黑米富含蛋白质、氨基酸、矿物质、花青素和膳食纤维等物质，具有健脾养胃、养肝明目、抗氧化、降低血糖和血脂的功效[1-3]。黑米酒必需氨基酸含量丰富且均衡，且维生素E含量高[4],具有免疫、抗动脉粥样硬化、延缓衰老、改善免疫和抗癌等生理功能[5]。黑米酒糟作为黑米酒生产的副产物，富含蛋白质、矿物质、花青素、微量元素和淀粉等生物活性物质,但是其有效的利用方法相对较少，造成资源浪费。
面包是主要的面制食品，随着人们对健康饮食需求的增加，传统面包也朝着功能化、多样化、健康化方向转变。研究人员将功能性食用材料加入面包内，提高面包的功能与营养价值，比如将萌发绿豆粉[6]、苹果全粉[7]、板栗酒糟[8]、改性麸皮[9]、啤酒糟[10]等用于制备面包。本文拟采用不同添加量的黑米酒糟制备面包，利用色泽、质构、感官评价和体外实验等手段，探究黑米酒糟对面包的品质和功能特性的影响。该研究为黑米酒糟营养面包的制备及其综合应用提供理论与技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑米酒糟由黄山七约米酒公司提供；高筋面包粉、黄油、细砂糖、食用盐、安琪酵母，芜湖市大润发超市；没食子酸、福林酚、DPPH、ABTS，上海麦克林试剂有限公司；葡萄糖、酒石酸钾钠、冰乙酸、CH3OH、无水乙醇，上海国药试剂有限公司；α-淀粉酶，合肥博美试剂有限公司；糖化酶，河南万邦实业有限公司；所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
M6和面机，青岛汉尚电器有限公司；SH-Lab-10真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；TA.XTC-18质构仪，上海保圣科技有限公司；WSC-S测色色差仪，上海仪电物理光学仪器有限公司；SHZ-82水浴恒温振荡器，江苏金坛市金城国盛实验仪器厂；紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；KH3200E超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱，上海市三发科学仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；JSM-6390LV扫描电子显微镜，日本电子株式会社。
1.3 实验方法
1.3.1 面包制作
黑米酒糟经干燥粉碎，过80目筛，按不同添加量(0%、4%、8%、12%，质量分数)与面包粉混合，制成4组质地均匀的混合粉。配方：混合粉210 g、牛奶95 g、蛋液45 g、糖28 g、黄油15 g、安琪酵母2 g。原料放入和面机，揉好面团后滚圆成8份，醒发(35 ℃，2 h)，烘烤后，取出晾凉。
1.3.2 面包比容测定
采用菜籽替代法测定面包的体积并称重，面包体积与质量之比即为面包比容(m3/kg)。
1.3.3 面包色差测定
使用全自动色差仪测定面包的L*、a*、b*值。色差偏差按公式(1)计算：
(1)
式中：ΔE为实验组和空白组(黑米酒糟粉添加量为0%)之间的色差值；
和
和
和
分别表示实验组和空白组的颜色明亮度、红绿值、黄蓝值。
1.3.4 面包内部结构分析
将添加不同含量(0%、4%、8%、12%)黑米酒糟的面包切成约12 mm面包片，每组面包取3份样品，进行扫描处理。运用Image J 软件分析扫描图片，对面包的气孔数量、气孔周长、气孔总体积、孔隙粒径和体积分数5个指标进行分析。
1.3.5 面包质构测定
用面包刀将面包样品从中间部位自上而下垂直切成均匀的两部分，再分别切出厚度为(23±1) mm，上下切面平整的面包片。每组样品切出3片作为测试样品。质构测定参数设置：选用TA/36R探头,具体参数：选择全质构，测试前速度3 mm/s,测试速度21 mm/s,测试后速度21 mm/s,压缩程度50%,间隔时间2 s。
1.3.6 微观结构测定
将不同黑米酒糟添加量的面包样品粉末分别放置于圆形样品座上，用洗耳球吹去样品座上的浮样，进行喷金处理，然后在扫描电镜下进行观察，放大倍数为100、500、1 000倍。
1.3.7 面包感官品质评价
选20名有经验的人员组成评鉴小组，对面包进行感官综合评价，所测面包样品的感官评分标准参照GB/T 14611—2008。感官评价参数为形态(20分)、色泽(20分)、气味(20分)、口感滋味(20分)和组织状态(20分)。
1.3.8 面包样品抗氧化能力测定
1.3.8.1 总酚测定
参照段云龙等[11]方法。面包样品冻干粉碎，取2.5 g面包粉加入到50 mL甲醇溶液(体积分数80%)，水浴振荡(37 ℃，2 h)；室温超声30 min，离心(2 600 r/min，15 min)，上清液即为多酚提取液。取0.5 mL多酚提取液，依次加入0.45 mL蒸馏水、0.5 mL福林酚试剂和0.5 mL 200 g/L Na2CO3溶液，摇匀，室温反应60 min，760 nm处测吸光值，结果以没食子酸当量表示(mg没食子酸/g面包干物质)。
1.3.8.2 DPPH自由基清除率测定
参照KIM等[12]方法。配制0.4 mmol/L DPPH自由基无水乙醇溶液，取2 mL多酚提取液与2 mL DPPH自由基溶液混合，避光反应30 min，在517 nm处测定其吸光值。以2 mL无水乙醇替代DPPH自由基溶液作颜色对照组，以2 mL无水乙醇替代样品作空白组，其他反应物不变。计算如公式(2)所示：
DPPH自由基清除率
(2)
式中：A空白，2 mL无水乙醇与2 mL DPPH自由基溶液混合液的吸光值；A对照，2 mL样品提取液与2 mL无水乙醇混合液的吸光值；A样品，2 mL多酚提取液与2 mL DPPH自由基溶液混合液的吸光值。
1.3.8.3 ABTS阳离子自由基清除率测定
参照LI等[13]方法。配制6 mmol/L ABTS阳离子自由基水溶液，加入过量MnO2反应后过滤，得到ABTS阳离子自由基储备液。使用时，将储备液稀释成734 nm处吸光值为0.5±0.02的工作液。取0.2 mL多酚提取液与0.8 mL ABTS阳离子自由基工作液充分混合，避光反应6 min，在734 nm处测定其吸光值。以0.2 mL无水乙醇替代多酚提取液做空白。计算如公式(3)所示：
ABTS阳离子自由基清除率
(3)
式中：A空白，0.8 mL ABTS阳离子自由基工作液与0.2 mL无水乙醇混合液的吸光值；A样品，0.8 mL ABTS阳离子自由基工作液与0.2 mL多酚提取液混合液的吸光值。
1.3.9 面包样品体外消化能力测定
根据ENGLYST等[14]方法并稍作修改。取面包样品0.100 0 g，加入4 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH=5.2)，水浴消化(37 ℃，15 min)，加入0.8 mL α-淀粉酶溶液和0.2 mL淀粉转葡糖苷酶溶液，继续水浴酶解(37 ℃)。在0、20、120 min时，分别取出0.5 mL酶解后液体，加入10 mL 68%(体积分数)乙醇，离心(4 000 r/min，10 min)。稀释至一定浓度后取上清液1 mL，加入2 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，沸水浴10 min，加入9 mL蒸馏水，测定540 nm处吸光度值。参照马晶晶等[15]方法作出葡萄糖标准曲线，根据标准曲线得出上清液中葡萄糖含量；计算快速消化淀粉(rapid digestion starch，RDS)、慢速消化淀粉(slow digestion starch，SDS)和抗性淀粉(resistant starch，RS)的质量分数。面包总淀粉含量测定采用3,5-二硝基水杨酸法，计算如公式(4)～公式(6)所示：
RDS含量
(4)
SDS含量
(5)
RS含量
(6)
式中：mF，酶解前淀粉中游离葡萄糖的质量，mg；m20为淀粉酶水解20 min后葡萄糖的质量，mg；m120，淀粉酶水解120 min后的葡萄糖的质量，mg；TS，样品中总淀粉的质量，mg。
1.4 数据分析
所有实验均为3次重复，测定数据以平均值±标准偏差来表示。实验数据应用Origin pro2021软件作图，用SPSS 25.0软件进行差异显著性分析(P<0.05为显著性差异)。
2 结果与分析
2.1 黑米酒糟对面包比容的影响
高膳食纤维能破坏面筋蛋白的网络结构，阻碍酵母发酵，导致面包的持气能力下降[16]。由图1可知，随着黑米酒糟粉添加量的增大，面包比容整体呈减少的趋势。当添加量在0%～8%时，面包比容无显著性变化；当添加量为12%时，面包比容下降明显。原因可能是黑米酒糟粉的膳食纤维影响面团的发酵过程，降低面包对发酵产生的CO2的持气能力，从而使面包体积变小。本实验结果与杨丹[17]研究结果相一致。
图1 黑米酒糟对面包比容的影响
Fig.1 Effect of black rice spent grain on the specific volume of bread
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 黑米酒糟对面包颜色的影响
面包烘焙的成色反应主要有美拉德反应、焦糖化反应和酶促褐变，其影响面包的蛋白质和氨基酸含量[18]。以0%添加量面包作为对照，研究不同黑米酒糟添加量的面包色差值ΔE差异，结果如图2所示。随着黑米酒糟添加量增加，面包色差值呈现出显著性差异(P<0.05)。说明随着黑米酒糟添加量增大，面包的蛋白质含量随之增高，符合实验预期。
图2 黑米酒糟对面包颜色的影响
Fig.2 Effect of black rice spent grain on the color of bread
2.3 黑米酒糟对面包内部结构的影响
面包切片扫描分析面包内部的初步结构，便于分析面包的特性。由表1可知，未添加黑米酒糟的面包，其孔的数量最多，但孔的体积与直径较小，面包内部结构较为致密。随着黑米酒糟添加量增加，面包中孔的数量逐渐减少，但孔的直径逐渐增加。当黑米酒糟添加量为8%时，面包中孔的体积、周长和直径均达到实验组中的峰值，此时面包内部结构更加疏松。
表1 黑米酒糟对面包内部结构的影响
Table 1 Effect of black rice spent grain on the internal structure of bread
添加量/%孔的数量/个孔的总体积/mm3体积分数/%孔的周长/mm面包孔隙粒径/mm09.00±3.00a69.47±41.94a7.06±4.26a22.85±0.10a1.02.±0.01b46.00±2.00ab45.14±14.12a4.45±0.48a26.26±0.12a2.11±0.72ab86.00±3.00ab96.75±43.98a9.03±2.86a26.45±0.04a3.35±0.35a123.00±0.00b39.36±26.29a4.09±2.93a26.93±13.37a3.00±1.01a
注：同列中不同上标字母表示有显著性差异(P<0.05)(下同)
2.4 黑米酒糟对面包质构的影响
面包质构指标包括硬度、咀嚼性、胶着性、弹性和内聚性。面包的硬度、咀嚼性及胶着性和面包品质呈现负向相关趋势。膳食纤维对面包中面筋蛋白起到稀释作用，减少面筋蛋白形成，使面包硬度变大[19]。由表2可知，随着黑米酒糟添加量增加，面包的硬度、咀嚼性、胶着性呈现上升趋势，面包品质呈现显著下降的趋势。原因可能是黑米酒糟含有纤维素和黏性多糖，与水结合产生黏性，导致面包的咀嚼性和胶着性呈现增大趋势。另外，面包的弹性与内聚性和面包品质呈现正向相关趋势。随着黑米酒糟添加量增加，面包的弹性和内聚性较未添加面包呈现下降趋势，面包品质下降。原因可能是黑米酒糟粉中纤维含量较高，纤维占据在面筋网络中，阻碍其形成，从而导致面包的弹性和内聚性下降。本实验结果与蔡金鑫[20]研究一致。
2.5 扫描电镜的微观结构分析
扫描电镜观察样品微观结构如图3所示。随着黑米酒糟添加量增加，面包微观结构有明显变化：面包粉粒径变小，粉质更加细密，但面包粉表面变得更加粗糙。原因可能是黑米酒糟的膳食纤维稀释了面筋网络结构，使面筋易断不连续，面包致密性增加，导致面包粉表面呈现粗糙面筋网[8]。这也与黑米酒糟面包比容及内部结构实验结果相符。
表2 黑米酒糟对面包质构的影响
Table 2 Effect of black rice spent frain on the bread texture
添加量/%硬度/g咀嚼性胶着性弹性/mm内聚性0381.645±91.394b230.742±32.594a260.129±46.341a0.892±0.044a0.697±0.114b4403.254±54.207ab244.339±47.442a274.348±29.638a0.876±0.016ab0.671±0.015a8463.279±26.993ab261.763±31.968a299.783±51.011a0.853±0.012ab0.656±0.014a12530.058±78.094a264.133±49.488a311.612±57.584a0.847±0.003a0.586±0.021c
a-扫描倍数100倍；b-扫描倍数500倍；c-扫描倍数1 000倍
图3 黑米酒糟面包的扫描电镜图
Fig.3 Scanning electron microscopy of bread with black rice spent frain
2.6 黑米酒糟添加量对面包感官品质的影响
根据王玉婉等[21]方法，采用雷达图分析黑米酒糟面包的感官评价，结果见图4。黑米酒糟使面包感官评价总分呈下降趋势，且总分随着黑米酒糟添加量增加而降低，具体表现为口感粗糙、颜色变深及形态不均等。当黑米酒糟添加量为4%时，其综合评分高于添加量为8%和12%的面包，更易被接受。原因可能是黑米酒糟破坏了面包内部的面筋网络。
图4 黑米酒糟对面包感官品质得分的影响
Fig.4 Effect of black rice spent frain on the sensory evaluation of bread
2.7 黑米酒糟对面包总酚含量及抗氧化活性的影响
酚类物质含量与面包抗氧化能力有直接关系[11]。由图5-a可知，随着黑米酒糟添加量增加，面包总酚含量逐渐增加。当添加量为12%时，多酚含量最高，原因可能是黑米酒糟中含有花青素苷和类黄酮等酚类物质。由图5-b可知，黑米酒糟能提高DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除能力。随着黑米酒糟添加量增加，清除能力提高，与总酚含量实验结果相一致。对照样品具有一定的自由基清除能力，可能原因是面粉中含有植酸、维生素E等抗氧化物质，且面包在烘焙过程中产生具有抗氧化能力的美拉德产物[22]。因此，添加黑米酒糟增加面包中抗氧化物质含量(类黄酮、花色苷、维生素E等)，提高面包的自由基清除能力。
a-总酚含量；b-DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率
图5 黑米酒糟对面包抗氧化活性的影响
Fig.5 Effect of black rice spent frain on the antioxidant activity of bread
2.8 黑米酒糟对面包体外消化特性的影响
本实验获得葡萄糖标准曲线回归方程：y=0.717 1x-0.066，R2=0.995 5，说明葡萄糖浓度与吸光度有较好的相关性。体外消化实验指标包括RDS、RS[14]。陈颖等[8]研究表明酒糟面包能明显增加总膳食纤维含量。FOSCHIA等[23]证实面包中加入膳食纤维会降低淀粉的消化速度。由图6可知，未添加黑米酒糟面包的RDS含量为68.25%；当黑米酒糟添加量为4%、8%、12%时，面包的RDS含量分别为59.04%、56.55%和50.98%；面包的SDS含量也随着黑米酒糟添加量增加而降低，说明黑米酒糟的添加使面包消化速度明显减慢；而面包的RS含量则随着黑米酒糟添加量增加而增加，当黑米酒糟添加量为12%时，面包的RS含量最高(32.97%)。原因可能是高添加量黑米酒糟使面包总膳食纤维含量增加，降低面包的RDS与SDS含量，而增加面包的RS含量，且具有显著性差异(P<0.05)。因此，黑米酒糟对面包消化作用有明显的抑制作用，随着黑米酒糟添加量增加，该抑制作用逐渐提高。抗性淀粉具有调节血糖水平、降低结肠癌发生率与保持体重等功效[24]，所以黑米酒糟适合用于生产抗性淀粉制品。
图6 黑米酒糟对面包中各类淀粉含量的影响
Fig.6 Effects of black rice spent frain on the various starch content of bread
3 结论
本文探究不同黑米酒糟添加量对面包感官、结构、质构、总酚含量和抗氧化性及体外消化特性等影响。当黑米酒糟添加量为4%时，感官上最易使人接受且色差值较小；添加量为8%时，内部组织结构最好，但黑米酒糟中膳食纤维使面包的弹性、内聚性下降和硬度增加。黑米酒糟能提高面包的总酚含量和降低面包的消化能力。本研究为黑米酒糟面包的工业生产和进一步研究提供理论基础。
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