柿子，又名米果、猴枣，是柿科柿属植物，主要生长在温带和热带[1]。柿子是我国的本土水果，距今已有3 000多年的栽培历史，我国是世界上杮树栽培面积和产量最大的国家[2]。柿子被誉为“果中圣品”，含有丰富的维生素、黄酮、氨基酸、矿物质等对人体有益的物质。柿子不仅具有较高的营养价值，还具有较高的药用价值，如解蛇毒、降血脂，还能有效预防脂类代谢紊乱类型的疾病[3]。柿子渣是柿子加工后产生的副产物，含有大量的果胶[4]、多酚类物质[5]。目前在食品工业中，工厂对柿子加工过程中副产物的利用还不太成熟，柿子渣等被废弃掉的现象十分普遍，极易导致资源的浪费和环境的污染。因此,如何提高柿子渣的综合利用率，成为当前阶段的研究热点。
膳食纤维(dietary fiber，DF)是一类聚合度≥3的碳水化合物和植物固有的或可以化学合成、不被小肠内的内源酶水解的木质素[6]。DF分类方法有很多种，现阶段，主要是根据DF能否溶于水进行分类，可分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)和不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)。大多数来自植物的DF被归类为IDF，IDF含有酚类、羧酸、醛、酮和醚键等官能团[7]。纤维素、半纤维素和木质素是IDF的主要成分，具有支持肠道菌群生长、增加粪便量、减少肠道转运和抑制胰脂肪酶活性的生理功能[8]。然而，IDF被加入到食品中后，可能会对食品的颜色、质地、风味和味道产生不利影响。多年来，人们进行了大量关于膳食纤维改性的研究，以改变IDF的粒径、表面积和微观结构，从而改善其功能特性并促进其在食品工业中的开发应用。酶改性膳食纤维使用对不溶性膳食纤维起作用的酶来降解和改变一些不溶性膳食纤维的溶解度。YU等[9]使用纤维素酶和木聚糖酶对胡萝卜渣IDF进行改性，发现其改性后在持水力、膨胀力、持油力及对胆固醇的吸附能力等方面都分别大大提高。过氧化氢是存在于许多生物体中的一种天然代谢物，并参与各种生物途径，尤其是参与复杂酶系统中真菌分解木质素的途径[10]。碱性过氧化氢(alkaline hydrogen peroxide，AHP)处理是DF的一种化学改性，许多研究表明，AHP处理显著改善了SDF的含量和功能特性。LI等[11]采用AHP处理方法，将SDF的提取率从7.9%提高到27.5%，同时改性后SDF具有更强的多孔结构，能够螯合二价离子形成更强的凝胶，从而作为一种新型的功能性水胶体或食品添加剂。然而，AHP处理对IDF结构和功能特性的影响鲜有报道。
因此，本文的研究目的旨在比较复合酶处理和AHP处理对柿子渣IDF结构特征和理化特征的影响。采用扫描电子显微镜、X射线衍射和傅立叶红外光谱对IDF的结构和形貌进行了表征，同时测定IDF的持水力、膨胀力、亚硝酸盐吸附力和阳离子交换力来评价IDF的理化特性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
柿子渣；淀粉酶(37 000 U/g)、木瓜蛋白酶(100 000 U/g),上海易恩化学技术有限公司；纤维素酶(600 000 U/g),安徽酷尔生物工程有限公司；木聚糖酶(100 000 U/g),上海麦克林生化科技有限公司。
亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、PBS缓冲液、盐酸、氯化钠、酚酞、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
JA203H电子分析天平，常州市幸运电子设备有限公司；GZX-9030MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；H/T16MM台式高速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；PHS-3C pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；HH-S4恒温水浴锅，常州国宇仪器制造有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器，常州市金坛科兴仪器厂；752 N紫外分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；Nicolet傅里叶红外光谱仪，美国Thermo公司；Gemini 500热场发射扫描电子显微镜，德国Carl Zeiss公司；D/MAX2500VL/PC转靶X射线衍射仪，日本Rigaku理学公司。
1.3 实验方法
1.3.1 柿子渣IDF的制备
参考吴丽萍等[12]的方法并略作修改。将柿子在榨汁后剩余下来的柿子渣于60 ℃下烘干，用粉粹机粉碎后过80目筛得到柿渣粉。按料液比1∶10(g∶mL)加入蒸馏水并搅拌均匀，加入0.5%淀粉酶(质量分数，下同)，在50 ℃水浴条件下酶解1.5 h，灭酶，而后调节水浴锅温度至55 ℃，加入0.5%木瓜蛋白酶酶解1 h后沸水灭酶5 min，冷却，在5 000 r/min下离心15 min，收集沉淀，置于60 ℃干燥箱内烘干至恒重，粉碎，得到柿子渣IDF，称重，按公式(1)计算得到IDF的得率为73.36%。
IDF得率/(以干基计，%)
(1)
1.3.2 IDF的改性
1.3.2.1 复合酶解法
称取制备好的IDF，按料液比1∶15(g∶mL)加入蒸馏水并搅拌均匀，按1.6%的质量分数加入1∶1的纤维素酶和木聚糖酶，放置在55 ℃水浴锅内酶解2 h，灭酶5 min，冷却后以4 500 r/min离心10 min，将沉淀于60 ℃完全干燥后研磨成粉末，即得EIDF。
1.3.2.2 碱性过氧化氢法[13]
称取一定量的IDF粉末，按照1∶20(g∶mL)的料液比加入pH为11的H2O2溶液(用氢氧化钠调节pH)，在室温下连续搅拌30 min，用蒸馏水洗至中性后，在60 ℃下干燥至恒重，粉碎，即得AIDF。
1.3.3 改性IDF的特性研究
1.3.3.1 持水力(water holding capacity，WHC)的测定
称取1 g样品(m0)置于50 mL离心管中，加入25 mL蒸馏水，振荡均匀，并在室温下静置24 h，以4 000 r/min的转速离心15 min，弃掉上清液，滤纸吸干离心管内壁的水分，称离心管含样品时的重量，该重量减去离心管的重量即得到湿重(m1)。WHC计算如公式(2)所示:
(2)
1.3.3.2 膨胀力(swelling capacity，SC)的测定
称取1 g样品(m0)于50 mL量筒中，与30 mL蒸馏水混合，摇晃均匀，记录此时的体积(V1)，然后室温下静置24 h，记录静置后的体积(V2)。SC计算如公式(3)所示:
(3)
1.3.3.3 亚硝酸盐吸附力(nitrite ion adsorption capacity，NIAC)的测定
标准曲线的绘制参考安玉敏[14]的方法。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL NaNO2溶液(100 μmol/L)于6支试管中，再分别加入蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL，接着每支试管均添加2 mL质量分数为0.4%的对氨基苯磺酸溶液，摇匀并静放5 min，随后添加1 mL 0.2%质量分数的盐酸萘乙二胺溶液，混匀，放15 min，用零管调零，在538 nm处测吸光值，以亚硝酸根含量为横坐标，吸光度值为纵坐标做标准曲线(图1)。
取0.5 g改性前后柿子渣IDF于250 mL锥形瓶中，加入利用PBS调节pH为7(模拟肠道环境)NaNO2溶液(100 μmol/L)100 mL，于37 ℃恒温反应30 min后，各取1 mL样液，按照标曲在538 nm处测定其吸光值。NIAC计算如公式(4)所示：
(4)
式中：m2表示吸附前溶液中亚硝酸盐的含量，μmol；m1表示吸附后溶液中亚硝酸盐的含量，μmol；m0表示样品的质量，g。
图1 亚硝酸盐吸附力的标准曲线
Fig.1 Stangard curve of nitrite ion
1.3.3.4 阳离子交换能力(cation exchange capacity，CEC)的测定
分别称取1 g样品于锥形瓶中，与50 mL 0.1 mol/L的HCl溶液混合，摇晃均匀后在室温下静放24 h使之完全酸化，然后过滤，使用蒸馏水洗涤残渣，接着干燥到重量不再变化；准确称取干燥后的样品0.5 g，将其添加到含有80 mL 5%(质量分数)NaCl溶液中，加入数滴酚酞，然后用 0.1 mol/L的NaOH溶液缓慢滴定，直到溶液变成微红且颜色不消失时停止滴定。空白组试验以蒸馏水代替HCl进行。CEC按公式(5)计算：
(5)
式中：V1是滴定样品消耗的NaOH的体积，mL；V0是滴定空白消耗的NaOH的体积，mL；C是NaOH的浓度，mol/L；m0是样品的质量，g。
1.3.4 扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)
取少量样品固定在导电胶上，洗耳球轻吹样品表面，使用离子溅射镀膜仪进行喷金处理，在30 kV电压下观察其微观结构。样品的图像在1 000倍的放大倍数下拍摄获得。
1.3.5 X射线衍射
利用X射线衍射仪观察分析改性前后试样的晶体结构。取适量样品，均匀放置在样品槽中，压实表面，保持样品表面平整紧密，将样品槽插入仪器测定。主要参数：Cu靶，管压20 kV，测试范围5°～50°(2θ角)，角度步长为0.02°。
1.3.6 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)
取1 mg样品以1∶100的质量比与溴化钾混合研磨后压片，在4 000～400 cm-1，用Nicolet傅里叶红外光谱仪进行扫描。
1.4 数据处理
每组实验重复3次，结果以(平均值±标准差)来表示，采用Microsoft Office 2016进行数据处理，采用Origin 2019进行绘图。
2 结果与分析
2.1 持水力与膨胀力
WHC是指膳食纤维中的游离水和通过物理方法结合的结合水，受环境条件和膳食纤维的物理化学性质(如离子强度和结构形态)的影响[15]。SC反映了膳食纤维与水结合后总体积的变化，并与温度、颗粒电荷和纤维成分等密切相关。由图2可知，经过改性后，IDF的WHC和SC均有一定程度上的提高，酶处理(4.76 g/g)和AHP处理(6.84 g/g)后WHC值分别增加了1.19倍和1.71倍，酶处理(4.53 mL/g)和AHP处理(9.43 mL/g)后SC值分别增加了1.43倍和2.98倍，可见AHP改性效果优于酶处理。WHC的增加可能是由于改性处理破坏了纤维素和半纤维素的分子间氢键，从而导致更多亲水基团的暴露。通过SEM也可以观察到，具有更细颗粒和更大表面积的AIDF具有更强的捕水能力，并且可能通过表面张力强度、氢键和偶极相互作用导致水合能力增加[16]。
图2 改性对IDF持水力、膨胀力的影响
Fig.2 Effects of modification on the water holding capacity and swelling capacity of IDF
2.2 亚硝酸盐吸附力
亚硝酸盐离子被应用于腌肉制品中，以形成特色风味和色泽，并抑制病原体。然而，这些离子在与仲胺、叔胺反应后会产生具有致癌作用的N-亚硝胺化合物[17]。膳食纤维对亚硝酸盐的吸附能力是其一个重要特性，有助于降低腌肉制品对人类的毒性。由图3可知，改性前后IDF的NIAC相差不大，这可能是由于在pH为7时膳食纤维表面负电荷密度较高，导致对亚硝酸盐离子的排斥增加，从而降低了膳食纤维对亚硝酸盐离子的吸附能力[18]。与酶改性比较，AHP处理后的IDF对亚硝酸盐的吸附能力更强。
图3 改性对IDF亚硝酸盐吸附力的影响
Fig.3 Effect of modification on the nitrite ion adsorption capacity of IDF
2.3 阳离子交换力
膳食纤维分子结构中存在氨基、羟基等活性基团。这些基团与Zn2+、Cu2+等离子进行交换时，可以使体内离子浓度短暂降低，导致还原/氧化电位和细胞内渗透压发生变化，从而有助于调节血压[19]。改性前后的CEC如图4所示，与复合酶处理相比，AHP处理能有效提高IDF的CEC，其CEC表现为EIDF的6倍，这可能是因为复合酶水解改性过程中的酸性溶液对其阳离子交换能力产生了不利影响。这与MA等[20]的结果相反，其酶改性后膳食纤维的CEC高达0.56 mmol/g，被认为可能是因为酶解会破坏膳食纤维分子的共价键，暴露出更多的羧基和羟基，更有利于阳离子交换。
图4 改性对IDF阳离子交换力的影响
Fig.4 Effect of modification on the cation exchange capacity of IDF
2.4 改性IDF的微观结构
图5是改性前后的IDF在1 000 ×下的扫描电子图。由图5可知，在相同放大倍数下，未改性的IDF带有一些片状结构，表面光滑无缝隙。经过酶改性后IDF形貌略有变化，表面粗糙结构松散，这说明纤维素酶和木聚糖酶对IDF的结构有显著影响，降解了大分子的致密结构，促进了IDF向SDF的转化。AHP处理对IDF表面造成更大损伤，褶皱不平整，并暴露纤维内部结构，NYMAN等[21]认为AHP导致了IDF中糖苷键的断裂，降解了部分纤维素、半纤维素和果胶，从而使IDF表面被破坏形成孔洞。粗糙纤维表面上孔洞和沟壑面积的增加可导致水合作用和吸收作用的增加，这与WANG等[22]的研究结果具有一致之处。
a-IDF；b-EIDF；c-AIDF
图5 改性前后IDF的扫描电子显微镜图
Fig.5 Scanning electron microscope images of IDF before and after modification
2.5 改性IDF的X射线衍射
图6为X射线衍射图，用来分析改性前后IDF的晶体结构的变化。所有样品均在21.68°处显示衍射峰，表现出具有典型双螺旋结构的Ⅰ型纤维素。纤维素具有结晶结构是由于氢键相互作用和相邻分子之间的范德华力[23]。研究表明，非晶态区域可能是由于非晶态纤维素、半纤维素和木质素的存在[24]。改性前后的样品的峰位和峰宽没有明显差异，只是衍射强度有所差异，这表明IDF中纤维素结晶区的有序结构在经过改性处理后没有被破坏。AIDF中出现的高强度峰，表明AHP化学改性处理对结晶结构有显著影响。
图6 改性前后IDF的X射线衍射图
Fig.6 X-ray diffraction diagram of IDF before and after modification
2.6 改性IDF的FT-IR光谱分析
图7为改性前后IDF的红外光谱图，用于测定其官能团变化。3 300 cm-1处的宽吸收峰由纤维素和半纤维素的O—H伸缩振动形成，改性后IDF的吸收峰强度减弱，这可能是因为改性处理使分子间的氢键断裂。在2 920 cm-1处出现的吸收峰是多糖甲基中的C—H伸缩振动，改性后强度减弱，说明多糖的特征基团遭到破坏[12]。在所有样品的光谱中观察到这2个峰，表现出维素和半纤维素的典型结构。1 440～1 600 cm-1处的条带代表C
O拉伸振动，在过氧化氢显著氧化后，羧基共轭羰基拉伸通常增加，这也表明AIDF的吸水性增强[25]。1 030 cm-1处的谱带表示木质素或半纤维素中醚键(C—O—C)的振动[26]。根据FT-IR光谱，经酶水解和AHP改性的纤维仍然具有基本均匀的吸收峰，这表明其基本化学结构没有被破坏。同时，峰值强度之间的差异表明，2种处理都有效地去除了IDF结构中的非晶态成分。
图7 改性前后IDF的红外光谱图
Fig.7 FT-IR spectra of IDF before and after modification
3 结论
本文通过复合酶和碱性过氧化氢2种方法对柿子渣IDF进行改性，并探讨了其改性后颗粒结构和理化特性的变化。研究结果表明，改性能使纤维素和木质素发生部分降解，使颗粒表面结构被破坏，疏松多孔，褶皱和裂纹增多，比表面积增大，同时有更多的亲水活性基团暴露出来，从而导致持水力、膨胀力和吸收作用有一定的提高。碱性过氧化氢法的改性效果更为明显，其理化特性有较大改善，另外，联合国粮农组织将过氧化氢认定为一般安全性物质，在体内能有效降解，其残留量不足以引起安全性的关注。因此，碱性过氧化氢法更适合作为改善柿子渣不溶性膳食纤维的一种方法，从而提高柿子渣的高效利用率，带来巨大的经济效益和生态效益。
[1] 李晓银. 柿子皮中类胡萝卜素化合物的分离鉴定及稳定性研究[D].西安:西北工业大学, 2006.
LI X Y.Study on the separation, identification and stability of carotenoids from persimmon peel[D].Xi′an:Northwestern Polytechnical University, 2006.
[2] 杨季璋, 姚自鸣.柿育种研究现状及展望[J].安徽农学通报, 2018, 24(17):50-52.
YANG J Z, YAO Z M.Current situation and prospect of persimmon breeding research[J].Anhui Agricultural Science Bulletin, 2018, 24(17):50-52.
[3] 王玥, 杨明美, 李梦丽, 等.柿子乳酸菌发酵饮料的加工工艺研究[J].中国食品学报, 2020, 20(7):118-125.
WANG Y, YANG M M, LI M L, et al.Studies on the fermentation process of persimmon fruit lactic acid beverage[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2020, 20(7):118-125.
[4] 李楚楚, 赵丹丹, 韩雪, 等.利用酸性电解水提取柿子渣中果胶及其工艺优化[J].食品科技, 2019, 44(1):274-280.
LI C C, ZHAO D D, HAN X, et al.Optimization on extraction of pectin from persimmon residue with acidic electrolyzed water [J].Food Science and Technology, 2019, 44(1):274-280.
[5] 李西柳, 庞明, 王俊儒, 等.柿子渣中多酚的提取工艺及其抗氧化性研究[J].西北植物学报, 2010, 30(7):1 475-1 480.
LI X L, PANG M, WANG J R, et al.Polyphenols extraction methods from persimmon pomace and its antioxidant activity[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2010, 30(7):1 475-1 480.
[6] LAMOTHE L M, CANTU-JUNGLES T M, CHEN T T, et al.Boosting the value of insoluble dietary fiber to increase gut fermentability through food processing[J].Food & Function, 2021, 12(21):10 658-10 666.
[7] ZHENG Y J, LI Y.Physicochemical and functional properties of coconut (Cocos nucifera L) cake dietary fibres:Effects of cellulase hydrolysis, acid treatment and particle size distribution[J].Food Chemistry, 2018, 257(15):135-142.
[8] MENG X M, LIU F, XIAO Y, et al.Alterations in physicochemical and functional properties of buckwheat straw insoluble dietary fiber by alkaline hydrogen peroxide treatment[J].Food Chemistry:X, 2019, 3(30):100029.
[9] YU G Y, BEI J, ZHAO J, et al.Modification of carrot (Daucus carota Linn.var.Sativa Hoffm.) pomace insoluble dietary fiber with complex enzyme method, ultrafine comminution, and high hydrostatic pressure[J].Food Chemistry, 2018, 257:333-340.
[10] DUTRA E D, ALMEIDA SANTOS F, ALENCAR B R A, et al.Alkaline hydrogen peroxide pretreatment of lignocellulosic biomass:Status and perspectives[J].Biomass Conversion and Biorefinery, 2018, 8(1):225-234.
[11] LI N, FENG Z Q, NIU Y G, et al.Structural, rheological and functional properties of modified soluble dietary fiber from tomato peels[J].Food Hydrocolloids, 2018, 77:557-565.
[12] 吴丽萍, 董康珍, 楚文靖, 等.微波改性对燕麦麸膳食纤维结构及功能性质的影响[J].中国食品学报, 2021, 21(9):30-37.
WU L P, DONG K Z, CHU W J, et al.Effects of microwave modification on the structure and functional properties of oat bran dietary fiber[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2021, 21(9):30-37.
[13] JIANG G H, BAI X S, WU Z G, et al.Modification of ginseng insoluble dietary fiber through alkaline hydrogen peroxide treatment and its impact on structure, physicochemical and functional properties[J].LWT, 2021, 150:111956.
[14] 安玉敏. 改性方式对胡麻不溶性膳食纤维理化功能特性及结构的影响[D].临汾:山西师范大学, 2019.
AN Y M.Effects of modification methods on physicochemical functional properties and structure of insoluble dietary fiber from flax seeds[D].Linfen:Shanxi Normal University, 2019.
[15] HE Y Y, LI W, ZHANG X Y, et al.Physicochemical, functional, and microstructural properties of modified insoluble dietary fiber extracted from rose pomace[J].Journal of Food Science and Technology, 2020, 57(4):1 421-1 429.
[16] ULLAH I, YIN T, XIONG S B, et al.Effects of thermal pre-treatment on physicochemical properties of nano-sized okara (soybean residue) insoluble dietary fiber prepared by wet media milling[J].Journal of Food Engineering, 2018, 237:18-26.
[17] SONG P, WU L, GUAN W X.Dietary nitrates, nitrites, and nitrosamines intake and the risk of gastric cancer:A meta-analysis[J].Nutrients, 2015, 7(12):9 872-9 895.
[18] 阮传英, 涂宗财, 王辉, 等.豆渣膳食纤维的体外吸附性能[J].食品科学, 2014, 35(15):109-112.
RUAN C Y, TU Z C, WANG H, et al. In vitro adsorption capacity of dietary fibers from soybean dregs[J].Food Science, 2014, 35(15):109-112.
[19] 王卓, 顾正彪, 洪雁.不同工艺条件制备的马铃薯膳食纤维的物化性能比较[J].食品科学, 2007,28(8):236-240.
WANG Z, GU Z B, HONG Y.Physical properties of three kinds of dietary fibers from potato pulp[J].Food Science, 2007,28(8):236-240.
[20] MA Q Y, MA Z Y, WANG W X, et al.The effects of enzymatic modification on the functional ingredient-dietary fiber extracted from potato residue[J].LWT, 2022, 153:112511.
[21] NYMAN E M G L, MARIA SVANBERG S J.Modification of physicochemical properties of dietary fibre in carrots by mono- and divalent cations[J].Food Chemistry, 2002, 76(3):273-280.
[22] WANG H O, LIU S H, ZHOU X J, et al.Treatment with hydrogen peroxide improves the physicochemical properties of dietary fibres from Chinese yam peel[J].International Journal of Food Science & Technology, 2020, 55(3):1 289-1 297.
[23] HUANG L R, DING X N, ZHAO Y S, et al.Modification of insoluble dietary fiber from garlic straw with ultrasonic treatment[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2018, 42(1):e13399.
[24] MA M M, MU T H.Effects of extraction methods and particle size distribution on the structural, physicochemical, and functional properties of dietary fiber from deoiled cumin[J].Food Chemistry, 2016, 194:237-246.
[25] YANG B, WU Q J, SONG X, et al.Physicochemical properties and bioactive function of Japanese grape (Hovenia dulcis) pomace insoluble dietary fibre modified by ball milling and complex enzyme treatment[J].International Journal of Food Science & Technology, 2019, 54(7):2 363-2 373.
[26] LUO X L, WANG Q, FANG D Y, et al.Modification of insoluble dietary fibers from bamboo shoot shell:Structural characterization and functional properties[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 120(Pt B):1 461-1 467.