酸粥是以糜米和小米等谷物为原料经过发酵而成的一种传统发酵食品，在我国西北部和北部地区较为流行[1]。酸粥的制作方法简单，所需发酵时间短，全年均可制作食用，具有良好的感官品质和营养价值[2]。目前，酸粥的生产仍主要依靠家庭作坊[3]，其制作环境相对开放，因而环境以及原料自身所携带的乳酸菌、酵母菌等微生物为酸粥的发酵提供了天然发酵剂，这也使得传统酸粥中所蕴含的微生物类群结构复杂多样。随着发酵型谷物食品逐渐流行，针对酸粥的研究也愈来愈广泛。郭昊翔[4]研究了酸粥发酵过程中菌群结构与代谢产物及风味的动态变化，结果发现细菌类群与酸粥中的代谢产物和风味有着密不可分的联系。郭璞等[5]将小米酸粥与小米粥的营养成分展开了对比分析，发现相较于小米粥，小米酸粥中含有更多的多酚物质、蛋白质以及更少的淀粉，氨基酸和不溶性纤维素含量也较高，证明了经过发酵的小米酸粥其营养价值要明显高于普通小米粥。此外，有研究表示谷物相较于水果蔬菜来说或许更适合作为发酵基质去开发新型功能食品[6]，它的发酵周期更短，感官品质更好，且发酵后其中的抗营养因子减少，可大大提高谷物的营养吸收率[7]。因而，解析不同地区酸粥中的细菌类群对挖掘适合谷物发酵的优良菌群具有积极的意义。
山西河曲作为酸粥的起源地，制作与食用酸粥的习俗已有悠久的历史。位于内蒙古巴彦淖尔市的五原县处于黄河“几”字湾的最北边，地处河套平原，当地亦有着制作酸粥的习俗。因此，解析河曲酸粥与五原酸粥的细菌类群对全面掌握酸粥微生物类群结构具有一定的参考价值。第二代高通量测序技术作为目前在发酵食品中广泛应用的技术之一，具有快速达到全面扫描样本微生物类群的优势[8]，因而亦适用于解析酸粥中的微生物类群。本研究在采用第二代高通量测序技术解析河曲和五原酸粥细菌类群结构差异的基础上，进一步对两个地区酸粥中的优势细菌属相关关系进行探讨，并揭示两个地区酸粥中细菌基因功能表达上的差异，以期为工业化生产酸粥用菌株选择提供一定的理论参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品采集：本研究分别于山西省忻州市的河曲县和内蒙古自治区巴彦淖尔市的五原县各采集8份酸粥样本，编号分别为XZ1～XZ8(来源于河曲县)和BM1～BM8(来源于五原县)，共计16份样本。所有样本均为不同农户家制作，将样品装入采样瓶后低温运回实验室并保存于-40 ℃备用。
Biowest琼脂糖，上海贝晶生物技术有限公司；Axygen清洁试剂盒，康宁生命科学吴江有限公司；DNeasy mericon Food Kit DNA基因组提取试剂盒，德国QIAGEN公司；正/反向引物338F/806R(338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，上海桑尼生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Vetiri梯度基因扩增仪，美国AB公司；UVPCDS8000凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司；MiSeq高通量测序平台，美国Illumina公司；R920机架式服务器，美国Dell公司。
1.3 实验方法
1.3.1 宏基因组DNA的提取、PCR扩增和高通量测序
DNA提取：样本宏基因组DNA的提取方法参照试剂盒使用说明，将提取出的DNA于4 ℃冰箱放置12 h以便开展后续实验。
PCR扩增和高通量测序：首先将barcode(标签)添加到引物中，再对细菌16S rRNA V3～V4区进行PCR扩增[9]，将质量检测合格的PCR产物寄至上海美吉生物医药科技有限公司完成高通量测序。
1.3.2 序列质控和生物信息学分析
酸粥样本的细菌生物学分析均基于QIIME平台(v1.9.0)完成。采用PyNAST软件对齐序列后，保留满足以下所有条件的有效序列：重叠区≥10 bp、最大错配比率≤0.2、barcode碱基无错配以及引物碱基错配数≤2 bp，并按照序列的97%相似性构建分类操作单元(operational taxonomic units, OTU)[10]，使用Chimera Slayer软件包检查并去除嵌合体OTU[11]，从合格OTU中选取代表性序列上传至RDP[12]和Greengenes[13]数据库进行比对。计算样本菌群的超1指数、发现物种数、香农指数和辛普森指数等α多样性指数[14]，并基于UniFrac距离进行主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)完成样本间细菌群落结构的β多样性分析[15]，最后利用PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)软件预测酸粥中菌群基因功能[16]。
1.3.3 数据处理
使用Origin 2021软件绘制细菌门属相对含量的柱形图，使用R(v4.1.1)绘制α多样性指数的小提琴图、PCoA散点图、优势细菌属相关性热图以及表达存在差异的基因功能哑铃图，并使用Past3软件对两个地区的α多样性指数、优势细菌门属含量以及基因功能的表达进行显著性检验。
2 结果与分析
2.1 两个地区酸粥的细菌群落结构α多样性分析
通过测序共返回756 615条序列，经质控删除掉19条低质量序列，余下756 596条有效序列，按照97%序列相似度共划分到7 095个OTU，平均每个样品含有47 287条有效序列和443个OTU。本研究首先通过超1指数和香农指数等α多样性指数分析了河曲和五原酸粥的细菌类群结构，结果如图1所示。
图1 两个地区细菌群落结构的α多样性分析
Fig.1 Alpha diversity analysis of bacterial community structure in two regions
注：*表示P<0.05，差异显著；***表示P<0.001，差异极显著；ns表示P>0.05，差异不显著(下同)
由图1可知，河曲和五原酸粥的细菌超1指数平均值分别为461和1 722，发现物种数平均值分别为381和1 072，香农指数平均值分别为3.44和4.88，辛普森指数平均值分别为0.71和0.84。显而易见，五原酸粥中菌群的4项α多样性指数均要高于河曲酸粥。经Mann-Whitney检验发现，两个地区的菌群在能够表征物种丰富度的超1指数和发现物种数上存在极显著差异(P<0.001)；在能够表征物种多样性的香农指数上存在显著差异(P<0.05)，而在辛普森指数上差异不显著(P>0.05)。由此可见，五原酸粥中的细菌丰富度和多样性均要显著高于河曲酸粥。
2.2 酸粥样本中细菌群落结构的β多样性分析
为进一步了解它们各自的细菌群落结构特征，在解析了两个地区酸粥中细菌类群的α多样性后，本研究基于加权OTU的UniFrac距离PCoA分析了两个地区中酸粥细菌群落结构的β多样性，结果如图2所示。
图2 基于加权OTU的UniFrac距离PCoA
Fig.2 PCoA of UniFrac distance based on weighted OTU
如图2所示，在基于加权OTU的PCoA散点图中，PCoA1和PCoA2分别占比48.19%和25.33%。在选择了95%置信区间时，两个地区的样本在空间排布中虽未表现出明显的分离趋势，但仍可看出不同地区样本在空间中有着不同的聚集趋势。例如，五原酸粥样本较为紧密地聚集在二四象限的对角线附近，而河曲酸粥样本则较为分散地排布在原点附近和二三象限中。此外，五原酸粥样本的置信圈范围远远小于河曲酸粥，这说明五原酸粥样本的组内距离要小于河曲酸粥，即五原地区酸粥的细菌类群结构较为相似，而河曲地区酸粥的菌群结构间有一定的不同。由此可见，不仅河曲和五原酸粥中细菌菌群之间存在差异，河曲地区的不同酸粥样本间可能亦有着一定的差异。
2.3 基于门和属水平酸粥细菌群落结构分析
通过解析两个地区酸粥细菌类群的α多样性和β多样性发现，它们的细菌类群结构存在着显著差异。本研究进一步基于门和属水平分析酸粥中的细菌类群，以揭示导致产生差异的具体菌群。本研究仅针对优势门和优势属(平均相对含量>1.0%)展开分析，结果图3所示。
图3 优势细菌门的相对含量分析
Fig.3 Relative content analysis of dominant bacterial phylum
由图3可知，两个地区的酸粥样本中共有2个优势门，分别为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，其相对含量分别为75.85%和23.31%，其中Firmicutes在河曲和五原酸粥中的含量分别达67.27%和84.43%，可见酸粥中的细菌类群绝大多数隶属于Firmicutes和Proteobacteria。然而经Mann-Whitney检验发现五原酸粥中Firmicutes相对含量显著低于河曲酸粥(P<0.05)。本研究进一步从属水平解析了两个地区的酸粥细菌类群，如图4所示。
图4 优势细菌属的相对含量分析
Fig.4 Relative content analysis of dominant bacterial genera
由图4可知，两个地区的酸粥样本中共有12个优势属，它们分别为隶属于Firmicutes的乳酸杆菌属(Lactobacillus，41.95%)、醋杆菌属(Acetobacter，14.10%)、芽孢杆菌属(Bacillus，6.72%)、梭菌属(Clostridium，6.69%)、戊糖片球菌(Pediococcus，5.36%)、链球菌属(Streptococcus，4.39%)、乳球菌属(Lactococcus，3.88%)、魏斯氏菌属(Weissella，2.57%)、肠杆菌属(Enterobacter，2.31%)、真杆菌属(Eubacterium，1.70%)和肠球菌属(Enterococcus，1.04%)；隶属于Proteobacteria的气单胞菌属(Aeromonas，1.60%)。经Mann-Whitney检验，Acetobacter和Weissella在五原酸粥中相对含量显著偏高(P<0.01)，其相对含量分别为27.52%和4.01%，而在河曲酸粥中分别仅为0.67%和1.06%。由此可见，两个地区的酸粥其菌群结构的差异主要体现在Firmicutes、Acetobacter和Weissella这些细菌类群中。地域环境、制作方法和原料品质的差异均会导致样本中微生物类群产生差异，这一现象在CAI等[17-18]对另一类谷物发酵食品——鲊广椒的研究中得到了证实。
此外，在王玉荣[19]解析广西、山西和内蒙古地区酸粥中细菌类群的研究中，相对含量排名前3的优势属与本研究完全一致，这说明Lactobacillus、Acetobacter和Bacillus是酸粥中较为常见且广泛存在的细菌类群。较之其他优势属，Lactobacillus和Acetobacter具有更强的耐酸特性[20]，因而它们在酸粥(pH值为3.0～4.0)中会表现出更强的生命力；同时有研究表明，Bacillus在一般的大气条件(如热、湿气和酸性条件等)均具有高度适应性[21]，因而亦能较好的适应酸粥的内环境。值得一提的是，优势属中乳酸菌类群累计平均相对含量为59.19%，分别为Lactobacillus、Pediococcus、Streptococcus、Lactococcus、Weissella和Enterococcus，其中以Lactobacillus为主。目前许多关于酸粥菌群的研究亦得出了这一结论，如任宇婷等[22]在广西酸粥中发现Lactobacillus为含量最高的细菌属，乌有娜等[23]对加引子发酵的酸粥其不同发酵时期微生物类群演替进行解析时发现Lactobacillus在酸粥的各个发酵时期始终处于主导地位，这些现象亦可能与Lactobacillus的耐酸特性有关。由此可见，尽管两个地区的酸粥其细菌类群结构存在明显差异，但存在差异的优势菌属较少，这说明两个地区的酸粥中有着较多共同的优势菌群，二者差异主要体现在丰度较低较为特殊的菌群上。
2.4 优势细菌属间的相关性分析
通过上述研究发现不同地区的酸粥中有着较多相同优势菌群，为明确不同优势属在酸粥发酵过程中的相互作用关系，本研究进一步做了优势属之间的相关性分析，结果如图5所示。
由图5可知，Lactobacillus与Enterococcus呈现显著负相关关系(R=-0.503，P<0.05)；Clostridium与Weissella呈现显著正相关关系(R=0.546，P<0.05)，Lactococcus与Acetobacter(R=0.986，P<0.001)和Enterococcus(R=0.895，P<0.001)呈现极显著正相关关系；Aeromonas与Enterococcus呈现极显著正相关关系(R=0.901，P<0.001)。值得注意的是，在具有显著相关关系的菌属间除了Lactobacillus和Enterococcus为负相关关系外，其他优势属之间均为正相关关系，这或许是与Lactobacillus具有抑菌特性相关。有研究表明Lactobacillus能利用碳水化合物产生乳酸和乙酸等酸性物质，其自身亦能分泌细菌素，这些酸与细菌素能起到一定的抑菌作用[24-25]。可见，除了Lactobacillus之外，酸粥中的优势属在酸粥的发酵过程中大多表现为共生关系。
图5 基于优势细菌属的相关性热图
Fig.5 Heat map of correlation based on dominant bacterial genera
注：气泡越大表示相关性系数的绝对值越大
2.5 两个地区酸粥细菌类群的基因功能差异分析
在探究了河曲和五原酸粥的细菌类群结构差异以及优势属相关性后，本研究进一步利用PICRUSt软件预测了两个地区酸粥中菌群的基因功能及表达差异。所有OTU经过分析共得到了4 349个蛋白质同源群簇(clusters of orthologous groups of proteins，COG)，分别注释到了23个功能大类，两个地区酸粥中的菌群在12个基因功能大类上的表达存在显著差异，如图6所示。
由图6可知，五原酸粥的菌群在12个功能大类上的表达均要显著高于河曲酸粥，其在复制、重组和修复功能表达上存在非常显著的差异(P<0.01)，在染色质结构与动力学上的表达存在极显著差异(P<0.001)。这些基因功能表达存在显著差异的原因可能是两个地区酸粥中存在差异的菌群所导致的。
图6 不同地区酸粥的细菌类群基因功能差异分析
Fig.6 Analysis of gene function differences of bacterial taxa in different regions of acid porridge
3 结论
河曲酸粥与五原酸粥在细菌菌群结构上存在显著差异，主要表现为河曲酸粥的细菌丰富度和多样性显著低于五原酸粥。两个地区酸粥中的优势细菌类群主要为隶属于Firmicutes的Lactobacillus、Acetobacter和Bacillus等，其中五原酸粥的Acetobacter和Weissella含量显著高于河曲酸粥。因而虽然两个地区酸粥菌群结构存在差异，但仍拥有较多的共同优势菌群，并且优势菌群间大多表现为正相关关系，仅有Lactobacillus和Enterococcus表现为显著负相关关系。通过基因预测发现两个地区酸粥中的菌群在12个基因功能大类上存在显著差异。
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