蚕豆(broad bean)也称胡豆、罗汉豆等，是我国重要的经济作物之一，蚕豆中蛋白含量丰富，约占其干重的25%～30%，仅次于豆科植物中的大豆[1]。蚕豆蛋白中氨基酸组成与人体和动物所需比例类似，是一种优质的植物蛋白，而且有研究发现蚕豆蛋白赖氨酸含量比其他谷物类高出3倍[2]。蚕豆还具有一定的医用价值，在健脾、降血脂和治疗慢性肾炎等方面具有良好的效用[3]。此外，研究发现适量摄入蚕豆时，其含有的原花青素、植酸、凝集素等抗营养因子对人体具有抗氧化、预防肥胖、抗肿瘤等生理功能[4-5]。
微生物在食品中的应用能够使食品的口感和成分发生变化，将微生物发酵技术作用于大豆、米糠、麦麸等农作物时，可以改善膳食纤维品质，有效降解各种抗营养因子及有毒成分[6]。张莉丽等[7]利用植物乳杆菌发酵降解低温豆粕乳，发现豆粕蛋白结构发生了改变，功能特性也得到提高。LICANDRO等[8]提到在豆类产品中，利用乳酸菌发酵，可以抑制氨基酸脱羧微生物的发育，防止生物胺的积累，减少霉菌毒素的积累并抑制病原体的发展。刘慧菊等[9]在进行了单株菌种液体发酵蚕豆粉后发现，经微生物液体发酵后蚕豆的营养价值明显提高。
近年来，随着高寒地区农业技术的发展，蚕豆市场需求量不断增大，但我国在蚕豆深加工方面起步较晚[10]，将微生物发酵技术应用到蚕豆中，或许可以提高蚕豆的综合利用，开发具有创新意义的新产品。本实验采用植物乳杆菌(ZR)、嗜热链球菌(SL)和嗜酸乳杆菌(SS)对青海脱脂蚕豆粉进行液态发酵，由于单一菌种发酵时，发酵风味和香气不够浓郁，口感相对单一[11]，因此将这3种菌种分别进行两两复配及三菌复合作为发酵剂，发酵后对发酵液理化性质、发酵前后脱脂蚕豆粉理化性质与功能特性进行检测对比，以期选出最优复配菌种，从而获得高营养价值的蚕豆蛋白质及其他活性多肽，为蚕豆高活性多肽物质及易消化性蛋白质的制备奠定应用基础，也为青海省蚕豆农产品的精深加工奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冻干蚕豆粉、新鲜蚕豆，采集于青海省大通县；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)冻干粉、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)冻干粉，中国工业微生物菌种保存中心；植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)冻干粉，中国农业微生物菌种保存中心；考马斯蓝G-250、福林酚试剂，北京索莱宝科技有限公司；MRS肉汤培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；牛血清白蛋白、L-酪氨酸(纯度99.0%)，上海吉至生化科技有限公司；乙醇、磷酸、NaOH、Na2CO3等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
PHS-3C精密酸度计，上海佑科仪器仪表有限公司；UV-2600紫外分光光度计，岛津企业管理有限公司；HZQ-X100振荡培养箱，上海百典仪器设备有限公司；CP-500流变仪，广州莱美科技有限公司；ALPHAL-2LDplus冷冻干燥机，北京陆德恒泰商贸有限公司；KC-130小型粉碎机，北京开创同和科技发展有限公司；LR10M大容量冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司。
1.3 试验方法与设计
1.3.1 脱脂蚕豆粉的制备
精确称取100 g干燥蚕豆粉于1 000 mL的锥形瓶中，按质量比1∶5加入石油醚，40 ℃水浴条件下放置3 h后抽滤，室温下晾至石油醚挥发完全，即得脱脂蚕豆粉。
1.3.2 液体培养基的制备
称取4.83 g MRS肉汤培养基与100 mL蒸馏水混匀，在121 ℃下高压蒸汽灭菌15 min，结束后冷却至室温备用。
1.3.3 复合菌种活化与扩大培养及发酵菌液制备
1.3.3.1 菌种活化
嗜酸乳杆菌(SS)、植物乳杆菌(ZR)、嗜热链球菌(SL)两两复配及三菌复合，按同等比例加入到灭菌后的10 mL MRS肉汤培养基中，参考孙葳[12]的方法进行活化。
1.3.3.2 发酵菌液制备
将扩大培养的菌液按5%(体积分数)接种量接种于相应的液体培养基中，在相应最适条件下，按照测得的菌种生长对数期时间培养，制成发酵菌液。
1.3.4 脱脂蚕豆粉液态发酵
称取20 g脱脂蚕豆粉于100 mL、65 ℃灭菌过的蒸馏水中，搅拌均匀，采用紫外灯照射30 min后，加入6 mL已培养好的发酵菌液，按表1所示条件进行48 h液态发酵后取样，保存至冰箱[9]。
表1 复合菌种发酵条件
Table 1 Fermentation conditions of composite bacteria
组别温度/℃料水比(g∶mL)接种量/mL转速/(r·min-1)pHZR+SL371∶561206.5ZR+SS371∶561206.5SS+SL371∶561206.5ZR+SL+SS371∶561206.5
1.3.5 液态发酵前后脱脂蚕豆粉发酵液理化性质的测定
蛋白酶活性测定：参照GB/T 28715—2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法》，采用福林酚法测定蛋白酶活性。
多肽含量测定：参考鲁伟等[13]的方法，测定发酵液中多肽的含量。
1.3.6 液态发酵前后脱脂蚕豆粉理化性质及功能特性的测定
可溶性蛋白质含量测定：参考罗娟[14]和张永芳等[15]的方法，采用考马斯亮蓝进行测定。
蛋白提取：参考叶婷[16]和AROGUNDADE等[17]的研究，采用碱溶酸沉法提取。
蛋白吸水量和吸油量的测定：参考付嘉阳等[18]的方法测定。
蛋白持水性与持油性的测定：参考孔慧广[19]的方法测定，
蛋白起泡性与泡沫稳定性的测定：参考付嘉阳等[18]的方法测定。
蛋白凝胶特性的测定：参考张蒙琪[20]和周旭霞等[21]的方法，利用质构分析仪测定凝胶弹性和凝胶硬度。
蛋白黏度的测定：将底物浓度为1%的大豆蛋白溶液用NDJ-8S型黏度计测定大豆蛋白的黏度[22]。
1.4 实验数据分析
采用SPSS 21.0软件对数据进行显著性分析，结果表示为
以P<0.05表示显著性差异。
2 结果与分析
2.1 最佳接种时间的确定
微生物在对数期代谢活力强，繁殖能力强，可作为发酵工业生产上的优良种子，本实验采用比浊法，分别对ZR+SL、ZR+SS、SS+SL以及ZR+SL+SS的复合菌的种子液进行了浓度测定，绘制生长曲线，找出各复合菌种的对数生长期末期，如图1所示，ZR+SL、ZR+SS、SS+SL以及ZR+SL+SS的对数期分别为12～14 h、8～14 h、14～16 h、18～22 h，所以种子液接入脱脂蚕豆粉中的最佳培养时间为14、14、16、22 h，此时为各菌种发酵液最佳接种时间。
a-植物乳杆菌+嗜热链球菌(ZR+SL)；b-植物乳杆菌+嗜酸乳杆菌(ZR+SS)；c-嗜酸乳杆菌+嗜热链球菌(SS+SL)；d-植物乳杆菌+嗜热链球菌+嗜酸乳杆菌(ZR+SL+SS)
图1 不同复合菌种液态发酵后的生长曲线图(n=3)
Fig.1 Growth curves of different composite strains after liquid fermentation (n=3)
2.2 不同复合菌种发酵前后脱脂蚕豆粉发酵液理化性质的变化
2.2.1 蛋白酶活力的变化
不同复合菌种液态发酵脱脂蚕豆粉的过程中，其自身产生的蛋白酶会对脱脂蚕豆粉进行不同程度的分解。如表2所示，在相同发酵条件下，4种复合菌对脱脂蚕豆粉进行液态发酵后，其发酵液酶活力大小为ZR+SL+SS>ZR+SL>ZR+SS>SL+SS。其中，三菌联合发酵后酶活力显著高于其他3个组，而SL+SS复合发酵后酶活力显著低于其他3个组(P<0.05)。
表2 不同复合菌种发酵后发酵液蛋白酶活力测定(n=3)
Table 2 Protease activity by fermentation of different compound microorganisms (n=3)
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)(下同)
测定指标ZR+SLZR+SSSL+SSZR+SL+SS吸光度0.46±0.01b0.44±0.01b0.26±0.01c0.57±0.01a酶活力/(U·g-1)55.36±1.48b53.34±1.37b31.32±1.41c68.51±1.30a
2.2.2 多肽含量的变化
由图2可知，不同复合菌种对脱脂蚕豆粉进行液态发酵后发酵液多肽含量均有所提升(P<0.05)，其中ZR+SL+SS的复合菌及SL+SS的复合菌对脱脂蚕豆粉进行液态发酵后多肽含量显著高于其他3个组，分别是30.19%、30.94%(P<0.05)，比未经处理组提高了2倍多。表明微生物发酵能使蛋白质降解分离产生多肽，与刘慧菊等[9]和吴胜华[22]的研究结论一致。菌种复合对于提高发酵液多肽含量效果显著，可能是由于菌种之间的协同作用叠加，发酵过程产生的蛋白酶活力更高，更利于分解脱脂蚕豆蛋白，产生小分子活性多肽，同时由于试验发酵条件有利于部分蚕豆蛋白转换为菌体蛋白，也改善了蚕豆蛋白本身的营养品质[13]。
图2 不同复合菌种发酵前后多肽含量的变化(n=3)
Fig.2 The change of peptide content before and after fermentation by differert microoganisms (n=3)
注： 不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.3 不同复合菌种发酵前后脱脂蚕豆粉理化性质及功能特性的变化
2.3.1 可溶性蛋白含量变化
如图3所示，在相同发酵条件下，不同复合菌种发酵脱脂蚕豆粉后脱脂蚕豆粉中可溶性蛋白含量均存在显著性差异(P<0.05)，其中ZR+SS的复合菌对脱脂蚕豆粉进行发酵后可溶性蛋白含最高，达到了98.86%，与未发酵的脱脂蚕豆粉相比增加了4.3倍。ZR+SL+SS的复合菌液态发酵脱脂蚕豆粉后，可溶性蛋白含量达到78.74%，相比于未发酵脱脂蚕豆粉的可溶性蛋白含量提高3.23倍(P<0.05)。由此可见，微生物发酵对脱脂蚕豆粉的可溶性蛋白含量的影响颇大。
图3 不同复合菌种脱脂蚕豆粉中可溶性蛋白含量(n=3)
Fig.3 Soluble protein content in defatted broad bean powder of different composite strains (n=3)
2.3.2 蛋白物理化学性能变化
由表3可知，经不同复合菌种发酵后脱脂蚕豆蛋白吸水量及吸油量均显著提高(P<0.05)，其中三菌联合发酵脱脂蚕豆粉后，蛋白的吸水量显著高于ZR+SL复合发酵组及未经发酵组(P<0.05)；蛋白吸油量ZR+SL复合发酵组最高、其次是ZR+SS复合发酵组(P<0.05)。吸水量与吸油量增加可能是蛋白从紧密的球状结构转变成了疏松随机的线团结构，暴露了较多基团，从而使其结合水及油的能力增加[23]，这表明微生物发酵对蛋白分子产生了影响。
表3 不同复合菌复合后蛋白质的理化性质
Table 3 Physicochemical properties of protein after different complex bacteria combination
测定指标未发酵脱脂蚕豆蛋白ZR+SLZR+SSSS+SLZR+SS+SL吸水性/mL0.43±0.08c0.53±0.12bc0.67±0.12ab0.63±0.06ab0.73±0.06a吸油性/mL0.30±0.05d0.90±0.10a0.73±0.06b0.63±0.06bc0.50±0.10c持水性/%3.34±0.20ab2.83±0.47b3.26±0.04ab3.49±0.31a3.17±0.16ab持油性/%4.25±0.04a4.09±0.57ab3.60±0.30bc3.41±0.31c3.59±0.12bc起泡性/%0.04±0.00c0.21±0.02b0.32±0.04a0.25±0.02b0.25±0.05b泡沫稳定性/%0.02±0.00c0.11±0.02ab0.13±0.02a0.09±0.02b0.09±0.01b
不同复合菌种发酵脱脂蚕豆粉后蛋白的持水性与未发酵脱脂蚕豆粉蛋白相比无显著差异(P>0.05)，但SS+SL复合发酵后蛋白持水性显著高与ZR+SL复合发酵组(P<0.05)。蛋白质与水作用后会发生不同程度的溶解，溶解程度越大，蛋白质颗粒复水后黏度越小，越不易形成蛋白质凝胶网络，从而导致蛋白质持水性下降；与未发酵脱脂蚕豆蛋白质的持油性相比，经ZR+SS的复合菌、SS+SL的复合菌及3种菌的复合菌发酵后蛋白质的持油性均显著降低(P<0.05)，原因可能是在发酵过程中，随环境温度升高时，油的流动性增强，蛋白变性，削弱了蛋白与油的相互作用[24]。
与未发酵脱脂蚕豆蛋白的起泡性与泡沫稳定性相比，经不同复合菌发酵脱脂蚕豆粉后蛋白的起泡性与泡沫稳定性均显著增加(P<0.05)，其中ZR+SS发酵脱脂蚕豆粉其蛋白质起泡性最优，达32.00%，泡沫稳定性达13.33%，显著高于另外3种复合菌发酵组(P<0.05)。表明ZR+SS的复合菌发酵有助于提高蛋白起泡性与泡沫稳定性。
2.3.3 蛋白粉凝胶特性的结果分析
如表4所示，SS+SL的复合菌发酵脱脂蚕豆粉后，蛋白弹力显著高于未发酵组和三菌联合发酵组(P<0.05)。蛋白弹性与未发酵时相比均显著降低，硬度与未发酵时相比均显著上升(P<0.05)，其中ZR+SL的复合菌发酵的蚕豆蛋白硬度显著高于其他4个组(P<0.05)。不同复合菌种发酵后蛋白结构发生变化，凝胶硬度增大，凝胶弹性降低，说明复合菌发酵使蛋白凝胶网络结构更加牢固，分子间作用力增强[25]。
表4 不同复合菌复合后蛋白质的凝胶特性
Table 4 Gel properties of proteins after different complex bacteria combination
测定指标未发酵脱脂蚕豆蛋白ZR+SLZR+SSSS+SLZR+SS+SL弹力0.32±0.02b0.33±0.01ab0.34±0.04ab0.36±0.02a0.32±0.01b弹性/mm2.85±0.07a1.54±0.02b1.54±0.02b1.34±0.05c1.59±0.03b硬度/g24.33±0.58d1036.00±24.88a449.33±15.04b119.00±1.53c112.67±3.06c
2.3.4 蛋白黏度的结果分析
由图4可知，经过不同复合菌种发酵后，在剪切力一定的条件下，不同复合菌发酵脱脂蚕豆粉蛋白溶液的黏度均不相同。除SL+SS的复合菌发酵后脱脂蚕豆粉蛋白溶液的黏度下降外，其他复合菌种发酵的脱脂蚕豆粉蛋白溶液蛋白的黏度均有所增加，在7 min时各蛋白溶液的黏度达到最大值。不同复合菌发酵后蚕豆蛋白结构发生变化，导致蚕豆蛋白黏度变化。微生物发酵会引起pH变化，从而导致蛋白质分子电荷变化，导致蛋白质-水、蛋白质-蛋白质、蛋白质-离子相之间互作用发生变化，宏观上表现为蛋白质胶体溶液的黏度改变[26]。
图4 不同复合菌发酵后蛋白质黏度变化
Fig.4 Changes of protein viscosity after fermentation by different complex bacteria
3 结论
以ZR+SS、ZR+SL、SS+SL以及ZR+SL+SS的复合菌对脱脂蚕豆粉进行液态发酵后，其生物活性提高、营养价值明显改善、理化性质和功能特性均发生了改变。其中三菌复合发酵可以提高发酵液蛋白酶活力、多肽含量，改变蛋白质分子结构；ZR+SS复合发酵后可以提高脱脂蚕豆粉的可溶性蛋白含量，且蛋白起泡性和泡沫稳定性增强；ZR+SL复合发酵后脱脂蚕豆粉蛋白硬度明显增强；SS+SL复合发酵后发酵液中多肽含量大幅度增加，蛋白黏度下降。综合分析，在选择复合菌种时，可以优先选择ZR+SS复配的发酵剂及3种菌的复合发酵剂。复合菌种液态发酵作为一种提高脱脂蚕豆粉营养价值与功能特性的有效手段，具有较好的发展前景。
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