山楂为传统药食两用中药，《中国药典》规定药用山楂为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实[1]，习称“北山楂”；具有消食健胃，行气散瘀，化浊降脂的功效，现代药理研究表明，山楂具有保护心脑血管系统、降糖、降压、降血脂改善代谢综合征等作用[2-9]。野山楂为蔷薇科植物野山楂Crataegus cuneata Sieb.& Zucc.的干燥成熟果实，习称“南山楂”。南北山楂均含有机酸、黄酮类、黄烷类、三萜类、挥发性成分、氨基酸类以及微量元素等多种成分[10-14]。

山楂中的有机酸类成分具有促进胃肠运动的作用[15]，被认为是山楂健胃消食、改善血液循环、降低高血压和高脂血症的关键生物活性化合物之一[16]，同时也是山楂风味的重要组成。由于山楂中的强极性有机酸类(如枸橼酸、苹果酸)等在常规C18反相色谱柱分离较困难，目前针对山楂中有机酸类成分主要采用电位滴定法[17-18]、近红外漫反射光谱法[19]、电化学微反应器技术[20]进行总量的测定。相关研究表明，山楂中的总有机酸含量高于野山楂[21]，但具体成分含量差异尚不明确。然而，在开展多成分含量测定时，每个成分均需要对照品，分析成本较高。一测多评法通过研究在一定的色谱条件下，待测化学成分间响应值的内在函数或者比例关系，可实现采用一个对照品(简单易得的成分)对多个成分进行含量测定，适用于多指标质量控制与评价[22-23]。本研究针对山楂中的有机酸类成分，采用适合于酸性纯水分析的ZORBAX SB-Aq柱，建立了山楂和野山楂强极性有机酸的HPLC指纹图谱及同时多成分含量测定的一测多评分析方法，对山楂及野山楂样品进行研究，以期为山楂质量控制及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂样品(Crataegi Fructus,CF)为从产地采收蔷薇科植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的成熟果实(CPF)14批、山里红Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br.的成熟果实(CPMF)10批，以及从市场收集山楂饮片(CFYP)9批；野山楂样品(Crataegi Cuneata Fructus,CCF)为从产地采收野山楂Crataegus cuneata Sieb. & Zucc.的成熟果实10批。自行采收的果实经低温干燥后，贮存备用；市场收集的山楂饮片均为切片。样品具体信息见表1。

对照品：枸橼酸(批号：100396-201603，纯度HPLC≥98%)，L-苹果酸(批号：190014-201302，纯度HPLC≥98%)，购自中国食品药品检定研究院；D-奎宁酸(批号：PS0713-0120MG，纯度HPLC≥98%)，购自成都普思生物科技股份有限公司；水为超纯水，其余试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪，美国Agilent公司；KH 500DB超声波提取器，昆山禾创超声仪器有限公司(中国)；Sartorius QUINTIX 224-1CN万分之一、35-1CN十万分之一电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱分离采用Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；以0.1%磷酸溶液为流动相，等度洗脱20 min，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。对D-奎宁酸、L-苹果酸和枸橼酸对照品溶液进行全波长扫描，其最大吸收波长均在210 nm左右(图1)，因此选择检测波长为210 nm。

1.3.2 供试品溶液制备

对照品溶液的制备取D-奎宁酸、L-苹果酸、枸橼酸对照品适量，精密称定，加纯水制成质量浓度分别为3.83、5.40、19.75 mg/mL的混合对照品储备液。

供试样品溶液的制备取山楂样品粉末(过四号筛)0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯水15 mL，摇匀，超声30 min，放冷，补足失重，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

2.1.1 线性范围考察

将对照品储备液分别稀释得到不同梯度质量浓度的混合对照品溶液，在上述的色谱条件下进样分析，各个梯度平行进样3次，测定峰面积，以质量浓度(mg/mL)为横坐标(x)，峰面积(mAU)为纵坐标(y)，绘制标准曲线。将对照品溶液进一步稀释后进样分析，以信噪比(S/N)分别为3和10时的浓度记为该化合物的检测限和定量限。取该线性范围考察的7个浓度的对照品溶液每份分析3次，记录峰面积，按公式(1)计算相对校正因子，以D-奎宁酸为内标物分别计算L-苹果酸、枸橼酸的相对校正因子(relative correction factor, RF)，结果见表2。

RF=(As/Cs)/(Ai/Ci)

(1)

式中：As为内标峰面积；Cs为内标浓度；Ai为待测物峰面积；Ci为待测物浓度。

2.1.2 精密度考察

取对照品溶液，在上述色谱条件下，于同一日内连续进样6次，记录D-奎宁酸、L-苹果酸、枸橼酸峰面积，各成分峰面积相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)分别为0.07%、0.08%、0.05%，表明仪器日内精密度良好；连续3日，每日进样分析3次，记录各成分峰面积，各成分峰面积RSD分别为1.55%、0.90%、0.81%，表明仪器日间精密度良好。同时按照供试品溶液制备方法以山楂样品(CPF-5)制备供试品溶液，同样在上述建立好的色谱条件下于同一日内连续进样6次，用相似度评价软件计算，测得的各色谱与其所得共有模式图的相似度均为1.000，结果表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性考察

平行称量6份山楂样品(CPF-5)，按照供试品制备方法制备样品，在同样的色谱条件下进样分析，各成分峰面积RSD分别为1.91%、0.47%、1.84%；用相似度评价软件计算，各色谱图与其所得共有模式的相似度分别均为1.000，结果表明该方法重复性良好。

2.1.4 稳定性考察

取山楂样品(CPF-5)制备的供试品溶液，在已经建立好的色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析，各成分峰面积RSD分别为0.93%、0.77%、1.63%；相似度计算结果显示，2～24 h测得的色谱图与0 h色谱图相似度分别为0.995、0.993、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000，结果表明样品在24 h内稳定性良好。

2.1.5 准确度考察

准确性采用加样回收率试验来考察。精密称取已知含量的山楂样品(CFYP-5)0.25 g，平行6份，分别精密加入待测化合物的对照品适量，按上述的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在已经建立好的色谱条件下进样分析，测定峰面积，各成分的平均回收率分别为105%、98%、94%，RSD分别为1.94%、2.06%、2.59%，结果表明该方法可靠。

2.1.6 相对校正因子的耐用性考察

采用不同厂家、型号的液相色谱仪和不同品牌的色谱柱(规格均为4.6 mm×250 mm, 5 μm)进行校正因子耐用性考察，见表3。结果表明，校正因子RSD<3%，表明各成分的相对校正因子耐用性良好。

2.2 山楂与野山楂指纹图谱的建立

将33批山楂样品以及10批野山楂样品所得的色谱数据以CDF格式导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》。以CPMF-1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.1 min，中位数法生成对照谱，经全谱峰匹配后生成的33批山楂及10批野山楂样品的叠加图谱和对照指纹图谱(R)，共标定3个共有峰，通过与对照品比对，1号峰为D-奎宁酸，2号峰为L-苹果酸，4号峰为枸橼酸，见图2～3。

2.3 含量测定结果

采用一测多评法(quantitative analysis of multi-components by single marker, QAMS)和标准曲线法(standard curve method, SCM)对33批山楂样品以及10批野山楂样品中的3个有机酸类成分进行含量测定，结果见表4。按照公式(2)对3个有机酸类总含量进行准确度评价。计算得到有机酸类成分准确度为98.78%～105.67%，且RSD<1.34%，说明建立的一测多评法用于山楂及野山楂样品的多成分含量测定与标准曲线法测定结果较为一致。

准确度

(2)

式中：Cq为一测多评法测定结果，Cs为标准曲线法测定结果。

2.4 山楂与野山楂比较分析

2.4.1 相似度分析

以CPMF-1为参照，时间窗宽度设置为0.1 min，中位数法生成对照谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》对各批次样品图谱进行相似度评价，见表5。结果表明，33批山楂样品与参照图谱CPMF-1的相似度在0.983～1.000，10批野山楂样品与参照图谱CPMF-1相似度在0.289～0.432，说明山楂与野山楂样品之间化学信息差异较大。

2.4.2 聚类分析

采用IBM SPSS Statistics 23.0(SPSS Inc., Chicago, IL)软件，以山楂与野山楂样品中共有的3个有机酸含量为变量，采用瓦尔德法对33批山楂及10批野山楂样品进行聚类分析，结果见图4，由结果可知，当判别条件距离为5时，33批山楂及10批野山楂样品被明显分开，这与指纹图谱相似度评价的结果一致，说明山楂与野山楂样品的质量有明显的差异。

2.4.3 主成分分析(principal component analysis，PCA)及偏最小二乘法-判别分析(partial least squares method-discriminant analysis，PLS-DA)

以山楂与野山楂样品中共有的3个有机酸含量为变量导入SIMCA 14.1(Sartorius Stedim., Sweden)软件进行PCA和PLS-DA分析，结果见图5，山楂样品与野山楂样品各自聚为两簇，结果与指纹图谱以及聚类分析的结果一致，表明通过3个有机酸的含量可以对山楂和野山楂进行区分。3个有机酸在PLS-DA模型中的VIP值从大到小依次为枸橼酸、D-奎宁酸、L-苹果酸，其中的枸橼酸和D-奎宁酸的VIP > 1.0。结合定量和化学计量学分析结果可知，山楂和野山楂所含的酚酸类成分有明显区别；山楂中的CPF和CPMF有机酸成分也比较接近，但切制成饮片(CFYP)后，其有机酸含量则会有一定程度的降低。

3 结论

本实验以33批山楂和10批野山楂样品建立了山楂与野山楂强极性的有机酸的指纹图谱，发现山楂与野山楂所含有的有机酸类成分存在较大差异；进一步以D-奎宁酸为内参物，建立L-苹果酸与枸橼酸的相对校正因子，可同时对山楂与野山楂中D-奎宁酸、L-苹果酸与枸橼酸进行含量测定。对33批山楂和10批野山楂的测定结果显示，山楂中枸橼酸、L-苹果酸的含量远高于野山楂，而野山楂中以D-奎宁酸含量则远高于山楂。以3个有机酸类成分含量为变量进行聚类分析、主成分分析、偏最小二乘法-判别分析，山楂与野山楂样品各自聚为一簇，说明可以通过含量差异鉴别山楂与野山楂，其中枸橼酸和D-奎宁酸为山楂和野山楂中含量差别最大的成分。本文采用HPLC指纹图谱进行定性分析结合一测多评法对3个有机酸类成分进行定量分析，为山楂的质量评价及应用提供参考。

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Comparative study of organic acids in Crataegi Fructus and Crataegi Cuneata Fructus by HPLC fingerprint combined with quantitative analysis of multi-components by single marker

XU Shuhong1,2，ZHOU Hui2，WANG Huiying2，GAO Wen2*，LI Ping1,2*

1(School of Traditional Chinese Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)2(State Key Laboratory of Natural Medicines, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

ABSTRACT An analytical column of Agilent ZORBAX SB-Aq (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used to establish HPLC fingerprints of Crataegi Fructus (CF) and Crataegi Cuneata Fructus (CCF). With D-quinic acid as the internal reference, a quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS) method of D-quinic acid, L-malic acid, and citric acid hydrate was established. A total of 33 batches of CF and 10 batches of CCF were analyzed by fingerprint similarity analysis, hierarchical cluster analysis (HCA), principal component analysis (PCA), and partial least squares method-discriminant analysis (PLS-DA). Results showed that there were significant differences between CF and CCF in organic acids. The total amount of three organic acids in CF [(13.02±2.85)%] was significantly higher than that in CCF [(7.02±0.62)%]. Among them, the content of citric acid in CF was the highest [(8.94±2.00)%], followed by the L-malic acid. The content of D-quinic acid in CCF was the highest [(6.32±1.00)%]. The research on organic acids in CF and CCF could provide a reference for the quality evaluation and variety optimization of CF.

Key words fingerprints; quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS) method；D-quinic acid;citric acid hydrate;L-malic acid

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032157

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第一作者：硕士研究生(高雯副教授和李萍教授为共同通信作者，E-mail:gw_cpu@126.com；liping2004@126.com)

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81872998)；国家重点研发计划项目(2018YFC1707300)

收稿日期：2022-04-28，改回日期：2022-06-07