溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种以腹痛、腹泻和黏液脓血便为主要特征的慢性炎症性肠病，病程长，反复发作，迁延不愈，严重影响患者的生活质量，给患者及其家庭带来沉重的经济负担[1-2]。目前，UC的确切病因尚不清楚。然而，当某些环境因素触发遗传易感宿主时，免疫系统的紊乱和与微生物的不平衡会导致慢性肠道炎症的发展[3]。目前临床上治疗UC的药物有环孢素类、5-氨基水杨酸药物、类固醇和免疫抑制剂等，虽有一定的治疗效果，但这些药物的长期使用会导致过敏等多种不良反应而限制了其应用[4-5]。因此，有效且毒副作用低的天然产物受到了越来越多的关注，开发源自天然的UC治疗药物并阐明其作用机制是目前亟需解决的问题[6]。
近年来我国UC发病率逐年升高，究其原因可能为营养结构中脂肪、蛋白与膳食纤维的摄入失衡。研究发现，过量摄入高脂肪和高蛋白食物会引起肠黏膜损伤，诱导UC发生。相反，食用水果和蔬菜等富含膳食纤维的食物可以修复UC肠黏膜损伤，减少UC发生[7]。因此，食用具有修复肠黏膜损伤作用的食物被认为是降低UC发病率的有效策略。
榴莲皮性温，味辛、甜,归肺、肝、肾经，具有清热泻火、滋补和保湿的功效[8-9]。榴莲皮中主要含有酚酸类、酚苷类、黄酮类、简单糖苷、色素等多种化学成分[8]。榴莲皮具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化[9]抗菌、镇痛止咳、肝脏保护、调节免疫功能、抗亚硝化作用等[10]。榴莲壳多糖(durian shell polysaccharide, DSP)能显著提高便秘模型大鼠的肠蠕动率、胃动素、胃泌素、P物质水平和短链脂肪酸浓度，降低生长抑素水平，改善胃肠动力。此外，研究发现，DSP对肠道菌群有一定的调节作用，可升高毛螺菌科NK4A136丰度，降低脱硫弧菌丰度[10-12]。但DSP对溃疡性结肠炎的研究尚未见报道。
因此，本研究采用2.5%的葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)溶液构建肠炎小鼠模型，探讨DSP对DSS诱导的肠炎小鼠的改善作用及其机制，为进一步筛选有效缓解结肠炎的饮食干预提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
榴莲壳，广西桂林市的马来西亚猫山王榴莲壳内皮；DSS，MP公司；邻甲苯胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸，四川西陇科学股份有限公司；30% H2O2，西陇科学股份有限公司；4%多聚甲醛组织固定液，Bioss公司；特级胎牛血清，南京生航生物技术有限公司；抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素6(interleukin 6, IL-6)和白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)ELISA试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)试剂盒，南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
Research plus单道可调移液器，德国Eppendorf公司；IX73倒置荧光成像系统显微镜，日本奥林巴斯株式会社；Synergy UV实验室纯水系统，德国密理博公司；RE-52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；BCE224-1CCN分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司；NanoDrop 2000分光光度计，赛默飞世尔科技公司；CFX96 Touch Real-Time PCR仪，美国Bio-RAD公司；Mini-Protean Tetra Cell蛋白电泳系统，美国Bio-RAD公司；3K15低温高速离心机，德国Sigma公司等。
1.3 实验动物
本实验的所有程序均经过桂林医学院动物伦理委员会的严格审核和批准，动物协议批准文号为GLMC202103003。SPF级健康C57BL/6小鼠，雄性，36只，7周龄，体重(20±2) g，购自湖南斯莱克景达动物实验有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。所有动物均饲养在SPF级环境中，实验开始前将其放置在空调房间中适应环境，房间温度保持在(23±1) ℃，湿度保持在(55±10)%，12 h光照(08∶00-20∶00)，12 h黑暗(20∶00-08∶00)交替，小鼠自由摄食和饮水，适应喂养1周。
1.4 实验方法
1.4.1 DSP的提取
将榴莲外皮与白瓤内皮分开，把白瓤内皮放置烘箱烘干至恒重，用粉碎机粉碎成粉末，过筛，准确称取粉末质量。以1∶20(g∶mL)的比例加入超纯水，在80 ℃恒温水浴下提取2 h，过滤，滤饼以同样条件提取2次，离心取提取液上清，加入乙醇溶液至最终质量分数为95%，沉淀多糖24 h，过滤。在-50 ℃下，冷冻干燥提取液至粉末状，得到DSP。
1.4.2 细胞培养
人结肠上皮细胞系Caco-2，获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，由本实验室自行传代保存。Caco-2细胞在含有10%(体积分数)胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium, DMEM)中于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。
1.4.3 小鼠模型建立
小鼠适应性喂养1周后，随机分为空白组、模型组、DSP低剂量组(250 mg/kg)、DSP中剂量组(500 mg/kg)、DSP高剂量组(1 000 mg/kg)、美沙拉嗪阳性药(mesalazine, 200 mg/kg)组，每组6只。除对照组以外的小鼠自由饮用7 d的2.5% DSS，然后饮用超纯水3 d。建模同时给药组小鼠每天灌胃给予DSP或mesalazine，连续10 d。实验过程中，每日记录小鼠体重、粪便性状、便血情况等，根据疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分表进行评分。第10天用戊巴比妥钠麻醉小鼠后，收集小鼠结肠并测量其长度。
1.4.4 DAI评分
每天记录小鼠体重变化、大便稠度及粪便隐血情况。DAI评分为(体重减轻+大便稠度+大便隐血)/3。评分如表1所示。
表1 DAI 评分
分数体重减轻粪便性状隐血情况0正常正常正常11%～5%介于两者之间-25%～10%糊状便隐血阳性311%～15%介于两者之间-4>15%腹泻肉眼可见出血
1.4.5 结肠组织病理观察
将测量后的结肠组织用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)冲洗干净，取1 cm的结肠用4%多聚甲醛固定24 h，经过脱水、石蜡包埋、切片(5 μm)、苏木精伊红染色(hematoxylin and eosin staining, H&E)，使用显微镜观察组织病变情况并拍照。并根据表2进行组织评分：
表2 结肠横断面组织病理学评分
Table 2 Histopathological score of colon cross section
评分上皮损伤炎症细胞浸润淋巴滤泡个数0正常形态无渗透无淋巴滤泡1杯状细胞丢失隐窝周边浸润1个淋巴滤泡2大面积杯状细胞丢失黏膜肌层浸润2个淋巴滤泡3隐窝丢失大面积浸润到肌层3个淋巴滤泡4大面积隐窝丢失黏膜下层浸润大于3个淋巴滤泡
1.4.6 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测结肠组织和TNF-α诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍模型中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达
结肠组织用PBS清洗并用滤纸吸干水分后，称取40 mg剪碎，以PBS作为匀浆液制备结肠组织匀浆，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，分离上清。将Caco-2细胞均匀地接种于六孔板中，待细胞融合至单层后，用不含血清培养基饥饿细胞6 h，然后依次添加5%(体积分数)FBS-DMEM、TNF-α(10 ng/mL)药液、TNF-α(1 ng/mL)+DSP(3 μmol/L)药液、TNF-α(10 ng/mL)+DSP(10 μmol/L)药液、TNF-α(10 ng/mL)+DSP(30 μmol/L)药液、TNF-α(10 ng/mL)+mesalazine(10 μmol/L)药液，置细胞培养箱中孵育24 h。在4 ℃、1 000 r/min条件下离心5 min，除去杂质及细胞碎片，分离上清。按照ELISA试剂盒说明书检测小鼠结肠组织匀浆上清中和Caco-2细胞培养基上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白表达水平。
1.4.7 结肠组织MPO活性检测
称取40 mg结肠组织剪碎后，按照MPO试剂盒说明书检测结肠组织中的MPO活性，其中以每克湿组织的质量为单位。
1.4.8 小鼠结肠组织和TNF-α诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍模型中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达
称取40 mg结肠组织分别加入1 mL的总RNA提取试剂，在冰浴下研磨至无可见组织颗粒。将Caco-2细胞培养基给药处理(细胞给药处理同方法1.4.6一致)，弃去培养基。每孔分别加入1 mL的总RNA提取试剂，冰上裂解20 min。随后，将裂解好的组织和细胞转移到无酶无热源的1.5 mL塑料离心管中，分别加入200 μL三氯甲烷，剧烈振摇1 min后冰上静置10 min，随后于4 ℃下12 000 r/min离心15 min。取上清液移至无酶无热源的1.5 mL EP管中，加入等体积的异丙醇，轻摇混匀，-20 ℃静置20 min，在4 ℃下12 000 r/min离心10 min，弃去上清液并加入1 mL 75%(体积分数)乙醇吹打混匀，4 ℃下7 500 r/min离心5 min，弃上清，稍微晾干后每管加入20 μL 焦炭酸二乙酯溶解后即得总RNA，并取1 μL RNA使用核酸蛋白定量仪测定RNA含量。根据逆转录说明书采用20 μL逆转录反应体系将RNA进行逆转录获得cDNA，然后使用SYBR Green染料法定量分析cDNA扩增情况。选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参基因，并记录各组的Threshold cycle(Ct)值，使用2-△△Ct法分析基因表达水平。引物序列见表3。
表3 引物序列
Table 3 Primer sequences
引物名称序列(5′-3′)mouse TNF-α FGAGGCAATAGGTTTTGAGGGGCATGmouse TNF-α RCTGGAGGCTGAACCCCGTCCmouse IL-6 FACTTTTCCCCCTAGTTGTGTCTTGCmouse IL-6 RTTGTGCAATGTGACGTCCTTTAGCATmouse IL-1β FTGCTCCACATTTCAGAACCTATCTTCTTmouse IL-1β RCATAAGCCTCGTTATCCCATGTGTCmouse GAPDH FAGGTCGGTGTGAACGGATTTGmouse GAPDH RTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCAhuman TNF-α FGAGGCCAAGCCCTGGTATGhuman TNF-α RCGGGCCGATTGATCTCAGChuman IL-6 FACTCACCTCTTCAGAACGAATTGhuman IL-6 RCCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGhuman IL-1β FATGATGGCTTATTACAGTGGCAAhuman IL-1β RGTCGGAGATTCGTAGCTGGAhuman GAPDH FACAACTTTGGTATCGTGGAAGGhuman GAPDH RGCCATCACGCCACAGTTTC
1.4.9 蛋白质印迹分析(Western Blot, WB)测定炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)、肠屏障相关蛋白(ZO-1、occludin、Claudin-7、E-cadherin和N-cadherin)蛋白表达水平
(1)提取蛋白
取结肠组织用冰的PBS清洗3次，加入蛋白裂解液[99%(体积分数)放射免疫沉淀法缓冲液+1%(体积分数)苯甲基磺酰氟]400 μL，组织冰上研磨10 min，于4 ℃，12 000 r/min离心10 min，将上清液转移到1.5 mL塑料离心管中，根据BCA试剂盒说明书进行蛋白定量，或加入loading buffer煮沸冷却保存在-80 ℃备用。
(2)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
根据待测蛋白分子量配制不同浓度的分离胶和浓缩胶并进行灌制，在1×电泳缓冲液中依次加入预染蛋白marker和待测样品，电泳约2 h后，将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，根据分子质量大小设置转膜时间，将PVDF膜置于预先配制好的封闭液中，室温封闭2 h。PBS+吐温20冲洗4次，每次5 min，后置于4 ℃下一抗包被过夜，第二天PBS+吐温20冲洗4次，每次5 min，室温二抗包被2 h，PBS+吐温20冲洗4次，每次5 min。应用Bio-Rad凝胶成像系统对胶片进行拍照，Image J软件分析光密度。
1.4.10 免疫荧光(immunofluorescence, IF)
取Caco-2细胞以适宜密度接种于96孔板中，待细胞融合至单层后，用不含血清培养基饥饿细胞6 h，将Caco-2细胞培养基给药处理(细胞给药处理同方法1.4.6一致)，置细胞培养箱中孵育24 h。弃培养基，预冷PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定1 h。预冷PBS清洗2次，加1% TritonX-100，室温孵育30 min(通透)。预冷PBS洗涤2次，每次10 min。加3% H2O2-甲醇溶液室温放置30 min(灭活酶)。预冷PBS洗涤2次，每次10 min。加100 μL/孔的一抗(根据抗体说明书对E-cadherin一抗和N-cadherin一抗进行稀释)，4 ℃孵育过夜。预冷PBS洗涤2次，每次10 min。加入不荧光标记的二抗各150 μL，37 ℃孵育2 h。预冷PBS洗涤2次，每次10 min。加DAPI染料染色15 min。预冷PBS洗涤2次，每次10 min。荧光显微镜下观察、拍照并分析。
1.4.11 统计分析
采用统计软件进行数据分析，数据以至少3次独立实验的平均值±标准差
表示。使用单因素方差分析和Tukey的事后检验来评估数据的重要性。P<0.05，差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 DSP对DSS诱导的UC小鼠模型体重、腹泻、隐血和结肠长度的影响
DSS诱导的UC小鼠模型的典型特征是体重减轻、腹泻和结肠出血，疾病特征与UC患者相似[13]。为了比较DSP对DSS诱导的UC小鼠疾病症状的改善作用，给予UC小鼠灌胃10 d的DSP，并以mesalazine为阳性对照。由图1可知，与空白组相比，DSS处理后明显减轻小鼠体重、并出现严重腹泻和粪便出血，说明结肠炎模型造模成功。然而给予DSP干预后，显著阻止了小鼠体重降低，降低了DAI评分升高，减轻了结肠重量以及增长了结肠长度。并且研究发现，DSP高剂量组(1 000 mg/kg)的作用略优于阳性药组(200 mg/kg)，表明DSP可以改善UC小鼠结肠疾病症状。
a-体重变化；b-疾病活动指数；c-结肠重量；d-结肠长度
图1 DSP对DSS诱导的UC小鼠体重、腹泻、潜血、结肠重量和长度的影响
Fig.1 Effects of DSP from different regions on body weight, diarrhea, occult blood, colonic weight and length in DSS-induced UC mice
注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01(下同)
2.2 各组小鼠结肠组织形态学变化
DSS可以引起小鼠结肠上皮损伤，包括隐窝结构的弥漫性损伤、杯状细胞的损失和大量中性粒细胞浸润[14]。为了比较DSP对各组小鼠结肠组织形态学变化的影响，采用H&E染色观察各组小鼠结肠组织进行评价。由图2可知，空白组小鼠结肠表现为黏膜上皮完整，隐窝结构清晰可见，腺体排列紧密规则，杯状细胞形态正常，且无明显炎性细胞浸润与溃疡。经DSS处理后，小鼠结肠组织黏膜上皮出现缺失，隐窝结构破坏，杯状细胞被大量流失，黏膜下层水肿增厚，黏膜层及其黏膜下层出现大面积炎症细胞浸润，黏膜层形成较大溃疡。然而，在DSP作用下，小鼠黏膜上皮较为完整，隐窝结构趋于完整，腺体排列比较规则，部分杯状细胞形态正常，炎性细胞浸润明显缓解，黏膜下层增厚减轻，肠壁水肿减轻，炎症症状减轻。结果说明DSP具有改善小鼠结肠病理损伤的作用。
a-各组小鼠结肠组织的H&E染色观察；b-病理评分
图2 DSP对各组小鼠结肠组织形态学变化的影响(×200)
Fig.2 Effects of DSP from different regions on the morphological changes of colon in mice in each group (×200)
2.3 DSP对DSS诱导的UC模型小鼠结肠炎症反应的影响
结肠炎是一种慢性炎症性肠病，以结肠炎症为特征，表现为促炎因子(如TNF-α、IL-6和IL-1β)的过表达[15]。为了比较DSP对DSS诱导的UC小鼠结肠炎症反应的影响，我们研究了DSP干预后促炎因子在DSS诱导的肠炎小鼠中的表达变化。如图3所示，与空白组相比，DSS导致结肠中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白质和mRNA的表达升高。与模型组相比，DSP高剂量组(1 000 mg/kg)小鼠结肠组织中的TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白质和mRNA表达明显降低。总体上来说，DSP能够通过抑制结肠中促炎因子的表达起到抗UC作用。
a～c-结肠中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表达水平；d～f-结肠中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平
图3 DSP对各组小鼠结肠组织中促炎因子表达的影响
Fig.3 Effects of DSP from different regions on the expression of pro-inflammatory factors in colonic tissue of mice in each group
2.4 DSP显著抑制TNF-α诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍模型中促炎因子的表达水平
为了进一步证明促炎因子在结肠炎的炎症反应中起重要作用，以TNF-α诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍模型为研究对象，考察DSP对Caco-2细胞中促炎因子的表达影响。如图4所示，与空白组相比，TNF-α导致Caco-2细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白质和mRNA表达增加。但DSP作用下可以显著抑制TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白质和mRNA的表达。总体上来说，结果进一步说明DSP抑制促炎因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的表达来改善结肠炎。
a～c-Caco-2细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表达水平；d～f-Caco-2细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平
图4 DSP对TNF-α(10 ng/mL)诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍模型中促炎因子表达的影响。
Fig.4 Effect of DSP on TNF-α (10 ng/mL)-induced expression of pro-inflammatory factors in a model of epithelial barrier dysfunction in Caco-2 cells
2.5 DSP对DSS诱导的UC模型小鼠结肠MPO活性的影响
MPO通常被用作中性粒细胞的标记物，在实验性结肠炎中，疾病严重程度通常与MPO活性增加相关[16-17]。为了比较DSP对UC小鼠结肠MPO活性的影响，通过试剂盒来检测小鼠结肠中MPO的表达水平。结果发现，相对于空白组，DSS处理导致小鼠结肠MPO活性升高。相对于模型组，DSP中、高剂量组干预均可以显著抑制MPO的活力。这表明DSP通过抑制中性粒细胞的浸润改善结肠炎(图5)。
图5 DSP对DSS诱导的UC小鼠结肠MPO活性的影响
Fig.5 Effects of DSP from different regions on MPO activity in colon of DSS-induced UC mice
2.6 DSP对肠屏障相关蛋白(ZO-1、occludin、Claudin-7、E-cadherin和N-cadherin)蛋白表达水平的影响
Western blotting结果显示，相比于空白组，模型组小鼠肠组织ZO-1、occludin、Claudin-7及E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05)，N-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较，DSP组小鼠肠组织ZO-1、occludin、Claudin-7及E-cadherin蛋白表达水平呈剂量依赖性增加(P<0.05)，N-cadherin蛋白表达水平呈剂量依赖性降低(P<0.05)。相比于模型组，阳性药组小鼠肠组织ZO-1、occludin、Claudin-7及E-cadherin蛋白表达水平显著升高，N-cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，如图6所示。
a-肠屏障相关蛋白代表性条带； b-肠屏障相关蛋白条带的数据统计结果
图6 DSP对肠屏障相关蛋白(ZO-1、occludin、Claudin-7、 E-cadherin和N-cadherin)蛋白表达水平的影响
Fig.6 Effect of DSP on protein expression levels of intestinal barrier-related proteins (ZO-1, occludin, Claudin-7, E-cadherin and N-cadherin)
注：与空白组比较，##P<0.05，##P<0.01；与模型组比较， *P<0.05，**P<0.01
2.7 TNF-α诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍模型中，DSP显著上调E-cadherin、显著下调N-cadherin紧密连接蛋白表达水平
为了进一步证明紧密连接蛋白在结肠炎的上皮屏障功能障碍中起重要作用，本研究考察了DSP对TNF-α诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍模型中紧密连接蛋白表达的影响，通过IF检测Caco-2细胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达水平。结果如图7所示，与空白组相比，TNF-α诱导的Caco-2细胞中E-cadherin的蛋白表达降低、N-cadherin的蛋白表达升高。而与模型组相比，DSP在蛋白表达水平上以浓度依赖方式显著上调E-cadherin的表达水平，并以浓度依赖方式显著下调N-cadherin的表达水平。图6可以直观地体现DSP促进Caco-2细胞膜上E-cadherin紧密连接蛋白的表达水平，降低Caco-2细胞膜上N-cadherin紧密连接蛋白的表达水平。以上结果进一步说明DSP通过促进E-cadherin紧密连接蛋白表达和降低N-cadherin紧密连接蛋白表达修复结肠炎肠粘膜损伤。
3 结论与讨论
UC是一种影响结肠的慢性特发性炎症性疾病，多表现为便血和腹泻[18]。由于其病程长、易复发、迁延难愈，而且一旦发展到终末期会增加患者患癌风险，严重影响生活质量，目前该疾病已成为热点问题之一[19]。现有的UC治疗药物往往存在一定的副作用。因此，发现对UC患者既安全又有效的新药至关重要。
近年来，从植物中分离出的天然多糖已被证明具有多种药理学益处，包括抗炎，抗病毒，抗肿瘤，抗衰老，增加身体免疫力和调节胃肠道菌群。多糖等天然植物活性化合物，因其强大的抗炎能力和安全性在缓解UC损伤方面受到越来越多的关注[20-21]。当黏膜屏障受损时，来自肠腔的有害物质(如内毒素)可能会引起粘膜免疫系统的过度激活，从而加剧炎症反应。临床研究表明，UC患者的紧密连接蛋白(例如，occludin、Claudin和E-cadherin)表达水平低于健康人群[22]。此外，PAN等[23]报道紧密连接蛋白表达缺乏导致结肠炎并加速结肠炎相关肿瘤的发展，相反增加紧密连接蛋白的表达可以维持肠上皮屏障的完整性，从而抑制结肠炎症反应防止疾病恶化。因此，保持肠黏膜的完整性可以改善UC。
在UC的治疗中，天然多糖可以调节炎症因子，免疫系统和肠道菌群，并保留肠黏膜。它具有良好的疗效，并且使用安全，因此是UC患者的潜在治疗方法[24]。例如，来源于植物的膳食多酚可以通过抑制炎症反应来治疗UC[25]。从海南刺槐中分离出的多糖大大降低了UC小鼠的疾病活性指数和TNF-α、IL-17水平，并防止了结肠黏膜中的中性粒细胞聚集[26]。蔓越莓多糖已被证明可以降低结肠的宏观评分和损伤面积，下调MPO和丙二醛，极大地刺激黏膜修复和再生，并减少DSS诱导的实验性结肠炎[27]。在结肠炎动物中，以精确的水平共同给予黄芪多糖与毛茛多糖可能会改善临床症状，恢复免疫平衡，并减少结肠黏膜损伤[28]。共同给予黄连粗多糖和小檗碱增加UC小鼠结肠中紧密连接蛋白的表达，从而修复UC动物的结肠黏膜屏障损伤[29]。通过共同给予枸杞多糖和辣椒素，改善了DSS引起UC动物的抗炎和抗氧化作用。它降低了血清IL-6和结肠TNF-α但增强了血清超氧化物歧化酶活性[30]。榴莲内皮提取物也具有抗炎活性，能显著抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞所产生的NO和炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的释放[9]。由于不良反应很少，从植物中分离出的天然多糖通过调节细胞因子，抑制/激活信号通路，调节肠道菌群等特征，在UC中具有良好的治疗效果，并逐渐成为研发热点。
图7 DSP对TNF-α诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能 障碍模型中(E-cadherin和N-cadherin)紧密连接蛋白 表达水平的影响
Fig.7 Effect of DSP on the expression levels of (E-cadherin and N-cadherin) tight junction proteins in a model of TNF-α-induced epithelial barrier dysfunction in Caco-2 cells
本试验以DSS诱导的结肠炎小鼠为模型，探究DSP饮用量的不同对小鼠结肠炎的改善作用。造模后小鼠的DAI值、炎症因子表达均显著升高，表明小鼠结肠炎模型建造成功。对造模小鼠给予DSP干预，小鼠结肠炎症状减轻，炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达降低，MPO的表达水平降低，经结肠组织切片观察，结肠组织上皮及隐窝结构完整，杯状细胞增多。与模型组比较，DSP组小鼠肠组织ZO-1、occludin、Claudin-7及E-cadherin蛋白表达水平呈剂量依赖性增加(P<0.05)，N-cadherin蛋白表达水平呈剂量依赖性降低(P<0.05)。在细胞模型中，DSP通过上调E-cadherin蛋白表达水平和下调N-cadherin的蛋白表达水平来修复黏膜损伤并减轻肠道炎症。综上所述，DSP能改善DSS诱导的小鼠肠黏膜损伤和TNF-α诱导的Caco-2细胞上皮屏障功能障碍，对溃疡性结肠炎具有良好的保护作用。
[1] CURR
D, IANIRO G, PECERE S, et al.Probiotics, fibre and herbal medicinal products for functional and inflammatory bowel disorders[J].British Journal of Pharmacology, 2017, 174(11):1 426-1 449.
[2] YANG T, MA X, WANG R L, et al.Berberine inhibits IFN-γ signaling pathway in DSS-induced ulcerative colitis[J].Saudi Pharmaceutical Journal, 2022, 30(6):764-778.
[3] HOSSEN I, WU H, LUO T, et al.Phytochemicals and inflammatory bowel disease:A review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2020, 60(8):1 321-1 345.
[4] TURNER D, RICCIUTO A, LEWIS A, et al.STRIDE-II:An update on the selecting therapeutic targets in inflammatory bowel disease (STRIDE) initiative of the international organization for the study of IBD (IOIBD):Determining therapeutic goals for treat-to-target strategies in IBD[J].Gastroenterology, 2021, 160(5):1 570-1 583.
[5] DU L, HA C.Epidemiology and pathogenesis of ulcerative colitis[J].Gastroenterology Clinics of North America, 2020, 49(4):643-654.
[6] HONG C J, CHEN S Y, HSU Y H, et al.Protective effect of fermented okara on the regulation of inflammation, the gut microbiota, and SCFAs production in rats with TNBS-induced colitis[J].Food Research International (Ottawa, Ont.), 2022, 157:111390.
[7] GUO H R, GUO H, XIE Y, et al.Mo3Se4 nanoparticle with ROS scavenging and multi-enzyme activity for the treatment of DSS-induced colitis in mice[J].Redox Biology, 2022, 56:102441.
[8] ZHAN Y F, HOU X T, FAN L L, et al.Chemical constituents and pharmacological effects of durian shells in ASEAN countries:A review[J].Chinese Herbal Medicines, 2021, 13(4):461-471.
[9] 谢果, 吴敏芝, 成金乐, 等.榴莲皮提取物抗炎作用研究[J].广州中医药大学学报, 2015, 32(1):130-135.
XIE G, WU M Z, CHENG J L, et al.Experimental study of anti-inflammation of durian peel extract[J].Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, 2015, 32(1):130-135.
[10] 姜慧敏. 榴莲皮多糖调节免疫功能的研发[D].开封:河南大学, 2020.
JIANG H M.Study of immune function regulate of polysaccharides extracted from Durio zibethinus Murr rind[D].Kaifeng:Henan University, 2020.
[11] 宋苗苗. 榴莲皮多糖结构表征及抗凝血活性研究[D].开封:河南大学, 2019.
SONG M M.Structural characterization and anticoagulantactivity of polysaccharide from Durio zibethinus Murr peel[D].Kaifeng:Henan University, 2019.
[12] JIANG H M, DONG J, JIANG S J, et al.Effect of Durio zibethinus rind polysaccharide on functional constipation and intestinal microbiota in rats[J].Food Research International, 2020, 136:109316.
[13] YAN Y X, SHAO M J, QI Q, et al.Artemisinin analogue SM934 ameliorates DSS-induced mouse ulcerative colitis via suppressing neutrophils and macrophages[J].Acta Pharmacologica Sinica, 2018, 39(10):1 633-1 644.
[14] HUANG C Y, LUO X Q, LI L L, et al.Glycyrrhiza polysaccharide alleviates dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis in mice[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine:ECAM, 2022, 2022:1345852.
[15] WAN F, WANG M Y, ZHONG R Q, et al.Supplementation with Chinese medicinal plant extracts from Lonicera hypoglauca and Scutellaria baicalensis mitigates colonic inflammation by regulating oxidative stress and gut microbiota in a colitis mouse model[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2022, 11:798052.
[16] XU X T, WEI C Q, YANG Y Y, et al.New discovery of anti-ulcerative colitis active ingredients of Nostoc commune:P-Hydroxy benzaldehyde[J].Journal of Functional Foods, 2021, 77:104327.
[17] XU X, LUO A, LU X,et al.p-Hydroxybenzoic acid alleviates inflammatory responses and intestinal mucosal damage in DSS-induced colitis by activating ERβ signaling[J].Journal of Functional Foods,2021,87:104835.
[18] L
A, MANTEL M, MARCHIX J, et al.Inflammatory bowel disease therapeutic strategies by modulation of the microbiota:How and when to introduce pre-, pro-, syn-, or postbiotics?[J].American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2022, 323(6):G523-G553.
[19] WANG J L, ZHANG Q H, DENG Y W, et al.Efficacy and safety of heat-sensitive moxibustion in the treatment of ulcerative colitis:A protocol for a systematic review and meta-analysis[J].Medicine, 2021, 100(4):e24078.
[20] TIAN H C, WEN Z Y, LIU Z C, et al.Comprehensive analysis of microbiome, metabolome and transcriptome revealed the mechanisms of Moringa oleifera polysaccharide on preventing ulcerative colitis[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2022, 222(Pt A):573-586.
[21] GUO Y F, LI Y, CAO Q, et al.The function of natural polysaccharides in the treatment of ulcerative colitis[J].Frontiers in Pharmacology, 2022, 13:927855
[22] LARABI A, BARNICH N, NGUYEN H T T.New insights into the interplay between autophagy, gut microbiota and inflammatory responses in IBD[J].Autophagy, 2020, 16(1):38-51.
[23] PAN H H, ZHOU X X, MA Y Y, et al.Resveratrol alleviates intestinal mucosal barrier dysfunction in dextran sulfate sodium-induced colitis mice by enhancing autophagy[J].World Journal of Gastroenterology, 2020, 26(33):4 945-4 959.
[24] FITZPATRICK J A, MELTON S L, YAO C K, et al.Dietary management of adults with IBD—The emerging role of dietary therapy[J].Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2022, 19(10):652-669.
[25] WANG Y J, LI Q M, ZHA X Q, et al.Intervention and potential mechanism of non-starch polysaccharides from natural resources on ulcerative colitis:A review[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2022, 210:545-564.
[26] MIAO X P, SUN X N, CUI L J, et al.Suppressive effect of pectic polysaccharides extracted from Rauwolfia verticillata (Lour.) Baill.var.hainanensis Tsiang on inflammation by regulation of NF- κ B pathway and interleukin-17 in mice with dextran sulphatesodium-induced ulcerative colitis[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 2015, 8(2):147-152.
[27] ISHISONO K, MANO T, YABE T, et al.Dietary fiber pectin ameliorates experimental colitis in a neutral sugar side chain-dependent manner[J].Frontiers in Immunology, 2019, 10:2979.
[28] TANG S, LIU W, ZHAO Q Q, et al.Combination of polysaccharides from Astragalus membranaceus and Codonopsis pilosula ameliorated mice colitis and underlying mechanisms[J].Journal of Ethnopharmacology, 2021, 264:113280.
[29] 薛明松, 郑玉玉, 张宇峰, 等.黄连粗多糖协同小檗碱改善溃疡性结肠炎肠黏膜屏障损伤的作用[J].中国实验方剂学杂志, 2022, 28(13):71-76.
XUE M S, ZHENG Y Y, ZHANG Y F, et al.Coptidis rhizoma crude polysaccharide and berberine synergistically restore intestinal mucosal barrier damage in ulcerative colitis[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2022, 28(13):71-76.
[30] CHEN Y S, LIAN Y Z, CHAO J.Protective effect of Lycium barbarum polysaccharides and capsaicin in rats with dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis via anti-inflammation and antioxidation[J].Current Developments in Nutrition, 2021, 5(Supplement 2):306.