N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)是葡萄糖2位上的羟基(—OH)被乙酰氨基(—CH3CONH2)取代后的化合物，在软骨和关节组织的修复方面具有重要作用[1-2]。化学法、酶法和微生物发酵法是GlcNAc的主要生产方法。其中，化学法由于其剧烈的反应条件、严重的环境污染以及有限的生产原料具有很大的局限性[3-4]；酶法则受限于高昂的生产成本以及较长的生产周期，很难实现工业化大规模生产[5]。与前两种方法相比，微生物发酵法具有生产周期短、成本低、污染小等优势，受到了研究人员的广泛关注[6]。
通过微生物代谢调控可实现GlcNAc的高效合成[7-8]。目前，国内外研究生产GlcNAc的工程菌株主要为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在E.coli中，LU等[9]基于代谢网络模型等代谢工程策略和发酵过程优化技术，将GlcNAc在摇瓶内的产量提高到128.7 g/L。然而，由于E.coli不是食品安全级菌株，未能达到氨基葡萄糖生产的食品级要求，限制了其应用范围。DENG等[10]采用代谢工程与蛋白质工程等策略逐步提升C.glutamicum工程菌株的GlcNAc生产能力，摇瓶产量达到36.9 g/L。但是C.glutamicum是氨基酸生产菌，副产物可能含有大量氨基酸。
作为一种革兰氏阳性模式工业微生物和食品安全微生物，B.subtilis具有遗传背景清晰、代谢调控技术成熟、不易感染噬菌体等优势[11-12]。本课题组在前期以B.subtilis为宿主，利用葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS作为调控工具对GlcNAc的代谢网络(图1-a)进行了系统调控[13-15]。通过代谢组学分析发现，在发酵过程中GlcNAc的前体N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸(N-acetylglucosamine 6-phosphate, GlcNAc6P)会过量积累，引起磷酸糖胁迫，进而出现二次生长现象，并显著降低了GlcNAc的合成。转录组学分析结果表明，磷酸糖胁迫过程中编码一个转录因子GlcR和一个卤酸脱卤酶(haloacid dehalogenase，HAD)样磷酸酶YwpJ的glcR-ywpJ操纵子的表达量显著上调。敲除glcR能够解除磷酸糖胁迫对细胞生长的抑制作用，但也会导致糖转运相关基因ptsG的显著下调，进而降低GlcNAc产量[16]，因此，单独敲除glcR并不能增强GlcNAc的合成。磷酸酶YwpJ是一种酸性磷酸酶，能够脱去GlcNAc6P的磷酸基团形成GlcNAc[17]。过表达YwpJ能够显著降低胞内GlcNAc6P浓度，从而解除磷酸糖胁迫[16]。然而，目前对于磷酸糖胁迫条件下，转录因子GlcR对ptsG和glcR-ywpJ操纵子的具体调控机制尚不明确，因此，开发一种既不影响糖转运又能提高磷酸酶YwpJ表达量的方法对于增强GlcNAc的合成具有重要的意义。
在课题组前期研究的基础上，本文首先通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技术分析了磷酸糖胁迫对于glcR-ywpJ操纵子转录水平的影响，并通过凝胶迁移率(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验明确了转录因子GlcR与自身启动子PglcR的结合能力；其次，利用易错PCR技术构建glcR-ywpJ操纵子的启动子突变体文库；然后，结合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)建立高通量筛选系统，对转录因子GlcR和启动子PglcR的关键结合位点进行筛选；最后，通过敲除结合位点解除GlcR对启动子PglcR的抑制作用，实现在不影响糖转运的情况下持续表达磷酸酶YwpJ，最终有效提高GlcNAc的产量，摇瓶产量达到18.21 g/L。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒
本研究中使用的菌株和质粒见表1。B.subtilis 168，FMIK为本研究选取的出发菌株。菌株和质粒群保藏在本实验室。
表1 本研究所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
名称特性来源菌株E.coli JM109recA1, endA1, thi, gyrA96, supE44, hsdR17 (lac-proAB)/F’[traD36, proAB+, lacIq, lacZ实验室保藏FMIKB.subtilis 168衍生菌株,ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagA ΔnagB Δldh Δpta ΔglmS ribozyme-trp-P43-anti-pfkA-glmMglmS ribozyme sRNA-anti-pgiglmS ribozyme M9 sRNA::lox72实验室保藏Bs168-01B.subtilis 168 衍生菌株,将glcR-ywpJ操纵子的启动子PglcR替换为启动子Pgrac本研究Bs168-02Bs168-01 衍生菌株,转化pPglcR -gfp本研究Bs168-03Bs168-01 衍生菌株,转化pPglcR-m1 -gfp本研究Bs168-04Bs168-01 衍生菌株,转化pPglcR-m2 -gfp本研究Bs168-05Bs168-01 衍生菌株,转化pPglcR-m3 -gfp本研究Bs168-06Bs168-01 衍生菌株,转化pPglcR-m4 -gfp本研究FMIK-m4FMIK衍生菌株,将glcR-ywpJ操纵子的启动子PglcR替换启动子PglcR-m4本研究质粒pP43NMKE.coli-B.subtilis穿梭质粒,P43启动子实验室保藏pHT01E.coli-B.subtilis穿梭质粒,Pgrac启动子实验室保藏p7Z6pMD18-T插入lox71-zeo-lox66表达盒实验室保藏pTSCEmrAmpr,B.subtilis中为温度敏感型质粒实验室保藏pP43-gfppP43NMK衍生质粒,插入基因gfp,P43启动子本研究pPglcR-gfppP43-gfp衍生质粒,将P43启动子替换为PglcR启动子本研究pPglcR-ep-gfppP43-gfp衍生质粒,将P43启动子替换为PglcR-ep启动子本研究pPglcR-m1 -gfppP43-gfp衍生质粒,将P43启动子替换为PglcR-m1启动子本研究pPglcR-m2-gfppP43-gfp衍生质粒,将P43启动子替换为PglcR-m2启动子本研究pPglcR-m3-gfppP43-gfp衍生质粒,将P43启动子替换为PglcR-m3启动子本研究pPglcR-m4-gfppP43-gfp衍生质粒,将P43启动子替换为PglcR-m4启动子本研究
1.1.2 培养基与试剂
Luria-Bertani(LB)培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸提物5，NaCl 10。121 ℃灭菌20 min。
所用抗生素及质量浓度分别为卡那霉素25 μg/mL，氨苄青霉素100 μg/mL，博来霉素25 μg/mL。
摇瓶发酵培养基(g/L)：酵母粉12，蛋白胨6，(NH4)2SO4 6，K2HPO4·3H2O 12.25，KH2PO4 2.5，MgSO4·7H2O 3，FeSO4·7H2O 0.04，CaCl2 0.04，一水合谷氨酸钠5，尿素2.5，葡萄糖100。115 ℃灭菌20 min。
Prime STAR(max)DNA聚合酶、DNA marker、SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒，TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶，南京诺唯赞生物科技有限公司；Seamless Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)、QuickMutationTM基因随机突变试剂盒，碧云天生物技术有限公司；其他分子操作相关试剂盒，上海生工生物工程有限公司；其他常规试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 质粒与菌株构建
本研究所用质粒均通过一步克隆法进行构建，所用引物见表2。以pP43-gfp质粒为例：使用引物GFP-P43-F/R扩增带有pP43NMK载体插入位点上下游20 bp同源臂的gfp片段；使用引物P43-GFP-F/R将pP43NMK载体在插入位点进行线性化。利用Seamless Cloning Kit将gfp片段与pP43NMK载体进行重组，构成质粒pP43-gfp。
表2 本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study
引物名称碱基序列(5′-3′)P43-GFP-FCTGCAGAAGCTTGGCGTAATCAP43-GFP-RGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTAPglcR-P43-FTTTTTTGAGCAACTGGATCCCACCCCTGCTCCTCCCGTTATCTATPglcR-P43-RAGTTCTTCTCCCTTACCCATGCCCTCATTCCTTTTCTCAGCAAP43-PglcR-FATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACTP43-PglcR-RGGATCCAGTTGCTCAAAAAAATCTCGGPglcR-ep-FCACCCCTGCTCCTCCCGTTATCTATPglcR-ep-RGCCCTCATTCCTTTTCTCAGCAATP43-PglcR-ep-FCTGAGAAAAGGAATGAGGGCATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACTP43-PglcR-ep-RTAACGGGAGGAGCAGGGGTGGGATCCAGTTGCTCAAAAAAATCTCGGPglcR-m1-FGGTTCTCTCGACGCATTTTTAAATCACTTATTAATGTTGAATAAAATCAAAPglcR-m1-RTCAACATTAATAAGTGATTTAAAAATGCGTCGAGAGAACCAATTTTTCPglcR-m2-FTCTCGACGCATTTTTAAATCTAATGTTGAATAAAATCAAATAAAAACTTATAATTPglcR-m2-RTTGATTTTATTCAACATTAAGATTTAAAAATGCGTCGAGAGAACCAATPglcR-m3-FTTGAATAAAATCAAATAAAATAATTACTTATAAATGATTGCTGAGAAAAGGPglcR-m3-RCAATCATTTATAAGTAATTATTTTATTTGATTTTATTCAACATTAAGATTTAAAAPglcR-m4-FTAAAATCAAATAAAATAATTTAAATGATTGCTGAGAAAAGGAATGAGGGPglcR-m4-RCTTTTCTCAGCAATCATTTAAATTATTTTATTTGATTTTATTCAACATTAAGATTTPgarC-up-FGAATCAATTTCGTTTAAAAGAAATTTATATTGACGGCGPgarC-up-RACGCTTACATCATTCTTTTCTCAATCAGCAGCTTTTTCCCGGGPgarC-down-FCATACATTATACGAACGGTAGTGTACCAAGAAGAAAGATTAGTAGCGATTTPgarC-down-RAATCGCAATTAATTTCACGTTTGTCAGTCPgraC-FGGGAAAAAGCTGCTGATTGAGAAAAGAATGATGTAAGCGTGAAAAATTPgraC-RCTATACGAACGGTATCTCTAAAAATAAACCTCCTTTCTTTTACTTACCCzeo-FAAAGAAAGGAGGTTTATTTTTAGAGATACCGTTCGTATAGCATACATTzeo-RAAAGAAAGGAGGTTTATTTTTAGAGATACCGTTCGTATAGCATACATTPglcR-m4-up-FGAATCAATTTCGTTTAAAAGAAATTTATATTGACGGCGPglcR-m4-up-RTAACGGGAGGAGCAGGGGTGTCAATCAGCAGCTTTTTCCCGGPglcR-m4-down-FCTGAGAAAAGGAATGAGGGCGTGTACCAAGAAGAAAGATTAGTAGCGATTPglcR-m4-down-RCTGAGAAAAGGAATGAGGGCGTGTACCAAGAAGAAAGATTAGTAGCGATTPglcR-m4-rh-FGGGAAAAAGCTGCTGATTGACACCCCTGCTCCTCCCGTTATPglcR-m4-rh-RAATCTTTCTTCTTGGTACACGCCCTCATTCCTTTTCTCAGCAATCPglcR-EMSA-FTTTATATTGACGGCGTTCCTTCTGPglcR-EMSA-RGCCCTCATTCCTTTTCTCAGCAAglcR-q-FCGGTACAATCAACCGCATTCAglcR-q-RTACAGCGCGACGAGATCTTGTGywpJ-q-FCCCATCGCTACACCTTTTCCCywpJ-q-RGAAAAGCTTGAGGCAGGCTGG
B.subtilis突变体构建则采用cre/lox系统进行同源重组[18]，所用引物见表2。以菌株BS168-01为例：使用引物PglcR-up-F/R和PglcR-down-F/R，以B.subtilis 168基因组为模版扩增PglcR上下游800 bp的同源臂；使用引物Pgrac-F/R，以pHT01载体为模版扩增Pgrac启动子插入片段；使用引物zeo-F/R，以质粒p7Z6为模板，扩增博来霉素基因zeo。然后通过融合PCR将4段片段融合成一个片段，纯化后转化至B.subtilis 168感受态细胞中，通过博莱霉素标记进行筛选[19]。然后将带有特异性重组酶Cre的表达质粒pTSC转入阳性克隆感受态细胞中，经IPTG诱导12 h后涂布于不含抗生素的LB平板上，再在50 ℃摇床中振荡培养24 h，在LB平板上划线分离，然后再次经菌落PCR验证消除博来霉素抗性基因的菌株为阳性克隆。
1.2.2 qRT-PCR分析glcR-ywpJ操纵子转录水平
利用RNA提取试剂盒提取FMIK菌株总RNA，然后反转录得到cDNA。使用引物16S rRNA-q-F/R、glcR-q-F/R和ywpJ-q-F/R，以cDNA为模版，利用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行转录水平分析，所用引物见表2。
1.2.3 EMSA分析GlcR与PglcR的结合能力
参考HUANG等[20]所述的方法对GlcR蛋白进行纯化和定量分析。使用PglcR-EMSA-F/R，以B.subtilis 168基因组为模版，扩增带有5′-生物素标记的PglcR片段用于EMSA分析。EMSA结合反应液配制方法如表3所示。EMSA结合反应液配制好后需在冰上放置至少15 min，然后加入5 μL的上样缓冲液5×Loading Buffer，混匀后立即加入60 g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶，100 V恒压电泳约2 h至溴酚蓝跑到凝胶底部。电泳结束后取下凝胶，在转膜槽中恒流380 mA电转30 min。转膜完成后再在120 mJ/cm2的条件下，254 nm紫外交联1 min。最后利用化学发光法检测生物素标记的DNA。所用引物见表2。
表3 EMSA结合反应液
Table 3 Binding reactions for EMSA
组分不加蛋白的对照组/μL加蛋白的实验组/μL蛋白液 4ddH2O13910×Binding Buffer22Poly(dl·dC)11探针44总体积2020
1.2.4 基于荧光检测的PglcR易错突变体库高通量筛选系统构建
使用引物PglcR-ep-F/R，以B.subtilis 168基因组为模版，利用QuickMutationTM基因随机突变试剂盒获得PglcR的易错突变体库。参照1.2.1质粒的构建方法，获得质粒pPglcR-ep-gfp。将质粒转入Bs168-01菌株的感受态细胞中，涂布在含有25 μg/mL卡那霉素的LB平板上，得到带有PglcR的易错突变体库的Bs168-01转化子。向96孔板中加入100 μL含卡那霉素抗性的LB培养基，然后将所有转化子接入96孔板中，37 ℃，220 r/min培养6 h后加入IPTG(终浓度1 mmol/L)继续培养1、2、3、4、5、6、9、12 h后将96孔板放入酶标仪中测量菌液在488 nm波长激发下525 nm处的发光值。所用引物见表2。
1.2.5 PglcR结合位点缺失突变体的构建
使用引物PglcR-m1-F/R，以PglcR-gfp质粒为模版，得到的PglcR-m1-gfp片段为PglcR-gfp质粒除去actta部分的线性化片段，线性化片段的两端分别带有另一端20 bp的同源序列。将PglcR-m1-gfp片段转入E.coil JM109菌株的感受态细胞中，通过同源重组得到PglcR-m1-gfp环形质粒。将PglcR-m1-gfp质粒转入Bs168-01菌株的感受态细胞中，利用卡那霉素进行筛选，得到Bs168-03菌株。PglcR-m2-gfp、PglcR-m3-gfp、PglcR-m4-gfp以及Bs168-04、Bs168-05、Bs168-06菌株则是采用同样方法依次构建。所用引物见表2。
1.2.6 细胞生长、GlcNAc产量以及GlcNAc6P检测方法
细胞生长通过监测600 nm处的吸光值(OD600)来记录。
GlcNAc的HPLC检测方法：色谱仪为Agilent 1260液相系统，检测器为示差检测器，检测器温度为35 ℃，色谱柱型号为Aminex® HPX-87H，色谱柱温度设定为40 ℃，所用流动相为5 mmol/L稀硫酸，流速0.6 mL/min。
GlcNAc6P的HPLC检测方法：色谱仪为Agilent 1260液相系统，色谱柱为氨基柱。流动相A为95%乙腈、5%水和10 mmol/L碳酸氢铵。流动相B是含10 mmol/L碳酸铵和0.2%(体积分数)氢氧化铵的水(最终pH=10.4)。梯度洗脱条件为0 min 10% B;2 min10% B;3 min 45% B;8 min 48% B;8.1 min 60% B;11 min 60% B;11.5 min 10% B;18 min 10% B。整个过程的流速为0.2 mL/min。
2 结果与分析
2.1 磷酸酶胁迫过程中转录因子GlcR对glcR-ywpJ操纵子的转录水平影响分析
本课题组前期通过强化GlcNAc前体葡萄糖6磷酸(glucose-6-phosphate，Glc6P)的供应得到一株B.subtilis工程菌株FMIK[10]。然而，该菌株在摇瓶培养过程中出现了二次生长的现象(图1-b)。我们通过qRT-PCR分别检测了野生型菌株B.subtilis 168和FMIK中glcR和ywpJ基因的转录水平。与B.subtilis 168相比，FMIK菌株培养16 h后glcR和ywpJ的转录水平显著提高，分别提高了3.39倍和2.88倍。培养18 h后glcR和ywpJ的转录水平明显降低(图1-c)。然后，通过EMSA实验检测了GlcR与自身启动子PglcR的结合能力，结果表明，GlcR确实能够与PglcR结合，其结合能力随蛋白浓度的提高而增强(图1-d)。同时，我们在B.subtilis 168菌株的基础上将glcR-ywpJ操纵子的启动子替换成受IPTG诱导表达的Pgrac启动子，得到工程菌株Bs168-01。然后，我们在pP43NMK载体的基础上将P43 启动子区域替换为PglcR，并连上GFP编码基因gfp，构成pPglcR-gfp载体。将pPglcR-gfp质粒转入Bs168-01菌株中得到工程菌株Bs168-02。不添加IPTG进行诱导的情况下，能够检测到Bs168-02在488 nm波长激发下发出的荧光(图2-b)。接着，我们将Bs168-02在LB培养基培养中培养6 h后再添加IPTG混合培养12 h。结果如图2-c所示，加入IPTG后2 h内荧光强度明显提升，但是随后荧光强度开始减弱。上述结果说明，IPTG诱导转录因子GlcR表达后，荧光强度开始减弱，PglcR的转录强度受到抑制，因此，我们确定GlcR是PglcR的转录抑制因子。
2.2 PglcR的易错突变体文库及高通量筛选系统构建
为了提高磷酸酶YwpJ的表达量同时又不影响糖转运相关基因ptsG的表达，我们考虑通过解除转录因子GlcR对自身启动子PglcR的结合能力来达成这一目的。因此，我们通过易错突变体构建PglcR的突变体文库PglcR-ep，并在pPglcR-gfp质粒的基础上将PglcR启动子区域替换为PglcR-ep得到新的质粒pPglcR-ep-gfp。将pPglcR-ep-gfp质粒转入Bs168-01，得到携带pPglcR-ep-gfp质粒的B.subtilis突变体文库。在96孔板中培养6 h后外源添加IPTG进行诱导，继续培养4 h后检测荧光强度，具体筛选方法如图2-a所示。我们随机挑选了8个PglcR易错突变体，在不添加IPTG的情况下，PglcR-ep1和PglcR-ep8的转录强度高于野生型PglcR,而PglcR-ep6几乎无法检测到荧光(图2-b)。在外源添加IPTG培养2 h后，携带PglcR、PglcR-ep1和PglcR-ep8的转化子荧光强度逐步提高，但随着培养时间的延长，荧光强度开始下降，培养5 h后逐渐无法检测到荧光，说明这两个突变体的结合区域未被突变。携带PglcR-ep6的转化子从头至尾都没有检测到荧光，而作为阳性对照的pP43-gfp质粒在添加IPTG后12 h内能够正常检测到荧光(图2-c)。因此，该筛选系统能够用来筛选不受GlcR抑制的PglcR突变体。
a-B.subtilis的GlcNAc代谢网络；b-工程菌株FMIK在摇瓶中培养60 h的生长曲线；c-磷酸糖胁迫对glcR-ywpJ 操纵子转录水平的影响；d-转录因子GlcR与自身启动子PglcR的结合能力分析
图1 磷酸糖胁迫对FMIK生长、glcR-ywpJ操纵子转录水平的影响以及转录因子GlcR与PglcR结合能力的影响
Fig.1 Effects of phosphosugar stress on the growth of FMIK, the transcription level of glcR-ywpJ operon and the binding ability of transcription factor GlcR to PglcR
a-PglcR突变体文库的高通量筛选模式；b-随机挑选的8个PglcR易错突变体的转录强度分析； c-转录因子GlcR对4个不同强度的PglcR易错突变体的抑制效果检测
图2 PglcR突变体文库的高通量筛选模式及可行性验证
Fig.2 High throughput screening method and verification of PglcRmutant library
2.3 PglcR结合位点缺失突变体的构建和验证
确认该筛选系统的可行性后，我们对PglcR结合位点缺失突变体进行筛选，使用96孔板对3 168个转化子的筛选后，得到了8个荧光强度比较高的突变菌株(图3)。对这8个菌株携带的pPglcR-ep-gfp质粒的启动子区域进行测序分析，我们在PglcR序列上找到了一段可能的结合位点序列actta，该序列在整个启动子区域重复出现了4次(图4-a)。8株荧光强度较高的菌株均在这4段序列处出现了不同数量的碱基突变。为了验证这段序列是否是GlcR与PglcR结合的关键区域，我们对这4段序列逐一进行了敲除，得到了4个PglcR的突变体PglcR-m1～PglcR-m4。分别将PglcR-m1-gfp、PglcR-m2-gfp、PglcR-m3-gfp 和PglcR-m4-gfp质粒转入Bs168-01，得到4株工程菌株Bs168-03、Bs168-04、Bs168-05和Bs168-06。利用LB培养基分别培养这4株菌株6 h后，通过外源添加IPTG检测了12 h内4株菌株的荧光强度变化情况。结果显示，随着4段重复序列的逐一敲除，GlcR对PglcR-m1～PglcR-m4突变体的抑制能力越来越弱。尤其是Bs168-06，添加IPTG后荧光强度变化情况与不添加IPTG的野生型Bs168-02几乎一致(图4-b～图4-e)。为了进一步验证结合区域敲除突变体与GlcR的结合能力，我们通过EMSA实验检测了GlcR分别与4个突变体的结合能力，结果与荧光强度检测结果一致(图5-a)。上述结果表明，这4段重复序列是GlcR与PglcR结合的关键区域，敲除后能够解除GlcR对PglcR的抑制作用。
图3 基于荧光检测高通量筛选不受GlcR抑制的PglcR突变体
Fig.3 High throughput screening of PglcR mutants without inhibition by GlcR based on the fluorescence detection
2.4 FMIK-m4菌株生长情况、GlcNAc产量及GlcNAc6P浓度分析
接着，我们在FMIK菌株的基础上，将野生型PglcR替换为PglcR-m4突变体，得到新的工程菌株FMIK-m4。为了验证该菌株是否还会受到磷酸糖胁迫，我们在摇瓶中检测了FMIK-m4菌株60 h的生长曲线。结果表明，FMIK-m4菌株在摇瓶培养过程中没有出现二次生长的现象(图5-b)。这很可能是因为GlcR无法抑制PglcR-m4的转录，因而能够在胞内持续表达磷酸酶YwpJ，进而有效催化GlcNAc6P的去磷酸化反应。同时，替换PglcR-m4并不会影响GlcR对糖转运相关基因ptsG调控作用，保证GlcNAc的合成原料供应。因此，我们在摇瓶中检测了FMIK-m4菌株的GlcNAc合成能力。结果表明，与FMIK相比，FMIK-m4菌株的GlcNAc合成能力显著提高，产量达到18.21 g/L(图5-c)。我们还检测了FMIK-m4胞内GlcNAc6P的积累情况，与FMIK相比FMIK-m4菌株胞内的GlcNAc6P浓度显著降低，降低了46.62%(图5-d)。上述结果表明，通过敲除PglcR与转录因子GlcR的结合区域能够解除GlcR对glcR-ywpJ操纵子的抑制作用，进而解除因B.subtilis胞内GlcNAc6P过量积累引起的二次生长。在不影响糖转运的情况下有效缓解胞内的磷酸糖压力，提高GlcNAc合成能力。
a-PglcR区域的DNA序列(实线箭头表示GlcR结合区域重复序列)；b～e-4个结合区域重复序列逐一敲除获得的 突变体受GlcR的抑制情况分析
图4 PglcR结合区域敲除突变体构建及其受GlcR抑制情况分析
Fig.4 Construction binding region knockout mutants of PglcR and analysis of their inhibition rate by GlcR
a-转录因子GlcR与PglcR结合区域敲除突变体的结合能力分析；b-FMIK-m4菌株在摇瓶中的生长曲线； c-FMIK-m4菌株的GlcNAc产量；d-FMIK-m4菌株胞内GlcNAc6P浓度
图5 FMIK-m4菌株生长情况、GlcNAc产量及胞内GlcNAc6P浓度分析
Fig.5 Analysis of growth, GlcNAc yield and intracellular GlcNAc6P concentration of FMIK-m4
3 结论与讨论
磷酸糖是糖酵解途径的重要形式，然而过量积累的磷酸糖会对细胞产生毒性，影响细胞生长。本课题组前期通过增强GlcNAc前体GlcNAc6P的供应得到一株B.subtilis工程菌株。GlcNAc6P的过量积累导致菌株胞内形成磷酸糖胁迫。glcR-ywpJ操纵子的转录水平在磷酸糖胁迫过程中显著上调，说明GlcR和YwpJ参与了B.subtilis的磷酸糖胁迫调控机制。通过EMSA实验，我们确定了GlcR是自身启动子PglcR转录抑制因子，随着GlcR浓度的提升会抑制磷酸酶YwpJ的表达。因此，为了解除GlcR对YwpJ的抑制作用，本文通过易错PCR构建了PglcR的突变体文库并设计了基于荧光检测的高通量筛选方法，成功找到并敲除了GlcR与PglcR的结合区域，有效降低了胞内GlcNAc6P浓度，解除了磷酸糖胁迫带来的二次生长现象，使GlcNAc产量显著提高。然而，转录因子GlcR在磷酸糖胁迫过程中的具体调控机制仍需要进一步研究。同时，磷酸酶的底物专一性普遍较差[16]，通过定向进化改造磷酸酶YwpJ，提高YwpJ的底物特异性和催化活性也是一个可行的研究方向。为降低生产成本，本研究对使用B.subtilis生产GlcNAc具有重要指导意义，为后期的工业化奠定了基础。
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