能吞噬乳脂，从而使乳脂形成脂肪滴并悬浮在乳基质中[58]。MFGM由蛋白质、磷脂、脂肪酸和酶组成，它们具有抗感染、抗癌、抗肿瘤等重要的生物学功能[59]。其作为一种乳化剂，起着保护脂肪球的作用，阻止 LPL 直接进入脂肪球内部与甘油三酯结合而发生脂解作用，如果乳中 MFGM 完整无损，LPL 的脂解作用会被阻止，只有分布在脂肪中的 LPL 才有机会与脂肪球中的甘油三酯结合而发生脂解作用。然而，机械和热处理会破坏乳脂肪球的固有结构[60]。使MFGM 失去了对脂肪球的保护作用，在这种情况下，脂肪外的LPL 会直接穿过乳脂肪球膜与内部的乳脂肪球中的甘油三酯反应而使得脂解作用容易发生。因此MFGM是否完整会影响LPL对牦牛乳的脂解作用。
5 内源性LPL对牦牛乳风味影响的机制
内源性脂蛋白脂肪酶是一种糖蛋白酶，主要水解CM及VLDL中的TG[61]。LPL参与了乳腺中乳脂甘油三酯的合成，它在牛奶中的存在是由于这种乳腺的溢出。研究发现，内源性LPL才是TG水解的关键酶[62]。哺乳动物乳中内源性LPL的含量和分布决定了乳中脂肪的脂解作用和程度，且不同乳中内源性LPL分布不同。LPL具有位置特异性而非脂肪酸特异性[63]，它催化从甘油三酯分子的sn-1和sn-3位置的脂肪酸水解[64]。脂肪酸在重排后才从2-单甘油酯释放为1(3)-单甘油酯[65]。有学者研究发现，在内源性LPL的作用下，可将乳脂肪降解产生4～10 C的游离脂肪酸，如丁酸等；同时，光化学降解硫胺素生成的产物与H2S反应生成的芳香族化合物能够使乳及其制品产生橡胶气味[66-68]。而且乳脂肪中的TG被LPL水解，产生的中、短链游离脂肪酸等挥发性成分可以转化为其他的风味化合物，如酮、酯、醇和醛，这些物质能够直接影响牦牛乳的风味。乳脂肪的水解程度和速率取决于LPL的活性[69]。不同乳畜的LPL基因会因发生突变，而表达成不同的LPL。因此不同乳畜品种会因其内源性LPL的一级序列及空间构象的较大变化，导致乳中LPL的活性不同[70]；牦牛乳脂肪球粒径较荷斯坦牛乳大，乳脂肪球膜会更易受到破坏，更易于被内源性LPL脂解产生游离脂肪酸[71]；同时外界环境也会对内源性LPL的活性产生重要影响。
通常鲜牦牛乳需经过冷藏和长时间运输，才能用于大规模乳制品的生产，但是冷链运输以及冷藏会为一些嗜冷菌提供生存环境，如假单胞菌、芽孢杆菌、微杆菌、乳球菌、不动杆菌、哈夫尼菌等[72]。当这些嗜冷菌作用于牦牛乳会使其风味更易受到微生物脂肪酶的影响[73]。而且在低温运输过程中，乳清中游离的LPL会转移到脂肪上，使脂肪的脂解作用更强。研究发现，低温储存24 h后，未脱脂鲜乳中的LPL活性明显增加；此外，在冷却条件下，乳中的LPL吸附到MFGM，并与TG结合从而降解脂肪产生游离脂肪酸，这些游离脂肪酸进一步氧化生成戊醛、己醛、壬醛、二甲基二硫化物、丙酮、戊酮、甲基酮、2-丙醇等物质，进而使牦牛乳产生酸臭和异味等问题。因此，内源性LPL是导致牦牛乳产奶后风味劣变的重要因素。
6 展望
牦牛乳营养丰富，乳中蛋白质、脂肪含量均高于其他牛种。因其特殊的生存环境导致牦牛乳风味与普通牛乳及其他乳存在较大差异，且牦牛乳的特殊风味基本全部来源于乳脂肪，而内源性LPL可以作用于乳脂肪中的甘油三酯发生脂解作用产生游离脂肪酸，从而影响牦牛乳的风味。但由于牦牛乳内源性LPL的含量本身较低，分离纯化困难，其酶活性及其对牦牛乳风味标志物影响的作用机制不明确，国内对研究牦牛乳内源性 LPL研究不多。所以本文进一步对牦牛乳中LPL的分离纯化方法、结构功能、酶活性的影响因素及牦牛乳体系中劣变风味物质的影响机制进行了综述，以期为实现牦牛乳风味的稳态化调控提供依据。
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