肉品营养丰富，在加工、贮藏过程中极易遭受微生物污染，发生腐败变质。据统计，全球因微生物污染造成的食品腐败约占总食品损失的三分之一[1-2]。在中国，由微生物引起的肉品腐败损失高达8%[3]，给肉类行业造成巨大的经济损失。其中，假单胞菌是一类需氧的革兰氏阴性细菌，是造成肉品腐败变质的重要原因[4]，主要包括荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)及嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophila)等。添加防腐剂是抑制食品腐败的常用方式之一，目前使用较为广泛的食品防腐剂多为人工合成防腐剂，如苯甲酸盐、山梨酸盐、亚硝酸盐等。人工合成防腐剂具有成本低廉、作用高效便捷等优点，但其潜在安全问题受到广泛关注。研究证实，苯甲酸钠可导致人体发生过敏反应、哮喘和皮肤皮疹等[5]；亚硝酸盐能够在体内转化为强致癌物亚硝胺，制约了其在肉品保鲜中的使用。
近年来，植物精油、溶菌酶、乳酸链球菌素(Nisin)等天然抗菌剂在食品保鲜中的应用受到广泛关注[6]。肉桂精油(cinnamon essential oil，CEO)是从肉桂树皮、树枝或树叶等分离得到的挥发性天然混合物，其主要活性成分包括肉桂醛、反式肉桂醛、α-萜品烯、β-榄香烯等[7]。研究证实CEO能够有效抑制食源性致病菌[8-9]。VAZIRIAN等[10]研究发现CEO能够有效抑制蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的生长，并且对两种菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)均为0.5 μL/mL，最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)均为1 μL/mL。ZHANG等[11]发现，经1.0 mg/mL的CEO处理后，大肠杆菌(Escherichia coli)与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞均发生破损；经测定，CEO对两种细菌的MBC分别为4 mg/mL和2 mg/mL。此外，也有研究发现，CEO能够有效抑制食品中的腐败菌。潘梦诗等[12]发现CEO对黄瓜中醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)和担子菌酵母(Chryseobacterium sp.) 4种优势腐败菌的MIC为0.125～0.5 
等[13]发现CEO对分离自酸奶的20种腐败酵母的MIC为0.31～1.25 μL/mL。然而CEO对肉中腐败菌的抗菌活性及作用机制尚不明确。因此，本文以分离自腐败鸡肉的假单胞菌CM2(Pseudomonas deceptionensis CM2)为研究对象，探究CEO对其抑菌活性及作用机制，以期为CEO在肉品保鲜领域的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
P.deceptionensis CM2菌株分离自腐败鸡肉。
CEO，上海源叶生物科技有限公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、双(1,3-二丁基巴比妥酸)-三甲基乙氧醇[bis(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol,DiBAC4(3)]、EDTA、2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorohydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)和N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine，NPN)，上海麦克林生化科技有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tryptone soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptone soy broth，TSB)，北京奥博星生物技术有限公司；PBS、BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
TGL-16M台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；JSM-700IF场发射扫描电子显微镜(field emission-scanning electron microscope，FE-SEM)，日本JEOL公司；Tecan Spark 20M多功能微孔板读数仪，瑞士Tecan公司；Nano Drop 2000超微量分光光度计，美国Thermo公司；Bioscreen C全自动微生物生长曲线系统，芬兰Oy Growth Curves公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌悬液制备
从甘油保存管中挑取1环P.deceptionensis CM2菌液于TSA培养基中进行活化培养，之后挑取单菌落接种到TSB培养基，于25 ℃、150 r/min摇床恒温振荡培养12 h。所得菌液于8 000 r/min、4 ℃离心4 min，弃去上清液后用PBS清洗菌体2次，离心同上。将所得菌体用PBS重悬后并混匀，制成活菌数约为106～107 CFU/mL的菌悬液，备用。
1.3.2 CEO抑菌效果评价
参考DU等[14]的研究方法，采用微量肉汤稀释法测定CEO对P.deceptionensis CM2的MIC。在100孔细胞培养板的前3排各加入100 μL TSB(第一孔加199 μL TSB)，之后在第一孔各加入1 μL CEO，用移液器吹打(3次以上)使CEO与TSB充分混匀，然后吸取100 μL混合溶液加入第二孔再次吹打混匀，照此添加至第7孔，从第7孔的混和溶液中吸取100 μL弃去；最后在每一孔中加入制备的菌液100 μL并混匀。此时每孔CEO含量从左到右依次为2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 μL/mL。每排的第8孔加入100 μL TSB和100 μL菌悬液作为对照组；将培养板置于全自动生长曲线系统并于25 ℃恒温培养14 h，测定OD600值。选择抑制菌株的最低CEO浓度作为MIC，并选择合适浓度绘制生长曲线。在测定MIC的基础上，从MIC试验中每孔吸取100 μL的培养液，然后均匀涂布到TSA平板并于25 ℃培养24 h。最后观察计数，以无菌落的培养基所对应的最低CEO浓度作为MBC。
1.3.3 菌体形态观察
采用FE-SEM观察CEO对P.deceptionensis CM2菌体形态的影响[15]。菌悬液经CEO(1 MIC)25 ℃处理4 h后，于8 000 r/min离心4 min，弃上清液并用PBS洗涤2次，收集菌体，加入预冷的2.5%(体积分数)戊二醛溶液并于4 ℃固定4 h；离心收集菌体，用PBS洗涤样品3次，离心同上；分别用体积分数为10%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇溶液对样品逐级洗脱10 min，其中100%乙醇溶液洗脱2次；最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次10 min，离心同上，弃上清液并留取微量液体，混匀后滴到载玻片上，自然晾干，采用HVB-GB型真空蒸镀仪喷金150 s，通过JSM-700IF型FE-SEM观察并采集图像。
1.3.4 菌体细胞膜通透性评价
P.deceptionensis CM2菌悬液经终浓度为1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC的CEO处理4 h后，在8 000 r/min和4 ℃条件下离心4 min，收集上清液，采用NanoDrop 2000型超微量分光光度计测定上清液中的核酸含量；用BCA蛋白试剂盒检测上清液中的蛋白含量。
1.3.5 细胞膜完整性评价
分别用1/4 MIC、1/2 MIC及1 MIC的CEO在25 ℃条件下处理P.deceptionensis CM2菌悬液4 h，之后用PBS洗涤2次并重悬。
采用PI评价P.deceptionensis CM2的细胞质膜完整性[16]。向细菌重悬液中加入PI储备液(终浓度为3.0 μmol/L)并于暗处培养15 min，在8 000 r/min和4 ℃条件下离心4 min，收集菌体，用PBS洗涤2次并重悬。然后采用多功能微孔板读数仪测定荧光强度，激发波长为540 nm，发射光波长为630 nm。PI相对荧光强度计算如公式(1)所示：
相对荧光强度
(1)
式中：F1为CEO处理组P.deceptionensis CM2细胞的荧光强度，F0为对照组细胞的荧光强度。
采用NPN荧光探针检测CEO对P.deceptionensis CM2细胞外膜的影响[11]。向细菌重悬液中加入终浓度为0.5 mmol/L的NPN储备液并置于室温暗处避光10 min。采用多功能微孔板读数仪测定荧光强度，激发波长为350 nm，发射波长为408 nm。NPN相对荧光强度按公式(1)计算。
1.3.6 细胞膜电位测定
参照LEE等[17]的试验方法，菌悬液经不同浓度的CEO(1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC)于25 ℃处理4 h后，离心收集菌体，将所得菌体与500 μL(5 μg/mL)DiBAC4(3)储备液和500 μL EDTA溶液(8 mmol/L)混合均匀，置于25 ℃暗处培养15 min，离心弃上清液。菌体用PBS洗涤2次并重悬。采用多功能微孔板读数仪测定样品荧光强度，激发波长为488 nm，发射光波长为525 nm。以未处理的样品为空白对照，结果表示为相对荧光强度。
1.3.7 菌体胞内活性氧水平测定
参考LIU等[18]的方法，采用DCFH-DA检测细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。菌悬液经不同浓度的CEO处理后，离心、洗涤并重悬于PBS(方法同1.3.5)，之后加入终浓度为50 μmol/L的DCFH-DA溶液并于室温暗处培养20 min；离心弃上清液，用PBS洗涤2次并重悬。采用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长为480 nm，发射波长为525 nm。以未处理的样品为空白对照，结果表示为相对荧光强度。
1.3.8 数据处理
所有试验均重复3次，试验结果表示为平均值±标准差。采用Prism软件(Graphpad 8.0)绘图，IBM SPSS 20.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析(ANOVA)中的最小显著差别(least significant difference，LSD)进行显著性分析，P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 CEO对P.deceptionensis CM2生长的影响
采用微量肉汤稀释法测得CEO对P.deceptionensis CM2的MIC为0.156 μL/mL，MBC为0.313 μL/mL。不同浓度CEO对P.deceptionensis CM2生长的影响见图1。
如图1所示，对照组P.deceptionensis CM2培养14 h后，OD600值由初始的0.228升高至0.617；与对照组相比，当CEO浓度为1/4 MIC和1/2 MIC时，P.deceptionensis CM2的OD600值有所下降,培养14 h后其OD600分别为0.473和0.293。当CEO浓度为1 MIC时，菌液OD600值未出现上升趋势，说明终浓度为1 MIC的CEO能够完全抑制P.deceptionensis CM2的生长。综上所述，CEO对P.deceptionensis CM2具有良好的抑制作用，且抗菌作用随其添加浓度的升高而增强。
图1 肉桂精油对P.deceptionensis CM2的杀菌曲线
Fig.1 Time-kill curves of CEO against P.deceptionensis CM2
2.2 CEO对P.deceptionensis CM2细胞形态的影响
通过FE-SEM研究CEO处理对P.deceptionensis CM2细胞形态的影响，结果见图2。
a-对照组；b-1 MIC CEO处理组
图2 肉桂精油对P.deceptionensis CM2细胞形态的影响
Fig.2 Effect of CEO on the morphology of P.deceptionensis CM2 cells
如图2所示，对照组P.deceptionensis CM2细胞形态正常，细胞结构完整，边界清晰，表面光滑。经终浓度为1 MIC的CEO处理4 h后，P.deceptionensis CM2细胞表面褶皱粗糙并且部分出现孔洞和塌陷现象，菌体变形严重，部分细胞表面有附着物堆积，这可能与胞内物质泄露有关[19]。以上结果与陈雪琴等[8]的研究相同。FE-SEM结果表明，CEO能够破坏P.deceptionensis CM2细胞结构，这可能是其失活P.deceptionensis CM2的重要机制之一。
2.3 CEO对P.deceptionensis CM2细胞膜通透性的影响
正常情况下，细菌的细胞膜具有一定的通透性，从而使细胞内外物质处于平衡状态[20]。通过测定胞外核酸和蛋白释放量评价CEO对P.deceptionensis CM2细胞膜通透性的影响，结果见图3。
a-核酸；b-蛋白
图3 不同浓度肉桂精油处理后P.deceptionensis CM2胞内 核酸与蛋白的泄漏量
Fig.3 Leakage of nucleic acids and proteins from P.deceptionensisCM2 cells treated with CEO at different concentrations
注：不同字母表示差异差异显著(P<0.05)(下同)
如图3所示，对照组P.deceptionensis CM2胞外核酸与蛋白含量分别为6.87 μg/mL和25.65 μg/mL。与对照组相比，P.deceptionensis CM2胞外核酸和蛋白含量随CEO添加浓度的增加而显著升高。经终浓度为1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC的CEO处理4 h后，P.deceptionensis CM2胞外核酸含量分别升高了9.5、10.9和13.5倍(P<0.05)；胞外蛋白含量分别升高了2.5、3.4和4.7倍(P<0.05)。研究结果同BOUYAHYA等[21]的研究相一致。因此，CEO能够破坏P.deceptionensis CM2细胞的完整性，导致细胞膜通透性增加，使蛋白质、核酸等胞内物质释放到胞外而造成细菌死亡。
2.4 CEO对P.deceptionensis CM2细胞膜完整性的影响
细胞膜完整性对于维持细胞正常生命代谢活动具有重要意义[22]。P.deceptionensis CM2属于革兰氏阴性菌，由细胞质膜、细胞外膜等组成。PI是一种疏水性核酸染料，只能进入细胞质膜发生损伤的细胞并与核酸结合后产生红色荧光[23]；NPN是一种疏水性荧光探针，在水溶液中只能发出微弱的荧光，然而当细胞外膜结构遭到破坏时，NPN可以进入疏水性的外膜内部磷脂层，造成其荧光强度增强[24]。分别采用PI和NPN荧光探针研究CEO对P.deceptionensis CM2细胞内膜和外膜完整性的影响，结果见图4。
a-内膜；b-外膜
图4 不同浓度肉桂精油对P.deceptionensis CM2细胞膜完整性的影响
Fig.4 The membranes integrity of P.deceptionensis CM2 cells treated with CEO at different concentrations
由图4-a可知，CEO处理组P.deceptionensis CM2细胞中PI相对荧光强度随其处理浓度的升高而显著增强。与对照组细胞相比，经终浓度为1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC的CEO处理4 h后，P.deceptionensis CM2细胞中PI相对荧光强度分别升高了8.0%、19.1%和32.6%(P<0.05)。上述结果与ZHAN等[25]的研究相一致。如图4-b所示，P.deceptionensis CM2细胞中NPN相对荧光强度随CEO处理浓度的升高而逐渐增强。经终浓度为1/4 MIC、1/2 MIC 和1 MIC的CEO处理4 h后，P.deceptionensis CM2细胞中NPN相对荧光强度分别升高了11.4%、39.4%和51.9%(P<0.05)。综上所述，CEO破坏了P.deceptionensis CM2细胞质膜和外膜，导致细胞膜渗透性增强并影响细胞正常生长代谢，从而造成细胞死亡。
2.5 CEO对P.deceptionensis CM2膜电位的影响
细胞膜电位是由细胞膜两侧不同浓度的离子产生的电位差，参与细胞增殖、代谢和能量产生等重要生理活动[26]。DiBAC4(3)是一种检测细胞膜电位的亲脂性阴离子荧光染料。当细菌细胞膜发生去极化时，DiBAC4(3)可以进入细胞并与胞浆内的蛋白质结合，从而使其荧光增强[27]。采用DiBAC4(3)研究不同浓度CEO对P.deceptionensis CM2细胞膜电位的影响，结果见图5。
图5 不同浓度肉桂精油处理后P.deceptionensis CM2细胞膜电位的变化
Fig.5 Changes in the membrane potential of P.deceptionensis CM2 cells treated with CEO at different concentrations
如图5所示，与对照组相比，P.deceptionensis CM2细胞中DiBAC4(3)荧光强度随着CEO处理浓度的升高而增强。经终浓度为1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC 的CEO于25 ℃处理4 h后，P.deceptionensis CM2细胞中DiBAC4(3)荧光强度分别升高了0.5、1.1和2.8倍(P<0.05)。以上结果与李欣越等[28]的研究相一致。综上所述，CEO能够造成P.deceptionensis CM2细胞膜电位发生去极化，导致细胞代谢异常，从而影响菌体正常生长。
2.6 CEO对P.deceptionensis CM2细胞活性氧水平的影响
ROS是细胞在正常有氧代谢过程中产生的一类分子氧衍生物，参与细胞信号传导并维持细胞的正常生理活性。然而，ROS过度积累会造成胞内脂类、蛋白质和DNA等生物分子发生氧化损伤，进而影响细胞正常生理代谢活动[29]。DCFH-DA是一种用于检测细胞内ROS的探针。进入细胞后，DCFH-DA能够被胞内酯酶水解生成2′,7′-二氯二氢荧光素(dichlorodihydrofluorescein，DCFH)，DCFH能够被胞内ROS氧化并生成强荧光产物2′,7′-二氯荧光素(2′,7′-dichlorofluorescein，DCF)。采用DCFH-DA探针检测CEO对P.deceptionensis CM2胞内ROS水平的影响，结果见图6。
图6 不同浓度肉桂精油处理后P.deceptionensis CM2细胞内ROS水平
Fig.6 The intracellular ROS levels of P.deceptionensis CM2 cells after OEO treatment at different concentrations
如图6所示，P.deceptionensis CM2胞内ROS水平随CEO处理浓度增大而逐渐升高。与对照组相比，经终浓度为1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC的CEO于25 ℃处理4 h后，P.deceptionensis CM2胞内ROS水平分别升高了12.9%、31.5%和45.0%(P<0.05)，这与YANG等[30]的研究结果相一致。以上结果表明，CEO可导致P.deceptionensis CM2胞内ROS水平升高，并引发氧化应激反应。但CEO诱导P.deceptionensis CM2胞内ROS升高的分子机制尚不明确，仍有待深入研究。
3 结论
综上所述，CEO对分离自腐败鸡肉的P.deceptionensis CM2具有良好的抑制效果，且抑制效果随其添加浓度的升高而增强。经终浓度为1 MIC的CEO处理4 h后，P.deceptionensis CM2细胞膜通透性增强、细胞质膜和外膜被破坏、细胞膜发生去极化,胞内ROS水平升高，这可能是CEO失活P.deceptionensis CM2的主要机制之一。在今后的研究中，应进一步综合运用代谢组学、转录组学、蛋白质组学等方法系统阐明CEO失活微生物的分子机制；此外还应系统评价其对肉制品、鲜切果蔬等表面微生物的抑制作用及对食品营养和感官品质的影响，以推动CEO在食品保鲜领域的实际应用。
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