酒精性胃黏膜损伤是胃肠道的主要疾病且发病率日益升高[1]。胃黏膜屏障是胃功能的重要保护机制，大量摄入酒精会使得中性粒细胞浸润胃黏膜，释放髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，耗尽黏液和碳酸氢盐，破坏胃黏膜保护层，导致胃黏膜损伤[2-4]。酒精诱导的胃黏膜损伤主要包括黏膜出血，黏膜水肿，炎性浸润和弥漫性溃疡等[5]。
具有生物医学应用潜力的多肽数量巨大，这些多肽的生物医学应用范围从药物到天然保健品和功能食品成分[6]。例如，二肽WY具有抑制小鼠脑炎，改善认知能力的功能[7]，二肽AG是修复动物和人类肠道损伤的关键成分[8]，大鼠脑内源性环二肽PG具有促进记忆力的生物活性[9]，二肽NW具有抗氧化和抗糖基化活性[10]，二肽WR可以改善肝细胞中的脂质积累[11]，二肽YL表现出强大的抗焦虑活性[12]，同时YL还在小鼠中显示出抗抑郁活性[13]，二肽GL通过抑制炎症和氧化反应发挥抗疲劳作用[14]，二肽LI对小鼠中脑神经元的死亡有保护作用[15]，肌肽在高强度运动中具有延缓疲劳的作用[16]，二肽RF可引起肠道内分泌细胞反应，降低自发性高血压大鼠的血压等[17]。
本实验室通过前期研究从小麦肽中分离鉴定出了3种含有谷氨酰胺的二肽：AQ、SQ和IQ。在本研究中，我们利用GES-1细胞建立体外酒精性胃黏膜损伤模型，以证明二肽AQ、SQ和IQ具有增强胃黏膜上皮细胞抵抗酒精性损伤能力的作用，并试图阐明其作用效果和机制，为新的生物活性二肽的开发和利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验细胞：GES-1细胞，购自上海冠导生物工程有限公司。
肽段AQ、SQ、IQ，由强耀生物科技有限公司合成(纯度≥99%)；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)高糖培养基，Hyclone；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，GIBCO；青霉素链霉素溶液、CCK-8检测试剂盒、ROS检测试剂盒、ECL(enhanced chemiluminescence)发光试剂盒，碧云天生物技术有限公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)检测试剂盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；ZO-1 Polyclonal antibody、Occludin Polyclonal antibody、Claudin 1 Polyclonal antibody、MPO Polyclonal antibody、iNOS Polyclonal antibody、COX-2 Monoclonal antibody、EGF Polyclonal antibody，Proteintech。
1.2 仪器与设备
生物安全柜，新加坡ESCO公司；细胞培养箱，Thermo Fisher Scientific公司；荧光酶标仪，美谷分子仪器(上海)有限公司；Biosciences AccuriC6流式细胞仪，美国BD公司；荧光及化学发光成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养
GES-1细胞培养在含5% CO2的37 ℃恒温培养箱中，培养基采用含10%(体积分数)FBS和1%双抗(青霉素的含量为100 U/mL，链霉素的含量为100 μg/mL)的DMEM高糖培养基。细胞融合达80%左右时用2.5 g/L胰酶进行消化传代。
1.3.2 细胞毒性实验
将细胞按照1×104 个/mL的浓度接种于96孔板中，培养24 h后，分别向96孔板中加入含有肽段AQ、SQ和IQ的完全培养基，其终质量浓度分别为0、10、20、30、40、50、60 μg/mL，每种肽段的每个浓度设置12个重复，继续培养24 h，之后向每孔中加入10 μL 的CCK-8，37 ℃下继续培养1.5 h，利用酶标仪在450 nm下检测吸光度。
1.3.3 酒精损伤细胞模型建立
将细胞按照1×104 个/mL的浓度接种于96孔板中，培养24 h后，向每孔中加入含有酒精的完全培养基，酒精体积分数分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，每个浓度设置12个重复孔，继续培养12 h后向每孔加入10 μL的CCK-8，37 ℃下继续培养1.5 h，利用酶标仪在450 nm下检测吸光度；收集细胞培养上清液，利用LDH检测试剂盒检测培养上清液中LDH活性。
1.3.4 细胞损伤与ROS含量检测
将细胞按照5×105 个/mL的浓度接种于6孔板中，培养24 h后，除对照组和模型组外，其余各处理组经不同肽段的不同浓度分别预处理24 h后，除对照组外，其余各组都按照选定的酒精浓度处理12 h，培养结束后进行ROS荧光探针标记和收集细胞，使用流式细胞仪计数并调整细胞浓度一致，将处理好的细胞接种于96孔黑板中，利用荧光酶标仪在488/525 nm的激发/发射波长下检测细胞荧光强度。
1.3.5 细胞氧化应激检测
将细胞按照5×105 个/mL的浓度接种于6孔板中，按照上述处理方式培养细胞，培养结束后，使用RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液裂解细胞，离心后收集上清液，检测上清液中MDA、SOD、GSH-Px、GSH含量或酶活力。
1.3.6 Western Blot实验
细胞按照5×105 个/mL的浓度接种于6孔板中，按照上述处理方式培养细胞，培养结束后，使用RIPA裂解液裂解细胞，收集细胞蛋白保存于-80 ℃直至用于Western Blot。蛋白电泳上样量为20 μg，采用湿转法将蛋白条带转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，PVDF膜与对应一抗在4 ℃下孵育过夜，二抗与PVDF膜孵育2 h，采用ECL发光液将蛋白条带显色，采用ImageJ软件对条带灰度进行分析。
1.4 数据分析
采用Origin 2022统计软件对数据进行处理，实验结果以均值±标准误差(Mean±SE)表示。各项实验进行至少3次重复，采用Tukey′s Method进行数据分析和各组间比较，P<0.05表示具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 细胞毒性检测
细胞存活率检测结果如图1所示，各浓度的二肽对细胞存活率都没有显著影响。在本研究中，我们选用30、60 μg/mL两个质量浓度进行后续实验(分别记为AQ30、AQ60、SQ30、SQ60、IQ30、IQ60)。
图1 细胞存活率检测结果
Fig.1 Cell viability test results
注：不同小写字母表示显著(P<0.05),相同小写字母表示 无显著性差异(P<0.05)(下同)
2.2 细胞损伤模型建立
LDH在正常情况下只存在于细胞内，当细胞受到损伤，细胞膜通透性发生改变，LDH便会从细胞中漏出。由图2可知，当酒精体积分数达到3%时，细胞存活率显著降低，同时，细胞的LDH释放量显著升高，因此，在本研究中，造模方式选择为3%酒精处理GES-1细胞12 h。
a-细胞存活率；b-LDH活性
图2 细胞存活率和细胞培养上清液中LDH活性
Fig.2 Cell viability and LDH activity in cell culture supernatant
2.3 细胞损伤和氧化应激检测
酒精诱导的胃黏膜损伤与ROS水平的升高程度相关，ROS主要来自炎症环境下MPO驱动的中性粒细胞[1]。一般认为SOD和GSH是防御ROS的第一道防线[18]，在胃黏膜产生的氧自由基一方面在SOD的催化下转变为H2O2，一方面被GSH等非酶抗氧化剂清除[19]，而MDA则是ROS造成的细胞膜上不饱和脂肪酸脂质过氧化的标志物[20]。由图3可知，酒精处理显著提高了细胞LDH释放量和细胞中ROS含量；在经过肽段预处理的细胞中，LDH释放量和ROS含量都有了不同程度的降低，其中，肽段以剂量依赖的方式降低细胞中LDH的释放。由图4可知，经酒精处理后，细胞中MDA含量和SOD活性显著升高，GSH-Px活性和GSH含量显著降低，表明细胞中产生了明显的氧化应激，SOD活性升高以应对细胞中过度产生的ROS，而GSH-Px和GSH已经被显著消耗；在经过肽段预处理的细胞中，MDA含量、GSH-Px活性和GSH含量相比于模型组都具有显著性差异，SOD活性也不同程度的低于模型组，表明经肽段预处理后细胞的抗氧化能力增强。其中，肽段以剂量依赖的方式改变SOD活性和GSH含量。
2.4 紧密连接蛋白表达检测
胃黏膜上皮屏障功能主要由包括紧密连接蛋白在内的紧密连接复合体维持[21]，紧密连接蛋白主要包括Occludin、Claudins和胞质附着蛋白ZO家族[22]，ZO-1、Occludin和Claudin 1在胃黏膜屏障中发挥了关键作用[21]，其异常表达会影响胃黏膜屏障功能，使胃受到幽门螺杆菌的侵袭或刺激，引起胃病[23]。由图5可知，经酒精处理后，细胞中3种紧密连接蛋白的表达量都显著降低，表明细胞屏障功能受到损害，经肽段预处理后，细胞中3种紧密连接蛋白的表达量都不同程度的高于模型组，表明肽段的预处理可以增强上述3种紧密连接蛋白的表达从而增强上皮细胞屏障功能，抵御来自酒精造成的屏障功能受损，且3种肽段都以剂量依赖的方式提高3种紧密连接蛋白的表达。
a-LDH活性；b-ROS相对含量
图3 细胞培养上清中LDH活性和细胞内 ROS相对含量
Fig.3 LDH activity in cell culture supernatant and intracellular ROS relative content
2.5 细胞损伤标志蛋白表达检测
胃黏膜中白细胞的渗透和聚集通常基于MPO活性，MPO活性已被广泛用作评估中性粒细胞渗透水平的标准指标[4]。NO可抑制中性粒细胞的黏附和浸润，维持黏膜完整[24-25]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的活性会在胃黏膜受到中度损伤性刺激后迅速升高，导致NO合成增加[26]，过表达的NO与超氧阴离子反应形成过氧亚硝酸盐，导致胃组织脂质过氧化损伤，加速胃黏膜受损[5]。酒精导致COX-2等促炎因子表达和释放，介导机体炎症反应，在胃溃疡的发展中起着重要作用[5, 27]。表皮生长因子(epidermal augmentum factor，EGF)在胃肠道黏膜修复中发挥着重要作用，在胃肠道上皮细胞受损后表达增加[28]。由图6可知，在酒精处理下，细胞中MPO、iNOS、COX-2和EGF的蛋白表达量都显著升高，表明细胞受到了严重损伤。经过肽段预处理的细胞中上述4种蛋白的表达量都显著低于模型组，表明肽段的预处理增强了细胞抵抗酒精损害的能力，使得酒精造成的细胞损伤减弱，从而使得相关蛋白的表达量低于模型组。
a-MDA；b-SOD；c-GSH-Px；d-GSH
图4 细胞中MDA、SOD、GSH-Px和GSH检测结果
Fig.4 Detection results of MDA, SOD, GSH-Px, and GSH in cells
a-Western Blot条带；b-ZO-1蛋白灰度分析；c-Claudin 1蛋白灰度分析；d-Occludin蛋白灰度分析
图5 细胞内ZO-1、Claudin 1和Occludin蛋白Western Blot条带和灰度分析
Fig.5 Western Blot bandand gray scale analysisof intracellular ZO-1, Claudin 1, and Occludin proteins
a-Western Blot条带；b-MPO蛋白灰度分析；c-iNOS蛋白灰度分析；d-COX-2蛋白灰度分析；e-EGF蛋白灰度分析
图6 细胞内MPO、iNOS、COX-2和EGF蛋白的Western Blot条带和灰度分析
Fig.6 Western Blot band and gray scale analysis of MPO, iNOS, COX-2, and EGF proteins in cells
3 结论
本研究利用人胃黏膜上皮细胞GES-1建立了体外酒精性胃黏膜损伤模型，通过检测细胞膜通透性和细胞氧化应激状态，细胞紧密连接蛋白表达情况，相关损伤标志物的蛋白表达水平等指标，探讨了二肽AQ、SQ和IQ增强GES-1细胞抵抗酒精性损伤能力的作用。本实验结果表明，含有谷氨酰胺的二肽AQ、SQ和IQ皆可不同程度的改善由酒精造成的细胞氧化应激，提高紧密连接蛋白表达水平，减轻细胞损伤，从而增强胃黏膜上皮细胞抵抗酒精性损伤的能力。二肽的生理活性与其氨基酸组成和顺序相关，不同的氨基酸组成和顺序可能会带来不同的吸收特性和稳定性，最终导致不同的生理活性。在本实验中，3种二肽的N端都是谷氨酰胺，而C端为3种不同的氨基酸，因此3种二肽的生理活性略有不同，但其具体原因还需要对二肽的疏水性、稳定性、跨膜吸收特性等进行进一步研究。鉴于二肽比氨基酸具有更强的吸收特性和生理活性，二肽AQ、SQ和IQ在作为功能食品成分方面具有强大的应用潜力。
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