黄花菜又名萱草，是一种药食同源的珍有物种，具有安神醒脑、增智宽胸、美容养血、解热消毒、除烦通乳之功效[1]。由于黄花菜采后含水量高，呼吸作用旺盛，耐贮藏性差，且极易腐烂变质，严重影响鲜黄花菜品质。因此可以通过干燥方式保存黄花菜，并采用深加工技术提高其附加值。但干燥后风味物质的变化会对产品品质产生影响。赵金梅等[2]研究表明真空冷冻干燥和自然干燥有利于保存鲜沙枣花的挥发性风味成分。马琦等[3]发现热风干燥的杏鲍菇挥发性成分品质优于中短波红外干燥。GC-MS是最常用的分离和鉴定复杂样品成分的方法，具有分离能力强、灵敏度高、操作方便等特点，因而在果蔬风味的评价中得到了广泛的应用[4]。成传香等[5]通过GC-MS结合偏最小二乘判别分析不同种类柑橘汁中香气物质。龙杰等[6]利用GC-MS结合香气活性值分析渗透脱水联合干燥方式对桃脆片挥发性风味物质的影响。李嘉欣等[7]采用GC-MS结合主成分分析不同干燥工艺对苹果脆片风味物质的影响。
以GC-MS技术对不同干燥方式的黄花菜挥发性物质鉴定，并结合不同化学计量法对其分析的相关研究较少。为此，本文采用3种干燥方式(自然干燥、热风干燥和真空脉动干燥)对黄花菜进行干燥处理，结合GC-MS技术对3种干燥方式处理的黄花菜样品挥发性物质进行分析，并采用偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)、香气活性值(odor activity value，OAV)、主成分分析(principal component analysis，PCA)等多元统计分析方法，筛选出不同干燥方式的黄花菜特征风味物质，为黄花菜干燥加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选择宁夏吴忠盐池县周边品种“马莲花”，成熟度一致，长度10～12 cm，直径0.7～10 mm，无病虫害、无机械损伤、未开花且大小(单体重9～12 g)基本一致的花蕾进行实验。1,2-二氯苯，美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
岛津Qp2010ultra气质联用仪，日本Shimadzu公司；PK157330-U固相微萃取手柄，美国Supelco公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supelco公司；DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm )毛细管柱，美国Agilent公司；LT202E电子天平，常熟市天量仪器有限责任公司；XW-80A旋涡混合仪，上海嘉鹏科技有限公司；WNB22精密数显热风水浴槽，上海树立仪器仪表有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品干制方法
正常采摘后挑选出符合实验要求的黄花菜，经过预处理后采用自然干燥、热风干燥和真空脉动干燥对黄花菜进行干燥处理，并将干制后的黄花菜装入铝箔袋置于(4±1) ℃冰箱贮存。干燥前测的鲜黄花菜初始水分含量为86%，要求热风干燥和真空脉动干燥后的水分含量控制在(15±2)%。3种干燥方法如表1所示。干燥结束后使用研钵捣碎制成粉末状，并通过40目筛子过滤。
表1 黄花菜3种干燥方法
Table 1 Three drying methods for daylily
干燥方式预处理方式黄花菜预处理方式杀青方式杀青条件杀青时间/min设备类型干燥条件干燥时间/min自然干燥[8]铺料均匀,选择阳光充足的水泥路面热风干燥[9]4 ℃冷库贮存蒸汽杀青处理温度70 ℃10电热热风干燥箱(绍兴力诚仪器科技有限公司)铺料均匀,干燥温度70 ℃480真空脉动干燥[10]负压膨化设备(山东登月红景天有限公司)铺料均匀,干燥温度90 ℃,脉动比10∶2600
1.3.2 样品预处理
顶空固相微萃取：参照SONG等[11]萃取方法并略作修改，准确称取2.00 g样品放置于20 mL顶空瓶，再加入内标1,2-二氯苯(4 μL、6.42 μg/mL)，封口膜封口，旋涡混合仪振荡30 s，放置于50 ℃精密数显热风水浴槽中静置20 min，最后利用50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME萃取头富集20 min。富集结束后立即将其转移到GC进样口250 ℃下解吸5 min。
1.3.3 GC-MS定性及定量分析
GC条件：色谱毛细管柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度为230 ℃；氦气流速为2 mL/min；进样方式为不分流进样；色谱柱升温条件：初始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速度升至200 ℃，在以10 ℃/min速率升至230 ℃，保持3 min。
MS条件：采用电子电离模式，电子电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，传输温度280 ℃，质量扫描范围：(m/z)50～350。延迟2.5 min。
挥发性物质的定性定量分析：将分离出的化合物利用计算机检索与NIST 14和WILEY标准普库进行初步判定，选择匹配度>80%的结果，再结合保留时间和参考文献对挥发性香气物质再次鉴定。利用已知浓度1,2-二氯苯的峰面积计算样品中各挥发性物质含量，计算如公式(1)所示：
(1)
式中：I0代表挥发性物质含量，μg/kg；内标化合物的质量浓度，单位为μg/mL；Ai和A0分别为目标化合物的峰面积和内标化合物的峰面积；2为添加样品质量，单位为g；4为添加标品体积，单位为μL；分子和分母1 000各代表1 000 g和1 000 μL。
1.3.4 OAV法鉴定黄花菜中特征香气成分
参考各挥发性物质在水中的阈值[12]，计算筛选出的各香气化合物OAV值，计算如公式(2)所示：
(2)
式中：OAVi为物质i的香气活度值；Ci为黄花菜中物质i的质量浓度,μg/kg；Ti为黄花菜中物质i相对应的水中阈值。相关研究表明OAV≥1的化合物通常被认为是食物基质整体香气的有效贡献者；OAV≥10的化合物被认为是影响食物香气的重要物质[13]。
1.4 数据处理
样品中挥发性物质数据采用GC-MS在解析软件结合Excel进行平均值和标准偏差分析。采用SIMAC14.1软件对样品进行PLS-DA分析，SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，P<0.05，利用Origin 2021b软件作图。
2 结果与分析
2.1 干燥方式对黄花菜挥发性化合物组分及相对含量的影响
由附表1(https://gb.global.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST &filename=SPFX2022061300Z)可知，利用GC-MS对3种干燥方式下黄花菜样品的挥发性香气物质进行鉴定，通过谱库检索、保留时间及参考文献对比，在黄花菜样品中共鉴定出66种挥发性化合物，其中自然干燥、热风干燥和真空脉动干燥分别检测出49、40和44种挥发性香气物质，含量依次为1 423.41、1 004.6、1 016.55 μg/kg，且自然干燥中3-呋喃甲醛相对含量最高为200.97 μg/kg，热风干燥和真空脉动干燥中三十二烷相对含量最高，分别为311.53、513.21 μg/kg。由此可知不同干燥方式下黄花菜挥发性化合物的种类和相对含量存在显著性差异。
由图1可知，3种干燥方式下黄花菜样品的挥发性化合物中，醛类物质种类显著高于其他物质，其中自然干燥和真空脉动干燥种类最多(12种)，热风干燥略低(11种)；真空脉动干燥样品烷烃类化合物含量占比最高(58%)，而自然干燥与热风干燥分别占比19%和54%；烯类和酸类种类均为4种，烯类占比远低于酸类，且热风干燥样品烯类含量最低；酮类和酯类含量占比相同，且自然干燥方式样品中酮类种类最多，含量占比最高；醇类在自然干燥样品中种类(9种)和含量(19%)占比最高。上述情况表明，不同干燥方式对黄花菜挥发性物质种类和含量均存在影响。
A-挥发性化合物种类数量；B-挥发性化合物相对含量
图1 不同干燥方法黄花菜挥发性化合物种类数量及相对含量
Fig.1 Number and relative content of volatile compounds in daylily by different drying methods
醇类化合物的前体物质大多是生长成长链脂肪类的多不饱和脂肪酸[14]，且大多数醇类阈值相对较高，对黄花菜的香气成分贡献相对较低，但对其具有一定修饰作用。3种干燥方法均检出1-辛烯-3-醇、芳樟醇、(Z)-2-辛烯-1-醇、2-乙基-1-己醇，其中1-辛烯-3-醇、芳樟醇阈值相对较低，为黄花菜提供花香、青香。烷烃主要包括饱和烃和不饱和烃，其中饱和烃阈值相对较高，不饱和烃阈值相对较低，对黄花菜的香气贡献度不大，而烷烃类化合物主要来自于脂肪酸烷氧基的裂解[15]，3种干燥方式共检测出12种烷烃，其中热风干燥和真空脉动干燥高达9种，自然干燥达到7种；3种干燥方法检测出主要的烯类为E-β-罗勒烯，可为黄花菜提供花香和草香香气。
醛类物质主要来自于脂质分子氧化和自由基裂解[16]，产生的大多数醛类物质具有油脂、青草和坚果气味，为黄花菜的风味起着积极的贡献作用，而热分解是导致3种干燥方法下醛类物质存在差异的主要原因。在3种干燥方式下共检出15种醛类且均存在己醛、辛醛、苯甲醛、苯乙醛、5-羟甲基糠醛、(E)-2-辛烯醛、任醛、糠醛和青叶醛，其中己醛具有青草、油脂风味；辛醛具有强烈的水果气味；苯甲醛具有苦杏仁、坚果气味；苯乙醛具有玫瑰、柑橘香气；5-羟甲基糠醛具有饼干、面包气味；(E)-2-辛烯醛具有青香、脂肪；任醛具有油脂、柑橘、青草气味；糠醛具有油脂味、木香味；青叶醛具有苹果、青草气味等与前人研究结果相同[17]。自然干燥中(E)-2-甲基-2-丁烯醛未检出，而在热风干燥和真空脉动干燥均有检出，可以赋予黄花菜强烈的清香和刺激性气味，另外(Z,E)-2,6-壬二烯醛只在真空脉动干燥中检出，具有蔬菜气味；(E,E)-2，4-壬二烯醛只在自然干燥中检出，呈现油脂味、青草气味。
SUN等[18]研究发现酯类物质会赋予食品甜香气味和轻微油脂气味。其中，邻苯二甲酸二异丁酯常用作塑料增塑剂，在自然干燥和真空脉动干燥方法下均能检出，可能是由于实验过程中受到污染；棕榈酸甲酯具有强烈的水果气味，除自然干燥以外其他2种干燥方式下均未检出，可能是因为在干燥过程中一些复杂的化学反应如糖酵解，蛋白质水解以及脂质氧化等而导致酯类降解[19]。热风干燥中含有较高的具有果香香气的2-呋喃甲醇丙酸酯，且在自然干燥和真空脉动干燥中未检出。分析其未检出原因可能是酸类和醇类反应过程中温度过低或者过高导致[20]。
酮类物质分为短链酮和长链酮，短链酮具有脂香，焦香香气；长链酮呈现花香气息[21]。在3种干燥方式下共检出9种酮类，其中自然干燥种类最多(8种)，真空脉动干燥种类最少(3种)。其中，1-辛烯-3-酮在3种干燥方法下均可检出，具有强烈的干草气味，且略带薰衣草和玫瑰花香气。6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮、3-辛烯-2-酮和香叶基丙酮等具有清新的泥土香、甜香及清淡的花香香气，仅在自然干燥和热风干燥中检出。3-辛酮仅在热风干燥和真空脉动干燥中产生，且具有强烈的水果气味。
酸类物质的产生可能是由于干制过程中不饱和脂肪酸热分解和热降解产物的二次反应产物[22]。3种干燥方式中自然干燥酸类物质种类和含量最高，其中己酸在3种干燥方式中均有检出，含量相对较高，具有刺激性气味，这可能是由于一些长链脂肪酸在干制中热分解产生[23]。
戊基呋喃在其他化合物中含量最高(5.07～65.36 μg/kg)，一般为碳水化合物或不饱和脂肪酸化产生[24]，具有清新的泥土和蔬菜气味，主要起到丰富黄花菜香气组成和调和风味物质的作用，并在3种干燥方式下均存在。
综上所述，黄花菜呈现的风味并不是某一种特定化合物提供，而是由醇类、醛类、酮类、烷烃类，烯类、酯类、酸类和其他等众多挥发性化合物作用人感觉器官产生。3种干燥方式下自然干燥和真空脉动干燥在很大程度上促进醇类、酸类和醛类物质的生成，而热风干燥有效的保留酮类化合物。为尽可能减少热风干燥和真空脉动干燥挥发性物质损失，后续可优化工艺参数进行建模研究，包括干燥温度、干燥速率等以最大限度的保留挥发性物质。
2.2 PLS-DA分析
2.2.1 GC-MS数据的PLS-DA
采用PLS-DA对GC-MS数据进行分析，相比PCA，PLS-DA具有监督分析作用。由图2-A可知，自然干燥位于第1、4象限，热风干燥位于第2象限，真空脉动干燥位于第3象限，可明显区分3种干燥方法。通过PLS-DA载荷图可进一步反应挥发性化合物对已构建模型的贡献率大小。当挥发性化合物与中心原点越远，表明其对该模型的贡献率越大[25]。
a-PLS-DA得分图；b-载荷图
图2 样品挥发性成分的PLS-DA得分图和载荷图
Fig.2 PLS-DA score and load of volatile components of samples
注：化合物编号同附表1
由图2-B可知，真空脉动干燥样品中三十二烷(45)和2-甲基丙酸(58)在载荷图中位置与得分图位置均为第3象限，表明这2种化合物为真空脉动干燥样品的主要风味物质。糠醛(21)、(E)-2-甲基-2-丁烯醛(25)、3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇(39)等挥发性物质为热风干燥样品的主要风味物质。3-呋喃甲醛(15)、十六烷(42)、醋酸(54)、己酸(57)等挥发性物质为自然干燥的主要风味物质。
2.2.2 样品中差异性风味物质的筛选
PLS-DA具有降维、监督分析、复杂数据直观化和可视化等特点，但在分析过程中易出现过拟合现象，因此，常利用置换检验验证PLS-DA模型[26]，如图3所示。
图3 PLS-DA模型置换检验
Fig.3 Replacement test of PLS-DA model
通过PLS-DA模型可知，
和
分别表示模型在x轴和y轴方向的解释率，
时，表示该模型预测能力较好。进一步采用200次响应的置换检验方法对模型进行验证，得到R2=0.57，Q2=-0.472，且Q2与y轴的截距小于零，表明该模型未过拟合，模型稳定性和预测能力较好，能够完成后续特征风味物质的筛选。
根据PLS-DA模型中变量重要性投影值(variable importance in project，VIP)将每个变量对样品分类贡献的大小进行量化，其中VIP>1的挥发性化合物被称为标志性风味物质。当VIP值越大，表明不同处理方式对其挥发性化合物的影响越大。
由图4可知，有14种风味物质VIP>1.0，可以作为判别3种干燥方法的重要风味物质。分别为3-呋喃甲醛、苯甲醛、糠醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-甲基-2-丁烯醛、3-辛烯-2-酮、3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、十六烷、二十烷、三十二烷、乙酸、己酸、2-甲基丙酸、2-戊基呋喃。利用SPSS软件将VIP>1的特征挥发性标志物进行单因素方差分析，筛选出黄花菜在不同干燥方式下存在9种差异性风味物质，分别为：苯甲醇、3-呋喃甲醛、(E)-2-甲基-2-丁烯醛、3-辛烯-2-酮、3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、十六烷、乙酸、己酸、2-戊基呋喃，其中苯甲醛、3-呋喃甲醛、(E)-2-甲基-2-丁烯醛、3-辛烯-2-酮、乙酸、己酸、2-戊基呋喃等可能与黄花菜中脂肪氧化、裂解有关，而十六烷和3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇存在原因有待研究。
图4 黄花菜干燥样品的挥发性化合物VIP排序图
Fig.4 VIP sequence of volatile compounds in dried daylily
2.3 OAV结合PCA分析
2.3.1 GC-MS数据的OAV分析
根据OAV值可以确定黄花菜在3种干燥方式下共存在12种关键风味物质(表2)，其中10种OAV>1，表明其对干燥后的香气有贡献；2种化合物的OAV值较高(≥10)，是影响干燥后黄花菜香气的重要物质，包括1-辛烯-3-醇和乙酸。同时1-辛烯-3-醇也是核桃、平菇、蘑菇、甜瓜重要香气物质[27]。正乙醇、芳樟醇、植物醇和(Z)-2-辛烯-1-醇等OAV≥1，具有水果和青香气味。其中，相关研究表明芳樟醇作为柑橘主体香气成分贡献着花香和甘橘香味[28]。C8～C9的醛类物质在高度稀释下，则具有良好的香气特征，例如壬醛和(E,E)-2,4-壬二烯醛具有油脂和青草气味、清香带甜。壬醛为饱和脂肪酸，曾被认为是六堡茶和普洱茶木香、花香的贡献成分[29]；(E,E)-2,4-壬二烯醛OAV值相对较高，仅在热风干燥中为样品特征香气，两者对黄花菜青香气味贡献较大。苯乙醛是由苯丙氨酸经脱氨脱羧后形成的相应醛类物质，使3种干燥方式后的样品均具有苦杏仁和坚果香气味。酮类物质中，1-辛烯-3-酮具有薰衣草、干草气味，阈值相对较低，同时也在蘑菇中表现出较大的香气贡献值。烯类物质中，β-月桂烯具有清凉气味，阈值较低，OAV值为1.83，仅真空脉动干燥中检出，同时β-月桂烯也作为橙汁的关键特征香气。2-戊基呋喃在自然干燥中OAV值为4.51，曾在草鱼[30]和红烧鸡[31]中作为特征香气被检出。
表2 不同干燥方法黄花菜得到的黄花菜征香气成分的OAV
Table 2 OAV of daylily aroma components obtained by different drying methods
注：化合物编号同附表1;-表示无数据
序号CAS号化合物名称化学式香气特征阈值/(μg·kg-1)OAV自然干燥热风干燥真空脉动干燥醇类1111-27-3正己醇C6H14O水果味5.602.27--23391-86-41-辛烯-3-醇C8H16O干草香、清香带甜1.5077.1919.0613.70 378-70-6芳樟醇C10H18O花香6.00-2.451.61 4150-86-7植物醇C20H40O花香、香脂香气0.502.02--618409-17-1(Z)-2-辛烯-1-醇C8H16O青香、蔬菜20.001.21--醛类17122-78-1苯乙醛C8H8O苦杏仁、坚果香6.301.621.381.28 20124-19-6壬醛C9H18O油脂、青草、花香7.002.492.302.34 245910-87-2(E,E)-2,4-壬二烯醛C9H14O油脂、青草0.1-7.90-酮类274312-99-61-辛烯-3-酮C8H14O薰衣草、干草4.00-1.471.94 酸类5464-19-7乙酸C2H4O2刺鼻的醋酸味2.0056.99--烯类62123-35-3β -月桂烯C10H16清凉味1.20--1.83其他类653777-69-32-戊基呋喃C9H14O泥土、蔬菜香14.54.51--
由图5-A可以直观看出自然干燥、热风干燥及真空脉动干燥分别有8、6、6种关键香气成分，其中3种共有组分结构示意图如图5-B所示，这3种物质中两种是直链型，且都含有C
O双键，这种双键可能对黄花菜的呈香品质有一定影响。
A-Venn图分析；B-共有组分结构式图
图5 三种干燥方式下黄花菜OAV>1的风味物质Venn图分析及共有组分结构式图
Fig.5 Venn diagram analysis and structural formula diagram of flavor substances with OAV>1 in daylily under three drying methods
综上所述，不同香气物质在黄花菜3种干燥方式下贡献的香气程度明显不同。此外，不同干燥方式下黄花菜的特定香气物质具有一定的相似性和差异性，因此造成干燥结束后黄花菜的风味具有一定的普遍性和独特性。
2.3.2 PCA分析
为进一步研究3种干燥方式下黄花菜的特征风味物质，特将12种OAV>1的挥发性化合物进行PCA分析。如图6所示，2个主成分PC1和PC2累计贡献率为97.8%>85%，表明2个PCA值能够解释原变量绝大部分信息。
图6 PCA 载荷图
Fig.6 PCA load Diagram
由图6可知，乙酸(54)和1-辛烯-3-醇(2)与PC1显示出较强的正相关，β-月桂烯(50)与PC1显示出较强的负相关；PC2与β-月桂烯(62)和1-辛烯-3-醇(2)显示出较强的正相关，与乙酸(54)显示出较强的负相关。结合OAV值可知黄花菜中重要风味成分为1-辛烯-3-醇(2)、β-月桂烯(62)和乙酸(54)。
3 结论
利用GC-MS技术分析了干燥后黄花菜挥发性物质组成及含量，共鉴定出66种挥发性成分，其中自然干燥、热风干燥、真空脉动干燥分别检测到49、40、44种化合物，包括醇类、醛类、酮类、酯类、烷烃类、酸类、烯类和其他类化合物共八类成分，自然干燥挥发性物质含量最高，达到1 423.41 μg/kg。
通过PLS-DA与OAV结合PCA分析共鉴定出6种特征风味物质，其中3-呋喃甲醛、3-辛烯-2-酮、十六烷、乙酸为自然干燥特征风味物质，(E)-2-甲基-2-丁烯醛、3-辛烯-2-酮、十六烷为热风干燥特征风味物质，(E)-2-甲基-2-丁烯醛、β-月桂烯为真空脉动干燥特征风味物质。从获得良好的风味物质角度出发，真空脉动干燥可以得到较好的干制黄花菜。本研究通过对干燥后黄花菜的风味进行分析，甄选出最适宜的干燥方式，得到风味较好的黄花菜干制品，为今后黄花菜的干燥工艺研究提供了一定的理论依据。
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