冷鲜肉是将畜禽肉屠宰加工后，胴体进行低温冷却，使肉温迅速达到0～4 ℃，并在低温下进行排酸、贮存、运输和销售的生鲜肉[1]。新疆羊肉产业是畜牧业发展的主导产业、也是特色优势产业之一，2019年新疆羊肉产量达170.75万t，仅次于内蒙古位居全国第二[2]。新疆地处偏远，羊肉主要以冷冻肉的形式销往疆外，但冷冻肉的品质难以在当地的生鲜肉市场竞争中占据优势。随着消费水平的提高，冷鲜肉将成为未来发展趋势，在其生产过程中，微生物是影响肉品质及货架期的主要因素[3]。而冷鲜肉在加工过程中又不可避免的接触工作人员、空气、设备及环境中的微生物，当微生物达到一定数量级且外界条件适宜时，其肉质会发生劣变甚至腐败，最终失去食用价值。冷鲜肉变质一方面是由于冷链运输中可能发生温度波动而导致微生物活动加剧；另一方面冷鲜肉在生产过程中不可避免的受到微生物的污染，导致冷鲜肉在出厂时就携带一定数量的微生物，当受到外界条件影响时，优势腐败菌迅速生长繁殖，加快了冷鲜肉的变质。
加工食品中的真菌繁殖通常不是食品安全问题，但会导致产品易腐烂和召回，造成整个供应链的浪费和损失[4]，同时真菌在空气中的传播范围往往比细菌更广，一些腐败酵母也能够导致肉制品发生腐败变质，所以对屠宰场中真菌的分布和污染情况也不可忽视。单分子实时测序(single molecule real time sequencing, SMRT)又被称为第三代测序，克服了二代测序的缺陷，最大可达40 kbp的超长读序，可以完全覆盖真菌ITS序列全长区域[5]。本文主要采用第三代高通量测序技术对冷鲜羊肉屠宰加工过程中各个环节真菌多样性、分布及交叉污染情况进行分析，旨在通过检测屠宰场内真菌分布情况，分析冷鲜肉污染的途径及原因，为企业防治屠宰加工生产线真菌性交叉污染提供参考。
1 材料与方法
1.1 样品
对新疆伊犁地区肉羊屠宰厂的加工环境、器具、工人的卫生及屠宰的羊胴体等方面进行微生物采集。随机选取3个不同屠宰批次，每个批次选取3只羊(共9只羊)，现有研究表明[6]在不破坏取样对象的条件下，海绵已被证明是一种合适的胴体取样方法，使用5 cm×5 cm×1 cm无菌聚氨酯海绵在10 cm×10 cm的取样器中对目标物表面100 cm2的区域进行垂直、水平和对角摩擦5次(来回算1次)，取样后放入含有100 mL无菌、pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液的无菌采样袋4 ℃保存，采样完成后使用均质拍拍打1 min混匀均质袋，充分挤压海绵水分后过0.45 μm滤膜，滤膜使用无菌EP管保存于-20 ℃用于后续真菌多样性分析。分类1：DT1(胴体)、TZQ2(屠宰区)、QJ3(器具)、GZRY4(工作人员)、HJ5(环境)；分类2：TZJ1(屠宰间)、PSJ2(排酸间)、FGJ3(分割间)，具体采样信息如表1所示。
表1 样品来源及分类
Table 1 Sample source and classification
序号样品名称取样位置编号分类1分类21234羊进栅栏羊胴体排酸后分割肉背部胸部臀部A1DT1TZJ1A2DT1TZJ1A3DT1PSJ2A4DT1FGJ3567待宰区传送带区操作区护栏、放血槽传送链操作台B1TZQ2TZJ1B2TZQ2TZJ1B3TZQ2TZJ18冲洗废水渠B4TZQ2TZJ191011屠宰间刀具分割间刀具分割案板放血、去头蹄、剥皮、去内脏、修整、去骨、分割C1QJ3TZJ1C2QJ3FGJ3C3QJ3FGJ312131415工作人员手(屠宰间)工作人员手(分割间)工作人员裙(屠宰间)工作人员裙(分割间)放血、去头蹄、剥皮、去内脏、修整、冲洗、去骨、分割D1GZRY4TZJ1D2GZRY4FGJ3D3GZRY4TZJ1D4GZRY4FGJ3161718屠宰间环境排酸间环境分割间环境墙壁地面下水道E1HJ5TZJ1E2HJ5PSJ2E3HJ5FGJ3
1.2 材料与试剂
pH 7.0氯化钠蛋白胨，青岛海博生物技术有限公司；0.45 μm滤膜，杭州特种纸业有限公司；TGuide S96磁珠法基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；KOD OneTM PCR Master Mix Blue、KOD FX Neo(TOYOBO)，北京百灵克生物科技有限责任公司；VnF(10 μmol/L)、VnR(10 μmol/L)，苏州泓迅生物科技股份有限公司；低分子质量范围琼脂糖，北京诺驰源生物科技有限公司；Monarch DNA Gel Extractionn，北京鸿跃创新科技有限公司；EB(红色荧光核酸染料)，青岛拓邦生物科技有限公司；Tris base、EDTA二钠、TE缓冲液(pH 8.0)，北京博美富鑫科技有限公司；VAHTSTM DNA Clean Beads，南京诺唯赞生物科技有限公司；ExKubit dsDNA HS Assay Kit，上海吉泰依科赛生物科技有限公司；SMRTbell Template Prep Kit、PacBio Binding kit、Primer、Polymerase、AMpure PB Beads，Pacbio美国。
1.3 仪器与设备
BC/BD-629HK -20 ℃度冰箱，青岛海尔特种电冰柜有限公司；B-028604抽滤瓶，垒固仪器有限公司；vortex-2G560E涡旋振荡器，Scientific Industries；JY5002电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；OSE-MC8瞬时离心机，天根生化科技有限公司；veriti 96-well 9902梯度基因扩增仪，Appliedbiosystems；3-16P 24孔离心机，Sartorius；BE-1100四维旋转混匀仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DynaMag96Side skirted磁力架，赛默飞世尔；YXQ-LS-30SII压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Sequel Ⅱ高通量测序仪，Pacbio美国。
1.4 实验方法
1.4.1 真菌DNA提取及PCR扩增
使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒提取DNA，使用微量紫外分光光度计对提取的DNA进行质量检验，质量浓度大于20 ng/μL、OD260/OD280值为1.8～2.0，提取的DNA于-20 ℃保存。
使用通用引物ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′对ITS全长进行扩增[7]。PCR反应体系为1.5 μL基因组DNA，11.7 μL 无核酸酶水，15 μL KOD One PCR Master Mix，上下游引物各1.8 μL，总体系30 μL。反应程序如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，8个循环后，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，24个循环后，72 ℃最终延伸5 min。
1.4.2 文库构建及测序
样后切胶前使用VAHTSTM DNA Clean Beads磁珠纯化；切胶后使用Monarch DNA胶回收试剂盒纯化回收，结合部分产物Qubit值，并结合电泳胶图进行手动调节。对于构建好的文库使用PacBio公司提供的建库试剂盒(SMRTbell Template Prep Kit)对混合产物进行损伤修复、末端修复及连接接头，反应过程在PCR仪器上进行，使用AMpure PB磁珠纯化回收从而得到上机文库；最终文库通过浓度(Qubit)及大小(Agilent 2100)的检测，总量需要大于Smrtlink计算值。使用PacBio Binding kit(Pacbio，USA)对上机文库进行上机前的结合，使文库结合上Primer(Pacbio，USA)及Polymerase(Pacbio，USA)；将最终的反应产物进行AMpure PB Beads(Pacbio，USA)纯化后置于Sequel Ⅱ(Pacbio，USA)测序仪上进行上机测序。
1.4.3 生物信息学分析
(1)数据质控：原始数据下机使用SMRT Link v10.2软件对CCS(circular consensus sequencing)长度进行过滤，丢弃不满足长度阈值的序列(ITS：300 bp～1 000 bp)，最后通过使用USEARCH[8](version 11)对双端reads进行拼接并去除嵌合体(UCHIME[9]，version 8.1)，得到高质量的CCS序列。(2)操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)聚类：使用USEARCH在相似性97%的水平上对序列进行聚类，默认以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTUs[10]。(3)物种注释：Silva(Release 138)[11]，Greengenes(Release 13.5)[12]和Unite(Release 8.0)[13]数据库对OTU代表性序列进行同源性比对，确定各OTU的最终注释结果。使用QIIME2中classify-consensus-blast将特性序列与参考数据库比对，不能精确比对参考数据库的使用QIIME2中classify-sklearn分类器分类，最终获得各OTU在门、纲、目、科、属和种水平上真菌分类信息及占比。(4)多样性分析：使用QIIME2软件计算Chao1、ACE、Shannon、Simpson等指数用于评估样品的Alpha多样性。基于bray curtis算法进行主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)呈现物种Beta多样性。
1.5 数据处理
采用Anosim分析检验Beta多样性差异，R值越小则表示组间和组内没有明显差异，P<0.05表示检验可信度高。采用ANOVA进行LSD差异分析(P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著)。使用SPSS 27.0 和R语言等软件对结果进行分析和可视化处理。
2 结果与分析
2.1 样品中真菌的4序列质量评估及Alpha多样性分析
18个样品真菌测序后通过Barcode识别共获得404 013条CCS序列，每个样品至少产生22 261条CCS序列，平均有效CCS率为95.14%。使用Usearch软件对Reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，共获得479个具有代表性的OTU。VENN图可以表明各样品组间共有、特有OTU数目，直观地展示样品组间特征的重合情况[14]。如图1所示，两种不同分类下真菌各组OTU之间的关系，从分类1可知，5组间共有OTU数目为115个，仅占总OTU的24.00%，除DT1中无特有OTU，其余分组均存在特有OTU，其中TZQ2及QJ3中特有OTU数目较多，分别为73、35个，除DT1和HJ5之间无共有OTU之外，其余组间均存在共有OTU。从分类2可知，3组间共有OTU数目为101个，仅占总OTU的21.09%，TZJ1特有OTU数目为173个，FGJ3特有OTU数目为30个，而PSJ2无特有OTU。
a-分类1；b-分类2
图1 样品中真菌OTUs VENN图
Fig.1 VENN plot of fungal OTUs in samples
由表2可知，Coverage指数均大于0.99，说明测序结果可以反映微生物的真实情况[15]。B4样品的Simpson、Shannon、PD_whole_tree指数最高，说明B4表面真菌物种数最多且多样性最高。分析可能是由于水渠汇集了屠宰间长期清洗排放的废水，其中携带丰富的真菌，在排放过程中附着在管壁并定殖。C3样品的ACE、Chao1、PD_whole_tree指数最低，说明C3表面真菌多样性最低。在长期分割羊肉的过程中一些碎屑残存于分割案板粗糙的孔隙中难以彻底清除，这些营养物质成为微生物的养料，大量繁殖后成为优势菌群，可能致使真菌多样性降低。由分类1可知，TZQ2的ACE、Chao1、Simpson、Shannon、PD_whole_tree平均指数最高，说明屠宰区真菌物种数最多且多样性最高，HJ5的ACE、Chao1、PD_whole_tree平均指数最低，说明环境中真菌物种数最少且多样性最低；由分类2可知，TZJ1的ACE、Chao1、Shannon、PD_whole_tree平均指数最高，说明屠宰间中真菌物种数最多且多样性最高，FGJ3的ACE、Chao1、PD_whole_tree平均指数最低，说明分割间中真菌物种数最少且多样性最低。
表2 样品中真菌Alpha多样性指数
Table 2 Alpha diversity index of fungi in samples
样品名称OTUsACEChao1SimpsonShannonPD_whole_treeCoverageA1213258.39272.630.853.7333.950.99A2149190.23192.130.361.4828.650.99A3145176.81182.000.803.4125.170.99A4133155.03150.550.813.3524.650.99B1233252.51279.430.945.5537.070.99B2211233.78240.080.884.7435.980.99B3151175.72184.830.793.3526.250.99B4219225.64228.430.976.1138.260.99C1195243.53270.000.935.1632.490.99C2137152.50156.430.924.6726.010.99C390102.39105.000.682.6817.830.99D1123179.87196.500.622.1720.640.99D2125144.48146.000.904.1521.300.99D3116202.91174.240.481.8421.260.99D4137150.36152.300.823.6626.290.99E1146179.00183.000.662.7321.600.99E2107113.57112.500.863.6010.800.99E3102127.09127.090.602.6212.250.99
由图2-a可知随着测序量增加，发现的物种增多，A1的稀释性曲线还未趋于平稳，其余所有样品的稀释性曲线均已趋于平稳。所有样品Shannon指数曲线均已趋于平稳(图2-b)。由图2-c可知除C3、D1、D3、E3的等级丰度曲线较窄且陡峭外，其余样品的曲线都较宽且平坦，物种组成丰度及均匀度较高。如图2-d所示，红色箱线为物种累积曲线，绿色箱线为新物种共有量曲线，随着测序样品数量的增多，红、绿箱形逐渐趋于平缓，说明样品中的物种丰度及共有物种趋于饱和，当前测序数据量及深度均已满足生物信息学分析条件。
2.2 样品中真菌群落结构分析
将低丰度特征过滤后得到样品中各等级的注释物种数，95.57%的OTU可以注释到属，76.14%的OTU可以注释到种，共检测出8门、28纲、58目、109科、200属、269种。结果如表3所示，其中B1表面物种丰富度最高，共检测出164种真菌，C3表面物种丰富度最低，共检测出59种真菌；由分类1可知，TZQ2物种丰富度最高，平均种水平物种数达133种，HJ5物种丰富度最低，平均种水平物种数为84种；由分类2可知，TZJ1物种丰富度最高，平均种水平物种数达116种，FGJ3物种丰富度最低，平均种水平物种数为80种，与OTUs分析、Alpha多样性分析结果一致。
a-物种等级稀释性曲线；b-Shannon指数曲线；c-等级丰度曲线；d-物种累积曲线
图2 真菌Alpha多样性指数
Fig.2 Alpha diversity index of fungi
2.2.1 物种分布柱状图
如图3-a所示，所有样品在门水平上物种丰度基本相似，主要包括子囊菌门(Ascomycota, 61.15%)和担子菌门(Basidiomycota, 35.02%)，这两个门占所有真菌的96.17%，其余门除新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)平均占比2.24%之外，剩余占比均不足1%，分别是罗兹菌门(Rozellomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、毛霉门(Mucoromycota)。又分类1(图3-b)可知，子囊菌门(64.89%)在GZRY4表面相对占比最高，担子菌门(45.13%)在QJ3表面相对占比最高。由分类2可知(图3-c)，子囊菌门(67.83%)在TZJ1表面相对占比最高，担子菌门(45.31%)在FGJ3表面相对占比最高。
如图4-a所示，所有样品在属水平上物种丰度差异较大，但整体上的优势菌属分别为德巴利氏酵母属(Debaryomyces, 26.77%)、红酵母属(Rhodotorula, 9.15%)、枝孢属(Cladosporium, 8.34%)、线黑粉酵母属(Filobasidium, 8.27%)、毛孢子菌属(Cutaneotrichosporon, 7.82%)、Cleistothelebolus(6.16%)、Kurtzmaniella(6.04%)、担子菌酵母属(Naganishia, 2.78%)、链格孢属(Alternaria, 2.54%)、维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma, 1.59%)，10个属相对丰度约占整体真菌的79.46%。由分类1可知(图4-b)，德巴利氏酵母属(43.97%)在GZRY4表面相对占比最高，红酵母属(24.69%)及Kurtzmaniella(11.24%)在QJ3中相对占比最高，枝孢属(12.07%)在DT1表面相对占比最高，毛孢子菌属(16.77%)及Cleistothelebolus(29.42%)在HJ5表面相对占比最高，线黑粉酵母属(14.87%)在TZQ2表面相对占比最高。从分类2可知(图4-c)，德巴利氏酵母属(34.10%)及线黑粉酵母属(11.38%)在TZJ1中相对占比最高，毛孢子菌属(14.79%)及枝孢属(15.18%)在PSJ2中相对占比最高，红酵母属(21.38%)及Cleistothelebolus(13.85%)在FGJ3中相对占比最高。从整体看德巴利氏酵母属是相对丰度较高的优势菌属。
表3 样品中真菌的物种注释
Table 3 Species annotation of fungi in samples
样品界门纲目科属种A117203967114142A21820355483104A3161631456996A4171530396986B118224371123164B217204464104131B3171832507599B418214369105139C11821406293123C2161627486582C3161222354959D1161530426785D2151427426692D3171729395976D4171832466889E1161331497899E2161429406078E3151427405976总数182858109200269
a-所有样品；b-分类1；c-分类2
图3 样品中真菌的门水平堆积柱状图
Fig.3 Stacked column chart of fungi in samples at phylum level
a-所有样品；b-分类1；c-分类2
图4 样品中真菌的属水平堆积柱状图
Fig.4 Stacked column chart of fungi in samples at genus level
如图5-a所示，所有样品在种水平上物种丰度占比差异较大，从平均相对丰度来看优势菌种为德巴利氏酵母菌(D.subglobosus, 26.77%)、Cleistothelebolus nipigonensis(6.16%)、嗜油念珠菌(Candida oleophila, 6.04%)、线黑粉酵母菌(F.magnum, 4.18%)、毛孢子菌(C.cyanovorans, 4.08%)、线黑粉酵母菌(F.uniguttulatum, 3.22%)、担子菌酵母菌(N.albida, 2.78%)、链格孢菌(A.alstroemeriae，2.19%)、枝孢菌(C.puyae, 2.11%)、枝孢菌(C.colombiae, 2.02%)等。由分类1可知(图5-b)，德巴利氏酵母菌(43.97%)及毛孢子菌(11.69%)在GZRY4表面相对丰度最高，Cleistothelebolus nipigonensis(6.16%)在HJ5中相对丰度最高，嗜油念珠菌(11.24%)在QJ3表面相对丰度最高，线黑粉酵母菌(7.98%)在TZQ2表面相对丰度最高，担子菌酵母菌(6.33%)在DT1表面相对丰度最高。从分类2可知(图5-c)，德巴利氏酵母菌(34.10%)在TZJ1中相对丰度最高，枝孢菌(11.00%)在PSJ2中相对丰度最高，Cleistothelebolus nipigonensis(13.85%)在FGJ3中相对丰度最高。
a-所有样品；b-分类1；c-分类2
图5 样品中真菌的种水平堆积柱状图
Fig.5 Stacked column chart of fungi in samples at species level
2.2.2 物种丰度聚类热图
从图6可以看出C2和C3的20个真菌属丰度相似度较高，D2和E2的15个属丰度相似度较高，A1和C1的24个属丰度相似度较高。由分类1可知，组内各样品间群落丰度相似度较低；由分类2可知，TZJ1组内各样品间群落丰度相似度较高。
图6 真菌属水平丰度聚类热图
Fig.6 Abundance cluster heatmap of fungi at the genus level
2.3 样品中真菌的Beta多样性分析
由于ITS系统发育信息不完善，无法使用基于系统发生树的计算方法(Unweighted Unifrac和Weighted Unifrac)。真菌Beta多样性分析主要采用bray curtis(加权)算法，此算法仅基于样品所包含的序列特征比较物种差异(即基于OTU进行比较)，该算法认为各OTU序列之间是相互独立的不存在进化关系(各OTU间关系平等)[16]。
由图7-a可知，基于bray curtis(加权)的PCoA中PC1和PC2的贡献率分别为27.32%和22.04%，在考虑物种丰度的情况下所有样品的物种丰度及相似度差异较大(R=0.681，P<0.05)，A1和B1样品间的真菌相似度较高，二者间存在交叉污染，待宰羊倒挂传送链后会不断挣扎，未倒挂待宰羊受到惊吓乱跑或成群挤靠在角落，导致羊毛上的真菌大量传播到空气中和围栏表面。A2和D1的距离较近，物种丰度及相似度较高，工作人员手和胴体间存在交叉污染。A3、A4、B3、C2、C3、D2、D4及E1物种丰度及相似度较高，说明真菌在羊屠宰过程中与操作区及屠宰环境发生交叉污染。胴体携带真菌进入排酸间，继而在分割过程中污染分割案板、刀具及工作人员，在分割过程中，工作人员会将分割后的大块带骨肉搬运到案板上进行进一步分割，此过程中分割肉成为围裙与案板交叉污染的传播媒介。E2和E3的距离较近，物种丰度及相似度较高，二者间存在交叉污染。
由分类1可知，DT1中A3和A4的距离较近，物种丰度及相似度较高，A2的物种丰度及相似度与A3、A4不同，分析可能是由于胴体清洗破坏群落结构，尚未形成稳定的群落结构。其余各组内样品间距离均较为分散，组间和组内差异较小(R=0.284，P<0.05)。由分类2可知，TZJ1的样品都聚集在一、二象限，PSJ2及FGJ3的样品都聚集在第三、四象限，说明各组内的样品存在一定的物种丰度及相似度，但组间和组内差异较小(R=0.291，P<0.05)。
a-基于bray curtis的PCoA；b-所有样品的Anosim分析；c-分类1的Anosim分析；d-分类2的Anosim分析
图7 PCoA及Anosim分析
Fig.7 PCoA and Anosim analysis
3 讨论
真菌通常通过被污染的食品原料进入车间，很容易通过空气扩散，并附着在新鲜制作的食品表面，当生长条件适宜时形成菌落，将更多的真菌繁殖体释放到环境中[17]。屠宰区运作时人员流动频繁，羊毛表面的真菌孢子可能会随空气流动散落在设备、器具、环境及工作人员身上，随后污染整个车间。OTU及Alpha多样性分析也可以看出，从屠宰间到分割间，真菌的物种丰富度逐渐降低，说明羊皮可能是真菌的污染源。
子囊菌门和担子菌门水平的真菌广泛的存在于环境中，食品如酒糟鱼[18]、腊肉[19]等肉制品中均有检出。戴宝玲等[20]通过高通量测序技术分析了不同屠宰环节鸡肉表面的真菌结构，结果表明担子菌门真菌占比超过69%，所有屠宰环节鸡肉表面真菌多样性无显著性差异。有研究表明[21]，羊瘤胃中存在大量子囊菌门、担子菌门的真菌。受屠宰人员专业技术熟练度的影响，去除内脏环节可能存在划破羊胃肠道的风险，其中携带的大量微生物会污染刀具和地板。酵母和丝状真菌常在食品加工基础设施内分布和交叉污染[4]，枝孢属菌广泛存在于空气当中，每立方米的空气中均可检测到[22]。德巴利菌属、红酵母属、嗜油念珠菌属和毛孢菌属是鲜肉中最常见的分离菌属[23]，也是新鲜乳制品(新鲜奶酪、奶油和酸奶)和热处理食品中的常见腐败菌[24]。杨攀等[25]对腐败干酪中真菌的群落结构进行了分析，德巴利菌属占比为20%～40%。杜莹等[26]也从腐败的酸奶中分离鉴定出红酵母和根霉菌。种水平群落结构中的嗜油念珠酵母菌常作为果蔬采后病害生物防治拮抗菌[27]；线黑粉酵母菌在北方土壤中分布广泛[28]；产油担子酵母菌可利用农业和工业废物中的木质纤维素水解产物、复合糖和脂肪酸等多种碳源发酵生产脂质[29]；Alternaria alstroemeriae属于植物病原体，可引起植物黑斑病[30]。
微生物从皮毛和环境转移到肉表面的过程是不可避免的，通过PCoA可知，D1和A2间存在交叉污染，屠宰刀具原则上应遵循一刀一消毒，而屠宰工作人员手的消毒常被忽略，GB 15979—2002《一次性使用卫生用品卫生标准》中规定工作人员手表面菌落总数不得>300 CFU/只。A3、A4、C2、D2、D4之间存在交叉污染，这与于小乔[31]的研究结果一致，这种交叉污染的现象是由于企业自身加工过程卫生控制监管不足造成的，分割间工作人员的手及刀具没有按照企业的规定按时清洗或清洗不彻底，刀具在使用一段时间后表面黏附残留的污物，为微生物的生长提供了营养物质，刀具的消毒工作是影响产品卫生质量的重要因素之一[32]。清洗消毒期间由于飞溅和过度喷洒造成的污染是腐败酵母传播的主要机制。地漏中经常会培养出高水平的酵母菌，用于清洁的高压喷雾会将污染物溅到加工设备上[4]。E2和E3间存在交叉污染，可能是由于热水清洁过程中水蒸气导致微生物活动加剧。水是另一种可以在车间内传播真菌繁殖体的介质，与空气相比，酵母的交叉污染常与水相关。酵母虽不主要通过空气传播，但可能通过气溶胶携带并流动传播。酵母菌会导致食品和饮料的腐败，特别是在发酵食品的变质中发挥着重要作用[17]。
4 结论
本研究采用第三代高通量测序对冷鲜羊肉屠宰加工车间环境、工作人员及设备器具表面真菌多样性、分布及交叉污染情况进行分析。主要结论如下：(1)高通量测序结果共鉴定出8门、28纲、58目、109科、200属、269种，其中门水平优势菌为子囊菌门(Ascomycota)，属水平为德巴利氏酵母属(Debaryomyces)，种水平为德巴利氏酵母菌(D.subglobosus)。(2)Alpha多样性分析表明屠宰间真菌丰度及多样性高于分割间(P<0.01)，与排酸间无显著差异(P=0.12)。(3)Beta多样性分析显示羊进栅栏(A1)和待宰区(B1)存在交叉污染，排酸后胴体(A3)、分割肉(A4)、操作区(B3)、分割间刀具(C2)、分割案板(C3)、分割间工作人员手(D2)、分割间工作人员裙(D4)及屠宰间环境(E1)间存在交叉污染，排酸间环境(E2)和分割间环境(E3)间存在交叉污染。综合分析，羊皮及胴体是引起真菌性交叉污染的主要传播媒介。
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