腐乳作为中国传统的发酵豆制品，入口鲜香，质地细滑松软，口感醇厚，风味独特，回味有淡淡的酒香，咸淡适中，让人欲罢不能，且营养丰富品种多样，又被誉为“东方奶酪”[1-2]。腐乳的制作工艺包括泡豆、磨浆、点浆、接种培菌、腌坯、加汤汁辅料发酵等[3]。其发酵过程分为前发酵和后发酵，前发酵是接种毛霉菌等制成毛坯和菌种生长积累酶系的过程；后发酵添加食盐、酒精等，并利用毛坯中微生物分泌蛋白酶降解大豆蛋白产生的大量游离氨基酸等[4]。腐乳中同时富含大豆异黄酮、B族维生素等功能物质，具有降胆固醇，抗氧化、抗疲劳等多种营养作用，深受消费者喜爱[5]。
目前腐乳方面的研究主要集中在挥发性风味物质检测[6-8]、发酵体系菌群结构分析及菌种筛选[9-10]、发酵体系菌群与风味之间的相关性[11]、腐乳安全性研究等方面[12-13]。而对腐乳发酵原料及相应的风味影响的研究较少[14-16]，主要研究了大豆对发酵质量的影响[14-15]，对酒的种类或香型对其发酵腐乳的风味影响的研究较少。腐乳通常是通过添加10%～20%的酒来制备的，这是保存所必需的。作为后发酵的必须原料，它不仅可以抑制杂菌的生长繁殖，其用量的多少、品质的好坏会对腐乳风味造成直接影响。白酒酿造工艺丰富多彩，不同香型白酒的独特工艺，赋予了白酒错综复杂的香味成分[17]。其丰富的营养组分有的直接给予腐乳风味，有的又是腐乳香气的重要组成——酯类的前驱物质，能促进腐乳香气的形成[18]。因此不同香型白酒酿造的腐乳风味特征差异值得研究。
本研究以我国主要的6种不同香型白酒为原料，利用感官评分结合全二维气相色谱-质谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry, GC-GC-MS)分析不同白酒发酵得到的腐乳的风味特征和成分差异。旨在为高品质腐乳的生产提供白酒原料的筛选依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
6种白酒样品，超市，具体信息如表1所示;2-甲基-3-庚酮(标准品)，西格玛奥德里奇贸易有限公司；C7～C25正构烷烃，雪景电子科技(上海)有限公司；甲醇(色谱纯)、正己烷(分析纯)，成都科龙化工试剂厂。
表1 六种白酒信息表
Table 1 Contains information about six different types of liquor
样品香型配料表酒精度(乙醇体积分数)/%等级Q1浓香型高粱、小麦、水53优级Q2酱香型水、高粱、大米、小麦52优级Q3清香型水、高粱、大麦、豌豆53优级Q4 老白干型水、高粱、小麦52一级Q5凤香型水、高粱、大麦、小麦、豌豆52优级Q6米香型水、大米、小曲55优级
1.2 仪器与设备
固相微萃取器手柄、DVB/CAR/PDMS萃取头(75 μm)，上海安谱实验科技股份有限公司；GCMS 2020 NX气相色谱-质谱仪，日本岛津公司；全二维气相色谱固态热调制器，雪景电子科技(上海)有限公司；DK-98电热水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 腐乳酿造
参考张钰清[19]的制作方法，稍作修改，将培养好毛坯撮毛称重后直接装瓶，分别加入不同香型Q1～Q6白酒配制的汤汁至完全浸泡毛坯后加盖密封，在25～30 ℃下后发酵180 d得到S1～S6腐乳。汤汁中，食盐质量浓度200 g/L，酒精度15%(乙醇体积分数)。
1.3.2 测定方法
1.3.2.1 样品感官测定方法及标准
选用30人(15男15女)成立感官评定小组进行感官评价。腐乳的感官指标主要从色泽、香气、滋味、组织形态4个方面考虑，每个指标满分8分。感官要求和评价标准见表2，参考SB/T 10170—2007《腐乳》，评分越高，总体越好。
表2 腐乳感官品质评定标准
Table 2 Standard for evaluation of sensory quality of sufu
项目感官要求评分标准分值/分色泽(8分)呈乳黄色或黄褐色,表里色泽基本一致乳黄色、表面颜色基本一致表面颜色不纯正内部颜色不纯正5～83～50～3香气(8分)具有腐乳特有香味无异味香气纯正、腐乳特有味道香气不明显香气不正确有异味5～83～50～3滋味(8分)滋味鲜美,咸淡适口鲜美、咸味适口、厚味悠长口味太咸或太淡味道不明显有异味5～83～50～3组织形态(8分)块型整齐,质地细腻块型整齐一致,剖面平滑、口感细腻块型不整齐、破皮、剖面较平滑块型破碎、剖面粗糙、口感粗糙5～83～50～3
1.3.2.2 腐乳气味的全二维气相色谱-质谱检测
样品准备：取5 g样品，加1 μL内标(8.16 mg/mL的2-甲基-3-庚酮)。水浴温度60 ℃，时间20 min，萃取30 min[20]。
色谱条件：进样口温度240 ℃不分流；一维色谱柱DB-Wax(36.4 m×0.25 mm×0.25 μm)；二维色谱柱DB-17 ms(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm)；载气为氦气，柱流量为1.2 mL/min；柱温箱温度升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温到230 ℃，平衡4 min[21]。
全二维气相调制器条件：采用固态热调制器，载气为氮气，选择HV系列调制柱(C720)，调制周期为4 s，调制器进口和出口同步GC升温程序，进口温度30 ℃，出口温度120 ℃，冷阱保持-50 ℃[21]。
质谱条件：离子源温度200 ℃，接口温度240 ℃，质量扫描范围41～330 m/z[22]。
化合物的定性、定量分析：挥发性组分定性方法是将各组分的MS碎片模式与标准谱库NIST20 Library进行比对，按照匹配度高低(正反相匹配度≥750)对组分进行初步定性；根据相同全二维气相色谱条件下正构烷烃标品(C7～C25)的保留时间计算各组分的保留指数(retention index，RI)，挥发性组分定量方法采用加入内标物质进行半定量分析[22]。
1.4 数据处理
每个样本做3组平行，计算3次重复的平均值和标准差。利用Origin 2018和Excel 2016处理试验数据、画图。
2 结果与分析
2.1 感官评价结果及分析
由表3可知，6种腐乳的感官指标，色泽和香气差异显著，滋味和组织形态差异不显著。色泽最佳为S5样品，最差的为S2样品；香气最佳为S6样品，最差的为S2样品；滋味最佳为S6样品，最差的为S2样品；组织形态最佳的为S2和S6样品，最差的为S1样品；感官综合评价最佳为S6样品，最差的为S2样品。
表3 六种腐乳感官评价结果表
Table 3 Table of sensory evaluation results of six kinds of sufu
样品色泽香气滋味组织形态S16.3±0.6ab4.6±0.5ab4.6±0.6a6.3±0.6aS25.1±0.5a3.8±0.8a3.9±0.9a7.3±0.4aS35.5±0.6a5.6±0.3abc5.4±0.7a6.5±0.6aS47.2±0.3b4.0±0.4a5.0±0.7a6.5±0.5aS57.5±0.3b6.3±0.5bc5.3±0.5a6.9±0.5aS67.0±0.3b7.3±0.5c5.6±0.6a7.3±0.4a
注：同一列中不同字母表示有显著性差异(P<0.05)(下同)
2.2 腐乳挥发性组分的分析
2.2.1 腐乳主要风味物质鉴定结果
为进一步解析白酒对酿造腐乳挥风味的影响，利用全二维气相色谱-质谱对腐乳中挥发性物质的种类和含量进行检测。6种香型白酒发酵的腐乳中共鉴定出125种风味物质，包括44种酯类、33种醇类、14种醛类、10种酮类、4种酸类、4种酚类、3种喃类、其他类13种(嗪类、烯类等)。该研究结果与其他研究结果一致，即酯类、醇类等是腐乳的主要特征香气成分[6-8]。其中S1浓香型检出物质79种，S2酱香型73种，S3清香型61种，S4老白干型79种，S5凤香型64种，S6米香型77种。
2.2.2 腐乳中各类风味物质含量差异
6种白酒发酵腐乳各类风味化合物数量如图1所示，S1浓香型腐乳中酯类、酚类数量最多；S2酱香型腐乳中醛类、喃类最多；S4老白干型腐乳中酮类最多；S6米香型腐乳中醇类化合物种类最多。由图2可知，除酚类,S6米香型腐乳各类风味化合物在6种腐乳中均最高。风味物质总含量S6(135.18 μg/g)>S3(81.95 μg/g)>S1(16.60 μg/g)>S5(11.96 μg/g)>S4(6.83 μg/g)>S2(6.59 μg/g)。酯类、醇类在6种腐乳各类风味化合物中含量最高，分别为37.1%～67.4%、17.9%～42.6%(质量分数)，合计含量75.2%～89.6%(质量分数)。6种腐乳的风味物质构成差异较大，S1浓香型腐乳和S2酱香型腐乳的酯类含量高，醇类含量低；S3清香型腐乳的酮类含量相对其他样品较高，酯类含量低；S4老白干型腐乳的醛类含量相对其他样品较高；S5凤香型腐乳的酸类、醇类含量相对较高；S6米香型腐乳的醇类、酮类含量相对较高，酯类含量低。
图1 六种腐乳各类风味化合物数量
Fig.1 The amount of various flavor compounds in six types of sufu
a-6种腐乳各类风味化合物含量图；b-6种腐乳 各类风味化合物相对含量图
图2 六种腐乳各类风味化合物含量和分布
Fig.2 The content and distribution of various flavor compounds in six types of sufu
2.2.3 腐乳风味的主成分分析和聚类分析
对不同香型白酒酿造腐乳样本的挥发性组分质量比进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，由图3 PCA结果可知，PC1贡献率为71.0%，PC2贡献率为12.7%，前两个主成分累积贡献率83.7%可代表整体原始风味组分信息。6种腐乳中S1、S2、S4、S5分布在第1象限，S3、S6分布在第4象限。
S1离其他样本较远，与其关联性较高的挥发性组分是H31(正己酸乙酯，具有水果香气味)，S1浓香型腐乳中正己酸乙酯含量最高(6.04 μg/g)，质量分数为36.36%，为其主体香气和代表性风味物质，同样也是浓香型白酒的主体香气物质。H32(己酸己酯，呈嫩荚青刀豆香气和生水果香味)在浓香型腐乳中含量显著高于其他腐乳，这与感官品评时该腐乳发酵效果不理想、成熟度较其他腐乳差的结果一致，经检测氨基酸态氮含量较其他腐乳低。
S2酱香型腐乳中，H103(丁酸，具有刺激性及难闻的气味)、H105(正戊酸，具有难闻的臭袜子气味)含量显著高于其他腐乳，与感官嗅闻时被部分品评人员判定为香气不正确有异味的结论具有一致性。
图3 六种腐乳风味物质的主成分双标图
Fig.3 Biplot of the main components of six different types of sufu flavors
S5凤香型腐乳的代表性风味物质主要有H15(丁酸乙酯，有菠萝芳香气味)、H43(戊酸乙酯，苹果香气)、H36(己酸异戊酯，呈苹果和菠萝似香味)等。S5凤香型腐乳中H104(己酸，有汗臭味)含量较其他腐乳高，凤香型腐乳感官嗅闻时腐乳特有味道浓郁，评分较高可能与此物质有关。
S4老白干香型腐乳中H31(正己酸乙酯)5.22 μg/g，质量分数76.4%，为其主体香气。H47(十二醇，有弱而持久的油脂气味)、H50(1-壬醇，带有有力的甜而青的玫瑰花蜡和果香的脂蜡香气，有一些似桔子、甜橙气息)含量显著高于其他腐乳，此外H121(苯甲腈，有苦杏仁气味，味苦涩)，H14(丁二酸二乙酯，有愉快气味)等只在S4清香型腐乳中检出，其他腐乳未检出，均为其代表性风味物质。感官嗅闻时清香型腐乳香气不足，入口苦涩味重，鲜味不足，评分较低。
S3和S6分布较近，风味组分构成较为相似，与其关联性较高的挥发性组分是H99(4-辛酮)、H28(十六酸乙酯)、H37(亚油酸乙酯)、H74(乙醇)等，为其代表性物质；4-辛酮只在S3清香型腐乳和S6米香型腐乳中检出，其他腐乳未检出，含量分别为16.86、13.16 μg/g，质量分数为10.97%、9.74%；S3和S6腐乳中十六酸乙酯(呈微弱蜡香、果爵和奶油香气)、亚油酸乙酯、乙醇(有酒的气味和刺激性辛辣味)的含量显著高于其他腐乳。另外，S3腐乳的主体和代表香气物质还有H41(辛酸乙酯，具有白兰地的香气并有甜味)，H22(油酸乙酯，呈鲜花香气)，H52(1-辛烯-3-醇，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气)，H53(1-戊醇，有杂醇油香气)等。H46(三甲基-1-丁醇，有苹果白兰地香气)只在S6米香型腐乳中检出，其他腐乳未检出，为其主体和代表香气物质。S6米香型腐乳中风味物质总含量最高，感官品评时其愉快的香气使得其香气评分显著高于其他样品，这些风味物质同时赋予腐乳丰富的滋味。
图4聚类分析结果与PCA结果基本一致，也可以直观的看出不同样品之间的异同。
图4 六种腐乳风味物质聚类分析树状图
Fig.4 Dendrogram of cluster analysis of six types of sufu flavor substances
3 结论
本研究采用感官评分，GC-GC-MS结合PCA等分析比较了不同香型白酒原料发酵腐乳风味特征异同。结果表明，6种香型白酒发酵腐乳的感官色泽和香气差异显著，滋味和组织形态差异不显著。综合感官评价最佳为米香型样品，最差的为酱香型样品。利用GC-GC-MS在6种腐乳中共鉴别出了126种风味物质，其中浓香型白酒酿造腐乳检出物质79种，酱香型73种，清香型61种，老白干型79种，凤香型64种，米香型77种。6种腐乳的风味物质构成差异较大，清香型和米香型腐乳风味组分构成较为相似。米香型腐乳醇类化合物种类最多，各类风味物质(除酚类)质量比均最高，总含量为135.18 μg/g，说明米香型白酒在提高腐乳主香的丰满和回味程度方面更具优势，使其相较其他香型白酒更适合酿造腐乳。对不同香型白酒发酵得到的腐乳风味特征和成分差异的研究结果为腐乳的研发提供基础性研究数据，为指导开发高品质花色风味腐乳提供参考。
[1] 解春芝. 基于氨基酸代谢的腐乳酱风味促熟及机理研究[D].贵阳:贵州大学, 2019.
XIE C Z.Study on Sufu paste flavor ripening and mechanism based on amino acid metabolism[D].Guiyang:Guizhou University, 2019.
[2] FAN X J, LYU X P, MENG L, et al.Effect of microwave sterilization on maturation time and quality of low-salt sufu[J].Food Science & Nutrition, 2019, 8(1):584-593.
[3] 喻世哲, 刘晶晶, 吴佳伦, 等.外源蛋白酶对腐乳后发酵理化和感官特性的影响[J].食品科学, 2018, 39(8):64-68.
YU S Z, LIU J J, WU J L, et al.Effect of exogenous protease on the physiochemical and sensory properties of sufu during post-fermentation[J].Food Science, 2018, 39(8):64-68.
[4] 盛宇华, 李静, 林萌慧, 等.蛋白酶辅助法腐乳发酵工艺优化和理化性质分析[J].食品与发酵工业, 2022, 48(9):77-83.
SHENG Y H, LI J, LIN M H, et al.Optimization of protease-assisted sufu fermentation process and analysis of its physicochemical properties[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(9):77-83.
[5] 赵恒, 陈富安, 赵慧君, 等.茨河腐乳细菌与真菌多样性及其功能关联分析[J].食品与发酵工业, 2022, 48(10):212-218.
ZHAO H, CHEN F A, ZHAO H J, et al.Diversity and functional correlation analysis of bacteria and fungi in Huase sufu[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(10):212-218.
[6] 樊艳. SPME-GC-MS结合ROAV分析腐乳中的主体风味物质[J].食品工业科技, 2021, 42(8):227-234.
FAN Y.Analysis of main flavor substances in fermented soybean curd by SPME-GC-MS and ROAV[J].Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(8):227-234.
[7] 胡文康, 孙莉, 王嘉瑞, 等.不同类型腐乳中挥发性风味成分比较分析[J].中国调味品, 2020, 45(4):47-54.
HU W K, SUN L, WANG J R, et al.Comparative analysis of volatile flavor components in different kinds of sufu[J].China Condiment, 2020, 45(4):47-54.
[8] 陶康, 吴凌伟, 金晓芳, 等.基于高通量基因测序分析腐乳微生物多样性[J].食品科学, 2021, 42(8):143-149.
TAO K, WU L W, JIN X F, et al.Analysis of microbial diversity in Sufu using high-throughput sequencing[J].Food Science, 2021, 42(8):143-149.
[9] JI X Y.Investigation of the volatile components in commercial sufu (Chinese fermented soybean curd) based on HS-SPME/GC-MS combined with multivariate statistical analysis[J].Journal of Food Processing and Preservation, 2020, 44(1):e14309.
[10] XU D D, WANG P, ZHANG X, et al.High-throughput sequencing approach to characterize dynamic changes of the fungal and bacterial communities during the production of sufu, a traditional Chinese fermented soybean food- ScienceDirect[J].Food Microbiology, 2020, 86:103340.
[11] 孙娜, 张雅婷, 于寒松, 等.发酵型青腐乳菌群结构与风味物质及其相关性分析[J].食品科学, 2020, 41(22):177-183.
SUN N, ZHANG Y T, YU H S, et al.Microflora structure and flavor components and correlation between them in fermented stinky tofu[J].Food Science, 2020, 41(22):177-183.
[12] LI D W, MA Y L, LIANG J J, et al.Effects of different production technologies (fermented strains and spices) on biogenic amines in sufu fermentation[J].Journal of Food Processing and Preservation, 2020, 44(8):e14597.
[13] HU M, DONG J, TAN G L, et al.Metagenomic insights into the bacteria responsible for producing biogenic amines in sufu[J].Food Microbiology, 2021, 98(8):103762.
[14] 崔亮. 大豆品种对发酵豆制品品质的影响[D].沈阳:沈阳农业大学, 2019.
CUI L.Effects of soybean varieties on the quality of fermented soybean products[D].Shenyang:Shenyang Agricultural University, 2019.
[15] 穆德伦, 乌日娜, 崔亮, 等.大豆品种对毛霉菌发酵腐乳营养品质的影响[J].食品科学, 2020, 41(23):159-165.
MU D L, WU R N, CUI L, et al.Effects of soybean cultivars on nutrient composition and quality of sufu fermented by Mucor[J].Food Science, 2020, 41(23):159-165.
[16] 黄彩玉, 田缘, 张文婷, 等.利用醪糟代替食用酒精制备腐乳研究[J].农产品加工, 2018(12):9.
HUANG C Y, TIAN Y, ZHANG W T, et al.Study on the substitution of fermented glutinous rice to edible alcohol for sufu making[J].Farm Products Processing, 2018(12):9.
[17] 张明珠, 吴学凤, 穆冬冬, 等.不同香型白酒的风味物质及抗氧化作用分析[J].食品工业科技, 2021, 42(11):218-225.
ZHANG M Z, WU X F, MU D D, et al.Analysis of flavoring substances and antioxidant characteristics of different flavor Baijiu[J].Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(11):218-225.
[18] 陈平, 赵艳萍.影响腐乳质量因素的剖析[J].中国调味品, 1996,21(6):21-22.
CHEN P, ZHAO Y P.Analysis of factors affecting the quality of Sufu[J].Chinese Condiment, 1996,21(6):21-22.
[19] 张钰清. 添加谷朊粉对腐乳品质的影响[D].无锡:江南大学, 2019.
ZHANG Y Q.Effect of wheat gluten on the quality of fermented bean curd[D].Wuxi:Jiangnan University, 2019.
[20] 马艳莉, 梁静静, 李素萍, 等.低盐青方腐乳关键风味物质及部分功能性研究[J].食品研究与开发, 2020, 41(7):1-6.
MA Y L, LIANG J J, LI S P, et al.Study on key flavor substances and some functional characteristics of low-salt grey sufu[J].Food Research and Development, 2020, 41(7):1-6.
[21] 黄豆, 曹烙文, 岑延相, 等.顶空固相微萃取-全二维气相色谱/飞行时间质谱测定三种芒果香气成分[J].食品工业科技, 2021, 42(15):218-226.
HUANG D, CAO L W, CEN Y X, et al.Detection of aroma components in three cultivars of mango with headspace solid phase microextraction-comprehensive two-dimensional gas chromatograph/time of flight mass spectrometer[J].Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(15):218-226.
[22] 孙文佳, 王雪梅, 李亚隆, 等.外源添加氨基酸对郫县豆瓣模拟体系感官及特征风味的影响[J].食品科学, 2021, 42(22):283-290.
SUN W J, WANG X M, Li Y L, et al.Effect of exogenous amino acid addition on sensory and flavor characteristics of model Pixian broad-bean paste system[J].Food Science, 2021, 42(22):283-290.