气相色谱/串联三重四级杆质谱法测定绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸的含量

高尧华1,丁涛2,孙灿1,刘冰1,滕爽3*

1(日照海关,山东 日照,276826)2(南京海关动植物与食品检测中心,江苏 南京,210019) 3(南京农业大学 食品科技学院/农业农村部肉及肉制品质量监督检验测试中心(南京),江苏 南京,210095)

摘 要 建立了绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸的气相色谱-串联三重四级杆质谱(gas chromatography-tabdem triple quadrupole mass spectrometry, GC-MS/MS)同时测定分析方法。茶叶样品经85 ℃热水浸泡后,用乙腈提取,采用QuEchERs法净化,HP-5MS色谱柱分离,三重四级杆质谱多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式有效降低茶叶基质的背景干扰,GC-MS/MS分析检测。该检测方法的检出限为0.001~0.003 mg/kg,方法验证试验结果表明,该类化合物的平均回收率为73%~104%,相对标准偏差为3.0%~10.5%。通过对市售茶叶样品的检测,进一步验证该方法重现性好,准确度高,操作简单,适用于绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸的检测。

关键词 气相色谱-串联三重四级杆质谱法;L-茶氨酸;咖啡因;茶多酚;十六烷酸

我国绿茶品种繁多,种植面积大,因茶树品种和生长环境等条件的区别,其茶多酚、氨基酸和咖啡碱等品质化合物含量不同,芳香物质等化学特性组分也各有差异。绿茶的风味是茶叶内含物相互作用、不断变化的结果,因此造成了不同地域绿茶品质和滋味的差异,形成了各具特色的“品种香”[1]。绿茶中茶多酚是影响茶叶滋味和色泽的主要成分,是构成茶叶品质的关键性物质[2]。茶叶中茶氨酸是构成茶汤鲜味的主要成分,也是衡量茶叶品质优劣的重要生化成分[3-4]。咖啡碱是一种苦味物质,它能和茶叶中的其他物质形成络合物,表现出一定的鲜爽滋味,能够明显改善茶汤口感。由此可见,鉴别绿茶中的主要品质组分具有很高的实用价值,特别是在原料和成品的品质鉴定、有效成分的提取分离、保障国内市场消费及对外出口等方面具有广阔的应用前景。

近年来,诸多研究人员利用不同方法对茶叶品质化合物分析研究。周亦斌等[5]利用计算机视觉图像处理技术结合感官审评结果进行茶叶筛选评级,LI等[6]利用各种类型的电子舌结合不同的化学计量法和模式识别法对茶叶组分定性,电子鼻同样用于茶叶香气识别与品质等级的划分[7-9]以及加工过程的监测[10-11],气相色谱-嗅觉-质谱测定法(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC-O-MS)等通过定量描述感官分析[12],GC-MS和GC-O技术在4种功夫红茶中鉴定出64种挥发性化合物,在鉴定绿茶[13-14]、普洱茶[15]、乌龙茶[16]的特征香气中也取得了较好的效果。上述方法对茶叶进行品质分析仍以物理分析为基础,然而,茶叶品质物理检验结果受主观因素影响,缺乏可参照的标准,重复性较差。常规仪器分析多采用NIST库定性、归一法定量,定性定量均存在不足。植物源性产品前处理方法中,QuEChERS前处理方法因操作简单、成本低、可以满足快速处理大批量样品等优点被广泛应用于植物源性样品农药残留等前处理过程中[17-19]

本研究基于QuEChERS前处理技术,选用市售绿茶,采用乙腈提取,N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)和十八烷基硅烷(C18)为净化剂,结合气相色谱-串联三重四级杆质谱(gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry, GC-MS/MS)仪器分析技术,实现了对绿茶品质化合物L-茶氨酸、十六烷酸、咖啡因、茶多酚准确定性定量分析。该方法简单、快速、准确,且能快速区分北方绿茶与南方绿茶成分差异,综合分析以期明确各地绿茶茶叶品质特征,为各地绿茶品质鉴别提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶样品:日照绿茶(日照百润茶行)、南京绿茶(市售)、杭州龙井(市售)。

乙腈(色谱纯),美国TEDIA公司;丙酮(色谱纯)、正己烷(色谱纯),德国Merck公司;氯化钠(分析纯),西陇化工股份有限公司;L-茶氨酸、茶多酚、十六烷酸,上海麦克林生化科技有限公司;咖啡因(质量浓度为1 000 μg/mL),北京坛墨质检科技有限公司;QuEChERS dSPE,美国安捷伦科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7000B GC-MS/MS仪,美国安捷伦科技有限公司;IKA KS260振荡器、IKA MS3 basic涡旋混匀器、德国IKA公司;Buchi 旋转蒸发仪,瑞士Buchi公司;TDL-40B 离心机,上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取适量各化合物标准品,用甲醇溶解,配制质量浓度约为1 000 mg/L的标准储备液,于-18 ℃保存,有效期为6个月。移取各化合物储备液1 mL,用丙酮+正己烷(3∶7,体积比)溶解,配制成质量浓度为10 mg/L的中间液,于0~4 ℃避光保存,有效期为6个月。

标准溶液工作曲线的配制:

准确移取适量标准溶液,用丙酮+正己烷(30∶70,体积比)稀释成0.01、0.02、0.050、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 mg/L标准工作液,现配现用。

1.3.2 样品前处理

茶叶试样:称取2.00 g(精确至0.01 g)茶叶试样,置于50 mL离心管中,加入20 mL 85 ℃水浸泡30 min后加入20 mL乙腈振荡提取30 min,加入5 g氯化钠涡旋1 min,以5 000 r/min离心5 min,取上清液10 mL,加入400 mg PSA、400 mg C18 QuEChERS净化粉末,涡旋30 s,过滤至鸡心瓶,旋转蒸发至近干,准确加入2.0 mL丙酮+正己烷(30∶70,体积比)定容后,过0.22 μm滤膜,供上机分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)弹性石英毛细管柱;载气:高纯氦气(99.999%);碰撞气:高纯氮(99.999%);流速:1.1 mL/min;进样方式:不分流进样;进样口温度:250 ℃;柱温:初始50 ℃(1 min)以10 ℃/min程序升温至150 ℃,再以20 ℃/min程序升温至280 ℃(4 min);进样量:1.0 μL。

1.3.4 质谱条件

离子源:电子电离(electron ionization, EI)源;离子源温度:230 ℃;四级杆质量分析器温度150 ℃;传输线温度280 ℃;溶剂延迟:3 min;检测方法:多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式:运行时间23.5 min(后运行5 min)。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 绿茶样品称量质量的优化

(1)称取4.00 g绿茶试样,置于100 mL离心管中,加入40 mL 85 ℃蒸馏水静置30 min,加入40 mL乙腈振荡提取30 min,按照1.3.2步骤前处理并上机测定。

(2)称取2.00 g绿茶试样,置于50 mL离心管中,加入20 mL 85 ℃蒸馏水静置30 min,按照1.3.2步骤前处理并上机测定。

实验试验发现,4.0 g样品经蒸馏水浸泡后样品量较大,提取净化药品试剂消耗量过大,实验过程操作更为繁琐;提取液上机检测,样品中咖啡因、茶多酚含量较高,色谱柱过载,色谱峰形差,导致定量不准确等问题,实验最终确定称取样品量为2.00 g。

2.1.2 提取溶剂的优化

茶叶呈香品质组分分析一般采用顶空进样法[20],而日常饮茶过程中,呈香化合物在茶汤中含量与干基含量却不相同。绿茶的冲泡温度建议85 ℃,为更大程度还原人体摄入茶汤中品质组分含量,本实验增加了85 ℃热水浸泡步骤,充分提取茶叶中品质化合物。

根据茶叶中待测组分的化学性质,本实验采用甲醇、乙酸乙酯、丙酮、0.5%(体积分数)甲酸乙腈、乙腈作为提取溶剂,其他条件相同对同一绿茶样品提取效果进行考察。甲醇因极性较强可提取多种极性组分,提取液呈浑浊状态;丙酮可提取多种高色素组分,其提取液颜色为深绿色;乙酸乙酯提取过程色素类化合物较少,根据相似相容原理可提取部分脂类化合物其提取液呈透明浅绿色;酸化乙腈在提取过程中与茶汤中部分碱性化合物反应,提取液呈褐色。上述4种品质化合物不同提取剂提取结果见图1,结果表明乙腈提取绿茶中咖啡因、茶多酚含量最高、效果最好,综合考察主要组分咖啡因和茶多酚的提取率及后期净化效果确定乙腈为绿茶提取溶剂。

图1 不同溶剂对4种化合物提取含量的影响
Fig.1 Effects of different solvents on the extraction contents of the 4 compounds
注:相对百分含量为所测化合物与其所测最高含量比值(下同)

2.1.3 净化条件的优化

茶叶基质复杂,常规茶叶基质前处理方法主要有QuEChERS法和固相萃取法,QuEChERS法因其操作简单、试剂消耗少、污染小等优点被推广使用。应用QuEChERS方法进行前处理分析时,常用PSA、C18、石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)3种材料作为吸附剂,PSA能够去除基质中的有机酸、色素、金属离子,C18能够吸附脂肪和脂类等弱极性干扰物,GCB主要吸附基质中的色素[21]

实验选取同一茶叶样品,按照相同样品前处理过程,以无吸附剂的空白组为对照,分别组合选取PSA、C18和GCB为净化材料,比较不同吸附剂组合对同一样品中4种化合物含量的影响。实验过程中发现,不同种类的吸附剂对4种绿茶中品质化合物影响明显,GCB可去除样品中色素类化合物但对茶多酚和十六烷酸吸附较大,C18可以有效去除绿茶中脂类化合物,未添加C18净化剂样液浓缩后均含油状物,未经净化样液虽品质化合物损失较少,浓缩后颜色呈深绿色黏稠油状,但会对离子源和色谱柱造成污染,因而使用PSA+C18,可以有效吸附绿茶中脂类化合物等共提取物,提高目标分析物的提取率。

图2 不同净化剂对4种化合物含量的影响
Fig.2 Effects of different purifying agents on the contents of the 4 compounds

由图2可知,PSA+C18为最佳净化组合,所以选择PSA+C18混合吸附剂作为本方法的净化剂。选取100 mg PSA+100 mg C18、200 mg PSA+200 mg C18、300 mg PSA+300 mg C18、400 mg PSA+400 mg C18、500 mg PSA+500 mg C18对净化剂用量进行优化。随着净化剂用量的增加,目标分析物的提取率和净化效果有所提高。综合考虑4种目标分析物的提取率、经济效益、净化效果,最终净化材料的使用量为400 mg PSA、400 mg C18。

2.2 GC/MS/MS质谱条件的优化

按照欧盟方法学标准,质谱方法定性至少达到4个识别点要求才能准确定性,定性点越多定性越准确。对于三重四级杆质谱MRM监测模式下,至少选择2个离子对进行定性,1对离子对计为2~2.5个定性点,1个母离子加上2个子离子识别点为4,2个母离子,且每个有1个子离子识别点为5。本试验将4种标准溶液配制为10 μg/mL的溶剂标准溶液进行全扫描,确定每种化合物的保留时间,并从每种化合物的一级质谱图中选择丰度高、m/z大的母离子碎片,在不同碰撞能量下对母离子进行碰撞解离,选取1组定量离子对和2组定性离子对,按照计算可以达到目标物识别点>4个,提高了定性准确性。

表1 四种化合物色谱保留时间、质谱条件
Table 1 Chromatographic retention time and mass spectrometry conditions of 4 compounds

序号化合物名称保留时间/min离子对(m/z)碰撞能量E/V1L-茶氨酸5.234156.9/114∗156.9/72150.9/13315/15/152咖啡因15.683109/55∗194.1/109194.1/5520/20/203茶多酚15.693194/82∗194/55194/10925/25/254十六烷酸16.264129.1/87∗129.1/59213.1/8710/15/10

注:*表示定量离子

图3~图6为气相色谱/串联三重四级杆质谱检测0.10 mg/L 4种绿茶中品质化合物标准溶液所得MRM谱图如下。

2.3 线性关系范围与检出限(limit of detection,LOD)

根据信噪比S/N=3和S/N=10所对应浓度,确定L-茶氨酸、茶多酚、咖啡因和十六烷酸的LOD和定量限(limit of quantitation,LOQ)。绿茶中4种品质化合物的LOD为0.001~0.003 mg/kg,以目标组分质量浓度为横坐标X(mg/L),特征离子对的相对峰面积为纵坐标Y,采用溶剂标准溶液绘制0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 mg/L的标准工作曲线,其线性相关系数良好(R2>0.99),表明4种化合物在GC-MS/MS检测中具有较好的线性关系,该方法的灵敏度可满足方法学要求。各化合物线性方程、线性相关系数、线性范围和检出限见表2。

图3 L-茶氨酸MRM图
Fig.3 L-theanine MRM diagram

图4 咖啡因MRM图
Fig.4 Caffeine MRM diagram

图5 茶多酚MRM图
Fig.5 Tea polyphenols MRM diagram

2.4 回收率和精密度

根据方法学验证要求,试验选取市售南京绿茶为基质,分别添加3个不同水平的4种化合物标准溶液,按照1.3.2进行样品前处理,经GC-MS/MS分析。每个加标浓度水平平行测定6次,以溶剂配制的标准曲线计算加标样品的浓度,并计算回收率和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD),结果见表3。绿茶中咖啡因和茶多酚含量较高,色谱柱过载,峰形较差,定量准确率低,在定量分析时对原始上机液稀释10倍后上机检测。由表3可知,方法的平均回收率为73%~104%,RSD为3.0%~10.5%,表明该方法的准确度高,稳定性好,通用性较强。

图6 十六烷酸MRM图
Fig.6 Cetanoic acid MRM diagram

表2 四种化合物的线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限
Table 2 Linear equation, correlation coefficient, linear range, LOD, and LOQ of 4 compounds

序号化合物名称线性回归方程相关系数(R2)线性范围/(mg·L-1)LOD/(mg·L-1)LOQ/(mg·L-1)1L-茶氨酸Y=6 538X+490.995 20.020~1.00.0030.0102咖啡因Y=127 466X+7 3540.999 70.050~100.0030.0103茶多酚Y=1 504 629X+9040.990 40.050~100.0030.0104十六烷酸Y=10 419 378X+1 0290.994 90.010~1.00.0010.005

表3 不同加标水平下4种化合物的加标回收率 与相对标准偏差(n=6)
Table 3 Recoveries and relative standard deviations of the 4 compounds at different spiked levels (n=6)

化合物名称添加浓度/(mg·kg-1)回收率R/%RSD/%L-茶氨酸0.020.040.108179886.87.33.2咖啡因0.040.100.2076911049.64.25.9茶多酚0.040.100.2073819410.58.94.3十六烷酸0.020.040.107884928.97.23.0

2.5 与其他方法比较

近年来随着茶叶品质化合物分析技术的发展,出现了光学探针分析茶叶中茶多酚类化合物技术[22],但该方法操作繁琐,且仅能对茶多酚类化合物定性,不满足对茶多酚含量的准确定量。色谱法或色质联用技术在茶叶品质化合物测定中也得到应用,该类方法可分析茶叶干物质中茶多酚等组分,采用保留时间定性,归一法定量,该方法对茶叶组分中单一化合物无法准确定量,且保留时间定性准确率低[23-25]。近红外光谱技术分析茶叶中茶多酚、氨基酸等组分,该方法对于茶叶中具体化合物的定性和定量分析仍存在不足。以上茶叶化学品质分析存在前处理操作复杂、测试时间长、效率低、测定结果准确性差等问题。

本方法最大程度还原饮用绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚、十六烷酸化合物的含量,采用GC/MS-MS MRM,选取1组定量离子对和2组定性离子对,对目标组分进行精确定性,定性检测准确性远大于光谱法和常规色谱法,外标法定量其结果准确性优于归一法定量,且该方法同时可以测定茶叶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚、十六烷酸含量,测定化合物目标明确、操作简单、数据直观、定量定性更准确,通过品质化合物具体含量数值比对能够更快速区分茶叶品质。

2.6 绿茶实际样品分析

利用本研究建立的方法对日照奎山、巨峰、三庄三地三季日照绿茶20个样本作为主要研究对象,选用市售南京绿茶、杭州龙井作为辅助研究对象,对试验方法进行验证,并对南北方绿茶品质进行分析(表4)。

实验发现,如图7所示,该方法能够快速检测绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚、十六烷酸化合物的含量。日照绿茶春茶中品质化合物含量:L-茶氨酸0.06~0.10 mg/kg、十六烷酸0.03~0.08 mg/kg、咖啡因24~49 mg/kg、茶多酚23~43 mg/kg。茶多酚和咖啡因随季节变化较大,春茶含量最高秋茶最低,早春茶含量为秋茶2倍;十六烷酸呈增加-减少-增加趋势,其含量随季节变化明显,温差越大,十六烷酸越容易富集,随着夏季温度升高,富集能力下降,秋季温度下降,昼夜温差增大后含量逐步提升。沿海春季温度提升较内陆慢,且昼夜温差较内陆小,因而同期沿海绿茶各组分含量低于内陆同期绿茶。同期南方绿茶与北方绿茶相比L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚品质化合物较低,其含量仅接近北方绿茶代表日照绿茶秋茶。

表4 绿茶中4种品质组分分析
Table 4 Analysis of four quality components in green tea

化合物名称添加浓度/(mg·kg-1)回收率R/%RSD/%L-茶氨酸0.020.040.108179886.87.33.2咖啡因0.040.100.2076911049.64.25.9茶多酚0.040.100.2073819410.58.94.3十六烷酸0.020.040.107884928.97.23.0

图7 日照春茶4种化合物含量分析
Fig.7 Content analysis of 4 compounds in Rizhao Spring tea

3 结论

本实验建立了绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚、十六烷酸GC/MS-MS检测法。绿茶样品经乙腈提取,PSA和C18 QuEChERS方法净化,结合气相色谱/串联三重四级杆质谱多反应监测模式进行分析。该方法的建立可以对绿茶品质组分L-茶氨酸、十六烷酸、咖啡因、茶多酚进行更准确定性定量,克服了传统绿茶品质分析方法受人为因素影响及定性定量准确性差等缺点,且操作简单、准确、快速、方法学参数良好,可用于各地绿茶品质组分准确定性和定量分析。通过绿茶品质组分准确定性定量分析能够将以日照绿茶为代表的北方绿茶与南方绿茶品质进行准确区分,解决了绿茶市场出现以次充好、以假乱真等问题,为各地绿茶品质鉴别提供技术支持,对绿茶贸易发展具有重要价值。

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Determination of L-theanine, caffeine, tea polyphenols, and palmitic acid in green tea by gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry

GAO Yaohua1,DING Tao2,SUN Can1,LIU Bing1,TENG Shuang3*

1(Rizhao Customs, Rizhao 276826, China)2(Nanjing Customs Plant and Food Testing Center, Nanjing 210019, China) 3(College of Food Science and Technology/Supervision, Inspection and Testing Center for Quality of Meat-products (Nanjing), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

ABSTRACT A method was developed for the simultaneous determination of L-theanine, caffeine, tea polyphenols, and palmitic acid in green tea by gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry (GC-MS/MS). The samples were immersed in water at 85 ℃ and tea samples were extracted with acetonitrile and then purified by the QuEchERs method. The analytes were separated on an HP-5MS capillary column and analyzed by GC-MS/MS. Multiple reaction monitoring (MRM) mode effectively reduced the background interference of the tea substrate. The limits of detection (LOD) of the method ranged from 0.001 to 0.003 mg/kg, the experimental results of the method validation test showed that the average recovery of these compounds was between 73% and 104%, and the relative standard deviation (RSD) was between 3.0% and 10.5%. In conclusion, it was verified that the method had good reproducibility, high accuracy, and simple operation by testing commercial tea samples, therefore, it was suitable for the determination of L-theanine, caffeine, tea polyphenols, and palmitic acid in green tea.

Key words gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry; L-theanine; caffeine; tea polyphenols; palmitic acid

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032018

引用格式:高尧华,丁涛,孙灿,等.气相色谱/串联三重四级杆质谱法测定绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸的含量[J].食品与发酵工业,2023,49(6):276-282.GAO Yaohua,DING Tao,SUN Can, et al.Determination of L-theanine, caffeine, tea polyphenols, and palmitic acid in green tea by gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(6):276-282.

第一作者:硕士,高级工程师(滕爽实验师为通信作者,E-mail:tengshuang@njau.edu.cn)

基金项目:青岛海关“组阁揭榜”科研项目(QK202101)

收稿日期:2022-04-18,改回日期:2022-05-17