猕猴桃，亦称阳桃、奇异果、毛桃等，是猕猴桃科猕猴桃属藤本植物[1]。猕猴桃果酒作为猕猴桃精深加工产品之一，保留了猕猴桃丰富的维生素、氨基酸、矿物质等营养元素，兼具抗氧化、增强免疫力、助消化等功能，这就促使越来越多的研究者将目光转向猕猴桃果酒产品的研发。唐荣等[2]研究了不同品种猕猴桃酿造的果酒品质，结果发现以红阳猕猴桃生产的果酒香气成分更多，且混合菌种发酵制得的猕猴桃酒品质更好。尽管关于猕猴桃酒的研究已经取得一定的进展，但实际生产中部分猕猴桃酒极易出现口味平淡、酸涩、香气不足、酒体不够协调等缺点，出现上述情况的原因有可能是原料品种的差异、发酵工艺的不完善和菌种的性能差异。有研究者期望通过在发酵基质中加入其他原料用以改善发酵基质组分，艾方[3]和叶林林等[4]将糯米与红提葡萄、柑桔等水果混合发酵，生产出来的复合果酒品质及口感较好。HAN等[5]加入糯米发酵青梅酒，结果显示糯米青梅酒的酒精度较高，酯和氨基酸等成分含量高。因此在猕猴桃酒的生产过程中，于发酵前加入糯米等谷物以改善猕猴桃酒的风味和口感，为猕猴桃酒的发展提供一个新的方向。
黑糯米，亦称药米、紫米，是一种既能食用又能入药的糯性大米，富含人体必需氨基酸、多种维生素(维生素B1、维生素B2等)、微量矿物质元素(钙、硒、磷等)、蛋白质、脂肪等。有研究者通过检测对比发现，黑糯米比白糯米的营养价值更高，对人体有滋补作用，有利于人体新陈代谢、促进微代谢[6-7]，具有抗氧化、抗肥胖、预防冠心病和动脉粥样硬化等功效，并且黑糯米含有的丰富花色苷还具有更好的呈色效果(主要存在于黑糯米表皮)。
本研究以猕猴桃为原料，将黑糯米糖化液这一富含碳源和氮源的优良发酵基质作为发酵猕猴桃酒的补充基质，在一定程度上弥补猕猴桃酒的不足，探究猕猴桃黑糯米复合发酵酒的香气成分和复合发酵对猕猴桃酒品质的影响，为改善猕猴桃酒品质和丰富果酒类产品提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑糯米：产于黑龙江五常市，购于武汉市中百超市；新鲜猕猴桃：产自陕西眉县，品种为徐香猕猴桃；酿酒酵母RV002，湖北安琪酵母有限公司；酒曲，湖北安琪酵母有限公司。
果胶酶、L-苹果酸(分析纯)、奎尼酸(分析纯)、柠檬酸(99.9 995%)、DL-酒石酸(≥99.999 5%)、没食子酸(分析纯)、芦丁(色谱级)、3，5-二硝基水杨酸(3, 5-dinitrosalicylic acid，DNS)(化学纯)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇(≥99.9%)、亚硫酸氢钠、草酸、氢氧化钾、碳酸钠、重铬酸钾、亚硫酸钠、碘化钾、2，6-二氯靛酚、邻苯二甲酸氢钾、酚酞、酒石酸钾钠，L(+)-抗坏血酸标准品(均为分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；香气物质标准品，美国Sigma公司；白砂糖市售；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SPX-250B型生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；UV-1700型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；Agilent 6890 N/5975B型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；e2695型高效液相色谱仪，美国WATERS公司；50/30 μm DVB/ CAR /PDMS型固相微萃取头，美国Supeleo公司。
1.3 实验方法
1.3.1 黑糯米糖化工艺流程[8]
黑糯米糖化工艺流程如下：
黑糯米挑选及清洗→浸米→蒸煮(至无硬芯)糊化→冷却至30 ℃→拌入甜酒曲→糖化→灭酶→糖化液
操作要点：
(1)黑糯米预处理：剔除黑糯米中虫蚀、霉变的米粒，取500 g清洗干净，加入清水浸泡约20 h，确定米与水的用量为1∶1，温度控制在23 ℃。
(2)蒸煮：将浸泡后的糯米清洗3次后放入蒸锅中，加入500 mL水蒸煮1 h，有浓郁的米香味，蒸好的糯米粒疏松不糊，内无白心，软硬适中，并将其敞口置于无菌操作台冷却至30 ℃左右。
(3)拌曲：称取适量蒸熟的黑糯米于250 mL的锥形瓶中，并加入0.4%甜酒曲，加入50 mL的温水搅拌均匀，搭窝，用瓶塞封口。
(4)糖化：将加曲并密封好的黑糯米置于30 ℃的恒温培养箱中培养1、2、3、4、5、6、7 d后结束糖化，在85 ℃条件下灭菌30 min即得黑糯米糖化液。对培养不同天数的糖化液中的还原糖和花色苷含量进行测定以确定最佳发酵天数。
1.3.2 猕猴桃黑糯米复合发酵工艺流程
猕猴桃黑糯米复合发酵工艺流程如下[9]：
猕猴桃破碎打浆后，先加入NaHSO3(120 mg/L)，随即加入果胶酶(70 mg/L)，室温静置10 h后，过滤得到猕猴桃汁。将1.3.1中制得的糖化液分为两部分，一份取其滤液灭菌(去黑糯米皮渣糖化液)；另一份糖化结束后不做处理直接灭菌(带黑糯米皮渣糖化液)，备用。以加白砂糖发酵为对照，取适量的猕猴桃汁分别与两份糖化液按1∶1的比例混合，此工艺中猕猴桃汁与糖化液混合后的初始糖度为18 °Brix，所以调整加白砂糖发酵对照组的初始糖度为18 °Brix。在80 ℃恒温水浴锅中灭菌30 min后，冷却，然后接种已活化的酿酒酵母，接种量为2%，在25 ℃的恒温培养箱中静置发酵6～8 d左右后结束主发酵，将倒罐后的酒样置于15 ℃的恒温培养箱中静置发酵10 d左右结束后发酵。以上所有发酵实验均为一式三份。
1.3.3 酵母活菌数与CO2释放量的测定
用平板计数法对发酵过程中酵母活菌数进行计数。从发酵当天起，每天用移液枪吸取1 mL发酵液到9 mL的无菌水中，并依次梯度稀释至10-8，10-8～10-5各涂3个平板，将涂布好的平板倒置放于28 ℃的培养箱中培养2 d后，取出平板计算菌落总数并记录。
每隔24 h对发酵罐进行称重1次，记录初始发酵罐总质量以及每次称重的质量，CO2释放量计算如公式(1)所示：
CO2释放量/g=当天发酵罐总质量-前1 d发酵罐总质量
(1)
1.3.4 基本理化指标的测定
还原糖含量采用DNS法[10]测定；花色苷含量采用pH示差法[11]测定；酒精度采用重铬酸钾氧化法[12]测定；总酸和残糖量参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中测定总酸、总糖的方法进行测定；可溶性固形物采用自动阿贝折射仪测定；pH采用pH计测定；维生素C采用2，6-二氯靛酚滴定法测定；总酚采用Folin-Ciocalte比色法[13]测定；澄清度采用分光光度计法测定，即发酵液在分光光度计波长680 nm下的透光率；总黄酮采用比色法[14]测定。
1.3.5 有机酸的测定
采用ZHONG等[15]的方法并略作修改。采用高效液相色谱仪进行测定。
1.3.6 挥发性成分的测定
采用钟武等[16]的方法并略作修改。以环己酮为内标，采用内标法进行定量。
1.3.7 复合酒感官评定方法
参考叶林林[17]的评定方法并稍作修改。经过专业培训的10名人员(5名女性和5名男性)组成的品评小组对复合酒进行感官评定。分别从色泽、透明度、果香、甜度、酸度、涩味、苦味、米味、冲味、后味对酒样进行评价，以10分结构数值量化为标准。感官分析过程中，每个酒样重复分析3次。
2 结果与分析
2.1 黑糯米糖化过程中还原糖、花色苷含量的变化
糖化液中还原糖含量是衡量糯米糖化性能的重要指标之一[18]。由图1可知，黑糯米糖化的1～3 d，随着糖化时间的延长，还原糖的含量逐渐增加，糖化第3天时还原糖的含量达到了峰值(223.70 g/L)；之后还原糖的含量在逐渐减少，这可能是由于甜酒曲中少量的酿酒酵母利用糖化液中的营养物质进行酒精发酵，使得还原糖的含量逐渐降低。糖化1～3 d，花色苷含量有小幅度的增加；3～5 d，花色苷含量缓慢的减少；糖化5 d后，花色苷降低速率较快，最后缓慢下降并趋于稳定。糖化液中花色苷含量先升高后降低的原因可能是，在糖化过程中黑糯米皮中的花色苷逐渐溶解使糖化液中花色苷的含量增加，之后微生物产生了可以水解花色苷的酶使得花色苷含量降低。
图1 糖化过程中还原糖、花色苷含量的变化
Fig.1 Content changes of reducing sugar and anthocyanin during saccharification
根据上述糖化过程中对糖化液的还原糖含量和花色苷含量变化的分析结果可知，糖化3 d后的糖化液还原糖含量和花色苷含量最高，质量较好，所以后续实验选择糖化3 d的黑糯米糖化液与猕猴桃进行复合发酵。
2.2 猕猴桃黑糯米复合酒的发酵动力学
3组猕猴桃黑糯米复合发酵酒的发酵动力学如图2所示。本实验通过CO2的释放量来监测整个发酵过程的进程以及酵母菌的发酵能力。由图2-a可知，加入黑糯米糖化液的两组复合发酵体系在0～2 d CO2的释放速率较快，从第3天开始CO2的释放量缓慢增加并基本处于稳定状态，两组复合发酵组CO2的累计释放量在整个发酵过程中均高于加糖发酵组，说明复合发酵的发酵速率更快。由图2-b可知，3个发酵组的还原糖含量均随发酵时间增长呈下降趋势。两组复合发酵组的还原糖含量在发酵0～2 d内消耗的较快，随后几天发酵过程中，复合发酵组还原糖消耗速率较慢，并逐渐趋于稳定。在整个发酵过程中，两组复合发酵组还原糖含量消耗速率都比加糖发酵组快，带糯米皮渣复合发酵组的还原糖的消耗速率始终高于去糯米皮渣复合发酵组。
pH不仅反映复合发酵过程中游离酸的变化，还是影响成品酒口感和颜色的重要因素。由图2-c可知，在整个发酵过程中，加糖发酵组与两个复合发酵组中酵母菌活菌数的变化趋势基本一致。从整体上看，两组酵母菌活菌的数量比较结果为：复合发酵组>加糖发酵组，这是因为黑糯米糖化液的营养物质富含碳源和氮源，更适合酵母菌的生长繁殖。而发酵后期加糖发酵组中的酵母活菌数明显减少可能是由于体系中的营养物质消耗殆尽，酵母菌之间存在激烈的营养竞争，导致酿酒酵母的生长受到抑制[19]。如图2-d所示，在整个发酵过程中，3组复合酒的pH整体都呈下降趋势。在发酵的前4 d里，pH值下降较为明显；在4～7 d，pH的下降趋势近于平缓。pH的变化主要取决于有机酸种类及含量的变化，有机酸主要来源于两种途径：猕猴桃自身含有较多的苹果酸、柠檬酸和草酸等有机酸；发酵过程中酵母代谢产生丙酮酸、乳酸、乙酸和琥珀酸等有机酸。随着发酵的进行，由于糖类物质减少、pH降低等因素，酵母菌的产酸代谢被抑制，最终使得复合酒的pH趋于稳定[20]。
a-发酵过程中CO2累积释放量；b-发酵过程中还原糖含量变化；c-发酵过程中酵母活细胞数变化；d-发酵过程中pH变化
图2 猕猴桃黑糯米复合酒的发酵动力学
Fig.2 Fermentation dynamics of kiwifruit wine supplied with saccharified black glutinous rice
2.3 复合发酵酒的基本理化指标
3组发酵酒的基本理化指标如表1所示。加糖发酵组与去糯米皮渣复合发酵组的残糖量无显著性差异，但与带糯米皮渣复合发酵组存在显著性差异(P<0.05)。复合发酵组的酒精度要高于加糖发酵组的酒精度，说明酵母菌能更好地利用猕猴桃黑糯米糖化液复合发酵体系中的糖类物质产生酒精。在维生素C含量上，加糖复合发酵组>去糯米皮渣复合发酵组>带糯米皮渣复合发酵组，且差异性显著(P<0.05)。3组酒样中总酚含量的差异也较显著(P<0.05)，3组复合发酵酒中总酚含量比较结果为加糖复合发酵组>带糯米皮渣复合发酵组>去糯米皮渣复合发酵组。带糯米皮渣复合发酵组与加糖复合发酵组中总黄酮含量的差异不显著，但与去糯米皮渣复合发酵组中总黄酮含量存在显著性差异(P<0.05)。由此可说明，与加糖发酵组相比，加黑糯米糖化液的复合发酵可适当提高果酒的酒精度、降低总酸含量。
表1 不同复合发酵酒理化指标
Table 1 Physical and chemical indexes of different combined wines
注：A为加糖发酵组,B为带糯米皮渣复合发酵组,C为去糯米皮渣复合发酵组;同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
理化指标ABC残糖量/(g·L-1)6.71±0.22a6.28±0.19a3.57±0.05b酒精度/%13.18±0.22c13.65+0.21b14.96±0.19a总酸/(g·L-1)22.01±1.04a12.20±0.18b12.78±0.15bpH3.21±0.03b3.20±0.01a3.23±0.01a可溶性固形物含量/%7.20±0.00c7.67±0.12b8.20±0.00a澄清度/(%T)96.53±0.46a95.37±0.25b94.20±0.10c维生素C/(mg·L-1)213.67±4.04a93.67±3.21b82.67±3.05c总酚/(μg·mL-1)159.46±5.68a104.29±4.05b145.55±5.05c总黄酮/(μg·mL-1)28.75±1.34b35.57±0.05a28.26±0.10b
2.4 复合发酵酒中有机酸的测定
果酒中适量的有机酸可以对酒体起到调节作用，有机酸的含量过高或过低都会降低果酒品质。3组发酵酒中的奎尼酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸的含量如图3所示，3组发酵酒中4种有机酸的含量均存在显著性差异(P<0.05)。3组发酵酒中有机酸的总含量比较：加糖发酵组>带糯米皮渣复合发酵组>去糯米皮渣复合发酵组。加糖发酵酒中有机酸总含量最高(22.42 g/L)，且奎尼酸、苹果酸和柠檬酸的含量相较于其他两组复合发酵酒都是最高的；去糯米皮渣复合发酵酒样中有机酸总含量最低(12.87 g/L)，苹果酸、奎尼酸、柠檬酸的含量也是最低，且酒石酸的含量低于带糯米皮渣复合发酵酒；带糯米皮渣复合发酵酒中有机酸总含量为15.62 g/L。本实验的结果表明，与加糖发酵组相比，加入黑糯米糖化液的复合发酵可以显著降低成品酒中有机酸的含量，且去糯米皮渣复合发酵酒中有机酸含量最低。
图3 不同复合发酵酒中有机酸含量
Fig.3 Organic acid contents of different combined wines
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
2.5 复合发酵酒挥发性成分的测定
如图4所示，3组发酵酒共检测出49种挥发性成分，加糖发酵组共检测出31种挥发性成分，各组分总含量为849.5 mg/L；去糯米皮渣复合发酵组共检测出45种挥发性香气成分，各组分总含量为1 421.5 mg/L；带糯米皮渣复合发酵组共检测出29种挥发性香气成分，各组分总含量为1 680.95 mg/L。
图4 不同复合发酵酒的挥发性成分热图
Fig.4 Heat map of volatile aroma components of different combined wines
高级醇是果酒中重要的香气化合物，一定浓度的醇类化合物可以增加酒体香气的复杂度。本实验中的3组发酵酒共检测出醇类物质9种，分别是己醇、苯乙醇、芳樟醇、正戊醇、橙花叔醇、异长叶醇、4-羟基苯乙醇、香茅醇、3-甲基硫丙醇，其中共有的是己醇、苯乙醇、芳樟醇、3-甲基硫丙醇。去糯米皮渣复合发酵组的醇类物质最多(9种)，其次是带糯米皮渣复合发酵组(5种)，说明在发酵过程中黑糯米糖化液的添加促进了醇类香气化合物的生成。
酯类物质通常可以赋予果酒一定的花香、果香，是果酒中重要的香气来源之一。3组发酵酒共检测出酯类物质26种，其中加糖发酵组21种，去糯米皮渣复合发酵组23种，带糯米皮渣复合发酵组18种。在去糯米皮渣复合发酵组，酯类含量较高的化合物有乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯等；带糯米皮渣复合发酵组酯类化合物含量较高的是乙酸异戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯等。本实验中3种发酵酒样的主要呈香物质是酯类化合物，加黑糯米糖化液的两组复合发酵酒特有的酯类化合物有丁二酸二乙酯、壬酸乙酯、苯丙酸乙酯、十一酸乙酯、γ-十二内酯，这些酯类物质导致了各发酵组香气的差异。
有研究发现，质量浓度小于20 mg/L的C6～C10的脂肪酸有利于酒体产生愉悦的香气，本研究中，加糖发酵组检测出1种脂肪酸——辛酸，去糯米皮渣复合发酵组检测出3种脂肪酸，分别为辛酸、壬酸、癸酸，带糯米皮渣复合发酵组检测出1种脂肪酸——癸酸。本实验中，去糯米皮渣复合发酵组的酸种类最多、酸的总含量适中，对复合酒的酒体和口感产生良好的调节作用。
在猕猴桃黑糯米复合发酵酒样还检测到2-甲基四氢噻吩、愈创木酚、2,3-二氢苯并呋喃、5-乙烯基-2-甲氧基苯酚，对丰富复合酒风味的复杂性有一定的贡献。
2.6 复合发酵酒主要挥发性香气成分活度值(aroma of activity value，OAV)分析
OAV常被用于各种食品中香气物质的鉴定与筛选，是以香气化合物浓度与其嗅觉阈值的比值所得，当香气浓度大于感觉阈值(OAV>1)时可以被人的嗅觉感知到，小于感觉阈值(OAV<1)时便不能被人的嗅觉感知到[21]。3种发酵酒的OAV分析结果如表2所示，两组复合发酵组能被人感知到呈香物质种类要多于加糖发酵组，并且去糯米皮渣复合发酵组中大部分的香气组分OAV都是最高。与加糖发酵组相比，去糯米皮渣复合发酵组中丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、丁酸乙酯等的香气活度值更高，这些酯类化合物具有典型的水果香气，同时去糯米皮渣复合发酵组特有的有橙花叔醇、香茅醇、辛酸甲酯、壬酸乙酯、愈创木酚等，赋予了酒体花香、奶油香等。
表2 不同复合发酵酒中主要香气OAV分析
Table 2 Volatile component analysis of different combined wines
香气物质阈值/(ug·L-1)[2-4,18]香气特征OAV加糖发酵组去糯米皮渣复合发酵组带糯米皮渣复合发酵组己醇200草本香、木香62.7533.839.25苯乙醇14 000玫瑰香、蜂蜜香21.0934.1856.91芳樟醇25花香、果香44.1241.05-橙花叔醇10清香、柑橘香-55-香茅醇100玫瑰香-12.42.73-甲基硫丙醇500烤土豆香9.727.428.98丁酸乙酯20香蕉、菠萝、草莓香19728.5105.5乙酸异戊酯30香蕉、梨香4251 139.332 379.33己酸乙酯14香蕉、青苹果1 520.72 112.141 368.57乙酸己酯5苹果、梨等水果味62857.23176辛酸甲酯200橘子香气9.65--苯甲酸乙酯53玫瑰香52.0845.2837.74辛酸乙酯250水果香、花香488.88367.76243.4乙酸苯乙酯1 800玫瑰、草莓香34.7982.51104.98癸酸乙酯1 122水果、脂肪香气128.98146.5648.07月桂酸乙酯1 500花香、水果味17.9517.7110.69十六酸乙酯410微弱蜡香、奶油香24.12111.557.2壬酸乙酯3 150.61酯香、水果香、蜜香-6.916.57γ-十二内酯60.68奶油香、水果香-16.15-苯甲酸甲酯30蜜香、花香1 344674367.67肉豆蔻酸乙酯1 130鸢尾油香2.312.947.13辛酸500奶酪味、酸腐味5.78.16-大马士酮2茶香、果香2 5601 320845愈创木酚13.41水果香、花香、甜香、-36.5448.47D-柠檬烯880柚子香气-1.9-1,3,8-对薄荷三烯80薄荷特征香气3223.57.5
综上所述，加黑糯米糖化液的两组复合发酵酒比加糖发酵酒的香气成分要更加复杂，同时去糯米皮渣复合发酵组的呈香物质种类和香气活性总值都是最高。
2.7 复合发酵酒的感官评价
3种发酵酒的感官评价雷达图如图5所示，可以看出猕猴桃黑糯米复合发酵酒的香气层次更加复杂，既有果香，也有黑糯米特有的米香味；去糯米皮渣复合发酵组的酸度、涩度、甜度、米味更优。对加糖发酵组来说，其色泽和透明度是最好的，但是涩度和酸度相对较差。从总体上来看，去糯米皮渣复合发酵酒的酸度和涩度最适中，甜度最佳，米香和果香丰富，整体评价较好。
图5 不同复合发酵酒的感官评价雷达图
Fig.5 Sensory evaluation radar charts of different combined wines
3 结论
本研究以加白砂糖发酵为对照，将去糯米皮渣糖化液和带糯米皮渣糖化液分别与猕猴桃清汁进行复合发酵实验。结果显示，黑糯米糖化液为酵母发酵提供了充足的氮源和碳源，更有利于酵母菌的生长和酒精发酵。发酵结束后对3组发酵酒的各指标进行了检测，结果发现去糯米皮渣复合发酵酒的有机酸总含量最低(12.87 g/L)、加糖发酵酒的有机酸总含量最高(22.42 g/L)；3组发酵酒中共检测出49种挥发性香气成分，其中醇类9种、酯类26种、酸类3种、酮类3种；复合发酵提高了成品酒中香气物质的含量，复合发酵酒特有的呈香物质有橙花叔醇、香茅醇、壬酸乙酯、γ-十二内酯、D-柠檬烯，赋予了复合酒特有的水果香、花香、奶油香等，丰富了酒的香气复杂性和层次感，其中去糯米皮渣复合发酵酒中香气化合物总含量最高(1 421.5 mg/L)，种类最多(45种)；同时结合香气活性值和感官评价的结果发现，复合发酵明显提升了酒的香气浓郁度，增加酒的典型性，且去糯米皮渣复合发酵酒的整体品质最优。
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