三唑类杀菌剂是分子结构中含有1,2,4-三唑环且具有杀菌作用的一类化合物，主要通过影响真菌细胞膜的生物合成抑制真菌生长[1-2]。三唑类杀菌剂具有内吸性强、高效、低毒、持效期长等优势[3]，被誉为第二个里程碑式杀菌剂[4]。20世纪70年代初，三唑类化合物的杀菌活性开始受到高度重视，三唑酮、戊唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑等众多三唑类杀菌剂陆续上市，被广泛应用于水果、蔬菜等农作物的病害控制[5]。2016年，巴斯夫公司开发的氯氟醚菌唑是首个新型异丙醇三唑类杀菌剂，打破了三唑类杀菌剂近十余年来无新品上市的空白。该药2020年1月在中国获得正式登记[6-7]。目前，三唑类杀菌剂占全球杀菌剂销售额的1/4以上[8]。
随着三唑类杀菌剂在农业及食品领域中的使用量逐渐增大，其在食品及环境中的残留引起了人们的关注。有研究表明，高剂量的三唑类杀菌剂直接或间接地扰乱了土壤中微生物群落的结构，导致土壤微生物种群的减少和土壤中酶活性的降低，破坏土壤健康，从而影响植物生长[9-10]。三唑醇、腈菌唑、己唑醇等三唑类杀菌剂可与水环境中的微塑料共存，造成联合污染[11]。三唑类杀菌剂对生物体的不利影响也备受关注，例如生殖发育毒性[12]、内分泌干扰作用[13]、肝脏损伤[14]。此外，三唑类杀菌剂还有可能会渗入血液并与人体的血浆蛋白相互作用[15]。
鉴于三唑类杀菌剂对人类和生态环境的不利影响，我国农业农村部在 GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中明确规定了三唑类杀菌剂在食品中的最大残留限量。近几年国家及地方的农业部门和市场监管部门对食品及农产品的农药残留抽检结果显示，苯醚甲环唑、己唑醇、戊唑醇、腈苯唑、腈菌唑、三唑酮等三唑类杀菌剂在柑橘、芒果、葡萄、黄瓜、草莓、香蕉等水果中存在残留超标的问题。以欧盟、日本、韩国为代表的发达国家和地区对农产品的质量要求日趋严格，我国出口农产品因三唑酮、三唑醇、三环唑、丙环唑、氟硅唑、苯醚甲环唑、己唑醇、戊唑醇等三唑类杀菌剂残留超标而引发的退运案例时有发生，主要涉及菠菜、辣椒、南瓜、胡萝卜、川芎、山葵等生鲜蔬果。因此，实现三唑类杀菌剂残留的快速高效检测，对发展绿色农业、保障食品安全、助力我国农产品出口贸易都具有重大意义。
目前，三唑类杀菌剂残留的检测主要以GC、HPLC、LC-MS和GC-MS等仪器分析方法为主。虽然仪器方法灵敏度、准确度高，但仪器设备价格昂贵，样品前处理过程复杂，需要专业人士操作，不适合现场快速检测。近年来，免疫检测方法因具有灵敏度高、特异性好、操作简单、高通量测定等优势，已广泛应用于三唑类杀菌剂残留的快速检测[16]。本文重点阐述了国内外三唑类杀菌剂免疫检测技术的研究进展，以期为未来三唑类杀菌剂检测技术的发展和应用提供研究思路。
1 三唑类杀菌剂抗原和抗体的制备
三唑类杀菌剂属于小分子化合物，只具有免疫反应性而不具有免疫原性，无法直接诱导动物机体产生抗体[17]。因此，三唑类杀菌剂需要和大分子蛋白质或者多聚赖氨酸等载体偶联后形成完全抗原才能具有免疫原性。然而，三唑类杀菌剂化学结构中不含羧基或氨基，需要设计合成半抗原，再与蛋白等载体进行偶联。半抗原的设计与合成是获得高灵敏度和特异性抗体的关键，半抗原要尽量保留小分子的结构特征，同时还要具有适合长度的连接臂，使得小分子与蛋白等载体偶联后能充分暴露在载体表面[18-19]。成功制备三唑类杀菌剂完全抗原以后，再通过免疫动物制备抗体。目前，所报道的三唑类杀菌剂抗体以多克隆抗体(polyclonal antibody，pAb)和单克隆抗体(monoclonal antibodies，mAb)为主。利用基因工程技术制备重组抗体(recombinant antibody，RAb)在三唑类杀菌剂抗体制备方面也有报道。
三唑类杀菌剂半抗原的设计合成有多种思路，其中最为常见的方式是通过三唑类杀菌剂分子结构中的羰基、羟基或氰基进行衍生合成半抗原。崔廷婷等[20]对三唑酮的羰基进行修饰，使之与氨基己酸反应，合成了含有羧基的三唑酮半抗原，通过碳二亚胺法与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)进行偶联制备得到三唑酮完全抗原，然后免疫小鼠制备得到三唑酮的单克隆抗体。JIANG等[21]利用烯唑醇的羟基与琥珀酸酐反应得到含有羧基的烯唑醇半抗原，通过碳二亚胺法与BSA进行偶联制备得到烯唑醇完全抗原，免疫雄性新西兰大白兔得到烯唑醇的多克隆抗体。SZEKACS等[22]对腈菌唑分子结构中的氰基进行水解，得到了含有羧基的半抗原，通过活泼酯法与卵伴白蛋白(conalbumin，CONA)偶联制备得到腈菌唑完全抗原，然后免疫雌性新西兰大白兔得到腈菌唑的多克隆抗体。
另一种设计合成三唑类杀菌剂半抗原的方法是通过取代苯环上的氯原子引入活性基团。DANKS等[23]以羟基和氨基分别取代戊唑醇苯环上的氯原子，得到Teb-NH2和Teb-OH两种半抗原，通过双功能交联剂使Teb-OH与BSA偶联得到完全抗原，免疫白兔后得到戊唑醇的多克隆抗体。WANG等[24]以—C5H10COOH基团取代戊唑醇苯环上的氯原子合成了戊唑醇的半抗原，利用活泼酯法与BSA偶联后免疫BALB/c小鼠筛选得到了戊唑醇单克隆抗体。
此外，还可以利用三唑类杀菌剂的代谢物设计合成半抗原。NEWSOME[25]利用三唑酮的代谢物三唑醇与琥珀酸酐反应，制得三唑酮的半抗原，并采用碳二亚胺法使之与人血清蛋白(human serum albumin，HSA)偶联，免疫新西兰大白兔得到三唑酮的多克隆抗体。GOUGH等[26]设计合成了两种与戊菌唑的尿代谢物具有类似结构的半抗原，采用碳二亚胺法与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)偶联制备得到完全抗原，然后将两种完全抗原等比例混合后对小鼠进行免疫，筛选得到戊菌唑的单克隆抗体。
等[27]以四氟醚唑的一种降解产物为原料制备得到两种半抗原DTPH和HH，用改进的活泼酯法将半抗原偶联到BSA上，对小鼠进行免疫。从免疫了HH-BSA的小鼠中筛选出了特异性识别四氟醚唑的单克隆抗体，从免疫DTPH-BSA的小鼠中筛选得到了能同时识别四氟醚唑、戊菌唑、环丙唑醇、腈菌唑4种三唑类杀菌剂的单克隆抗体。PLANA等[28]在已经制备得到的四氟醚唑半抗原和单克隆抗体基础上，利用基因工程抗体技术，在大肠杆菌中成功表达了两种类型的重组抗体(RAb)片段：单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)和scFv与M13噬菌体衣壳蛋白pⅢ的融合片段(scFv-pⅢ)。万宇平等[29]以合成苯醚甲环唑过程中产生的一种杂质为起始原料，经溴化反应，得到中间体溴代物，再与氨基丙酸进行亲核取代反应合成半抗原，采用活泼酯法将半抗原与卵清蛋白(ovalbumin，OVA)偶联得到完全抗原，免疫小鼠后制备得到特异性识别苯醚甲环唑的单克隆抗体。
除上述半抗原合成思路外，还可以采用全合成的方式制备三唑类杀菌剂半抗原。吴小胜等[30]以2-(4-氯苯基)-2-氰基乙醛为原料，先与二溴甲烷反应得到中间产物，再与三氮唑反应制得腈菌唑半抗原，与BSA偶联后作为免疫原对小鼠进行免疫，筛选得到腈菌唑单克隆抗体。LIU等[31]以3,4’-二氯二苯醚为原料合成了两种苯醚甲环唑半抗原，半抗原1不含三唑环结构，而半抗原2中含有苯醚甲环唑的完整结构，采用活泼酯法将两种半抗原与KLH和BSA偶联，用半抗原1-KLH免疫兔子得到苯醚甲环唑的多克隆抗体。LI等[32]分别以6-庚烯酸、2’-氯-4’-溴苯乙酮为原料，在丙环唑的不同位置引入烷基链，合成了丙环唑半抗原A、半抗原B，用活泼酯法将半抗原与BSA偶联，免疫小鼠后筛选出了特异性识别丙环唑的单克隆抗体。何方洋等[33]以4-氰甲基苯乙酸甲酯为原料合成了含有羧基的腈苯唑半抗原，通过活泼酯法偶联BSA后免疫小鼠，制备得到腈苯唑的单克隆抗体。李拥军等[34]以对氟苯基溴化镁和氯甲基甲基二氯硅烷为原料，反应得到第一中间体，再与1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯反应制得氟硅唑的半抗原，通过活泼酯法与牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin，bLF)偶联后免疫新西兰白兔，得到氟硅唑的多克隆抗体。
附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220616.0838.001.html)详细列出了各种三唑类杀菌剂的结构、半抗原的结构、偶联方法以及所制备抗体的抗体类型。
2 三唑类杀菌剂的免疫检测方法
2.1 酶联免疫分析法
酶联免疫分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 是免疫检测中应用最为广泛的一种方法，它将抗原与抗体的特异性反应通过酶催化作用显示出颜色，而颜色深浅与样品中待测物的量直接相关，从而实现对待测物的定性或定量分析。
三唑类杀菌剂的ELISA方法有直接竞争法(direct competitive ELISA，dc-ELISA)和间接竞争法(indirect competitive ELISA，ic-ELISA)两种。刘冰等[35]制备了苯醚甲环唑多克隆抗体并建立了dc-ELISA方法，其IC50为(67.96±2.73) μg/L，检出限IC15为(8.86±0.34) μg/L，与11种三唑类杀菌剂交叉反应率均小于0.01%。同时在10种果蔬类样品中开展加标回收实验，平均回收率为89.01%～103.43%。LIU等[31]建立了检测果蔬中苯醚甲环唑残留的ic-ELISA方法，IC50为29.10 μg/L，检出限IC15为4.58 μg/L，水果和蔬菜的添加回收率为89.70%～102.31%，且检测结果与HPLC一致。JIANG等[21]通过免疫兔子制备烯唑醇多克隆抗体，以此开发了检测烯唑醇残留的ic-ELISA方法，检出限为(1.28±0.80) μg/L，检测范围为0.005～5 mg/L，IC50为(0.071±0.013) mg/L，在水、土壤、梨、葡萄、番茄和小麦粉等基质中的添加回收率为70%～120%。SZEKACS等[22]基于腈菌唑多克隆抗体建立了一种定量检测腈菌唑的ic-ELISA方法，检测范围为0.3～200 μg/mL，IC50为(4.9±0.5) μg/mL，灵敏度较差。GOUGH等[26]免疫小鼠制备得到戊菌唑单克隆抗体，并建立了检测戊菌唑及其尿代谢物的ic-ELISA方法，检出限为0.3 μg/L，IC50为1.0～1.2 μg/L，该方法可用于监测人体对戊菌唑的职业接触或非职业接触。何方洋等[33]基于dc-ELISA方法开发了检测腈苯唑的酶联免疫试剂盒。
王勇等[36]基于三唑酮多克隆抗体建立了ELISA方法，检出限为0.2 ng/mL，IC50为2.0 ng/mL。该方法在黄瓜、梨等食品中的添加回收率为92.44%～98.18%，结果与GC分析结果一致。崔廷婷等[20]在三唑酮单克隆抗体的基础上，建立了三唑酮及其代谢物三唑醇残留检测的酶联免疫方法。该方法具有较好的特异性、回收率和重复稳定性，检出限为0.5 mg/kg，IC50为3.0 μg/L，可用于烟草及蔬菜水果的三唑酮检测。DANKS等[23]基于戊唑醇多克隆抗体而开发的ELISA，检测范围为0.02～20 μg/mL。邢玉梅[37]筛选出了高特异性、高亲和力的抗戊唑醇单克隆抗体，建立的ELISA方法检测范围为0.245～1.304 ng/mL，IC50值为0.565 ng/mL，检出限为0.123 ng/mL，灵敏度明显高于DANKS等[23]基于多克隆抗体的ELISA方法。CHEN等[38]基于己唑醇多克隆抗体开发了ic-ELISA方法，检出限为0.1 ng/mL，检测范围为1～60 ng/mL，IC50为8 
等[27]筛选出了特异性识别己唑醇的单克隆抗体，并以此建立了ELISA方法检测果汁中的己唑醇残留，该方法的检出限为0.3 μg/L，检测范围为0.5～3.8 μg/L，IC50为1.3 μg/L。FORLANI等[39]制备了抗四氟醚唑多克隆抗体并建立ELISA方法，但由于灵敏度差，无法应用于食品的常规检测。CAIROLI等[40]在此基础上开发了新的ELISA方法，并对水果样品的基质干扰进行了研究。该方法的检出限为2 ng/mL，线性范围为1.9～1 000 等[27]筛选出了一种单克隆抗体DTPH-41，能够同时识别四氟醚唑、戊菌唑、环丙唑醇、腈菌唑4种三唑类杀菌剂，并以此建立了ELISA检测方法用于果汁中三唑类杀菌剂残留的检测，其中四氟醚唑的IC50为0.5 μg/L。PLANA等[28]首次将重组抗体scFv应用于三唑类杀菌剂的免疫检测中，建立了测定橙汁和苹果汁中的四氟醚唑的ELISA方法， 检出限约为1～2 ng/mL，灵敏度优于CAIROLI等[40]开发的基于多克隆抗体的ELISA方法，但较其亲本单克隆所建立的ELISA方法差[27]。
2.2 免疫层析试纸条
免疫层析技术(immunochromatography assay，ICA)是以层析试纸条为载体，将免疫技术和层析技术相结合的检测方法。试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫4个部分组成。样品溶液与结合垫中的标记抗体在毛细管层析作用下沿着硝酸纤维素膜向前移动，在固定有抗原的区域时抗原、抗体发生特异性结合形成免疫复合物，从而使标记物在此区域积累，然后通过肉眼或仪器判读结果。
楼小华等[41]制备了三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物，组装成胶体金试纸条，建立一种快速检测烟叶中三唑酮残留量的方法。该方法的灵敏度为1 mg/kg，检测时间为 5～10 min，与气相色谱串联质谱检测法符合率为98%，为我国基层烟站大批量筛查和田间现场快速检测三唑酮提供了新方法。LIN等[42]制备了一种针对三唑酮和三唑醇的特异性单克隆抗体，并研制了用于检测番茄中的三唑类杀菌剂的胶体金免疫层析试纸条(colloidal gold immunochromatographic assay，AuNP-ICA)，三唑酮和三唑醇的检出限均为10 ng/g，检测结果与ic-ELISA一致。陈黎等[43]制备了一种对烟叶中的三唑醇进行快速检测的胶体金试纸条，在干烟草和湿烟草中三唑醇的检出限分别为5 mg/kg和3 mg/kg。许俊丽等[44]利用纳米金标记高亲和、高特异性戊唑醇单克隆抗体，制备了戊唑醇免疫层析试纸条，可在15 min内实现小麦、黄瓜和甘蓝中戊唑醇的定性与半定量分析，检出限为6.25 ng/mL，与LC-MS/MS的检测结果一致。崔廷婷等[45]开发了基于苯醚甲环唑单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸，对果蔬中苯醚甲环唑的检出限为0.5 mg/kg。XU等[46]建立了一种简便、快速、灵敏的检测丙环唑的胶体金免疫层析试条，用于蔬菜(大白菜、生菜、大蒜、香葱、黄瓜、豌豆、小白菜)中丙环唑的定量检测，该试纸条的检测范围为0.5～80 ng/g。蒲小容等[47]开发了检测粮食、烟草中腈菌唑残留的胶体金试纸条，检测灵敏度高达0.01 μg/g。何方洋等[33]基于腈苯唑单克隆抗体组装了胶体金免疫层析试纸条，适用于蔬菜、水果等农作物中腈苯唑残留的检测。李拥军等[34]基于多克隆抗体发明了氟硅唑的胶体金免疫层析试纸条，检出限为25 μg/kg，可对水果、蔬菜及粮食谷物中的氟硅唑残留进行快速检测。
尽管胶体金试纸条应用普遍，但传统的胶体金颗粒作为信号探针，信号强度相对较弱。为了提高ICA的灵敏度，人们引入了各种具有高信号强度的新型材料作为探针。
其中，量子点(quantum dots，QDs)具有激发光谱宽且连续、光稳定性好、荧光强度高等优点，而利用微乳液技术将CdSe/ZnS量子点包裹起来制备成量子点珠(quantum dot beads，QBs)，可以显示出比相应QDs亮1 000倍的荧光，被认为是高灵敏度检测的理想示踪剂。WANG等[24]通过碳二亚胺法将抗戊唑醇单克隆抗体的—NH2与QBs上的—COOH偶联，制备QBs-mAb偶联物，组装成荧光免疫层析试纸条开发了戊唑醇的QBs-ICA方法，可在15 min内检测到0.02～1.25 ng/mL的戊唑醇，该方法的回收率与LC/MS-MS一致，表明该方法的可靠性和实用性。
赵赟等[48]使用H2O2辅助多巴胺氧化聚合为聚多巴胺(polydopamine，PDA)，在金纳米颗粒(gold nanoparticles，AuNPs)表面修饰均匀的PDA壳层，基于Au@PDA核壳纳米粒子和其对量子点荧光淬灭效应，成功构建了一种裸眼比色和荧光双信号检测的戊唑醇免疫层析试纸条。采用比色检测模式时，试纸条的视觉检出限为 1 μg/mL；而采用荧光检测模式时，其视觉检出限为 100 ng/mL。
时间分辨荧光微球(time resolved fluorescent microsphere，TRFM)中可包裹成千上万个荧光分子，大大提高了荧光的标记效率，也被应用于三唑类杀菌剂的免疫层析技术。CHEN等[49]免疫新西兰白兔制备了丙环唑特异性抗体，采用活泼酯法将TRFM表面的羧基连接到丙环唑抗体中的氨基上作为示踪剂，建立了基于时间分辨荧光微球的侧流免疫层析方法(TRFMs-LFIA)，其视觉检出限为100 ng/mL，定量检出限为1.92 ng/mL，且实际盲样的分析结果与HPLC-MS/MS相关性较好。
2.3 荧光免疫分析法
荧光免疫分析(fluorescence immunoassay，FIA)将荧光的敏感可测性与抗原抗体免疫反应的高特异性有机结合，具有灵敏度高、准确性好，易实现高通量、自动化检测等优势。SHENG等[50]以Eu3+和Sm3+为荧光标记物，建立了一种高灵敏的双标时间分辨荧光免疫分析方法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)，用于检测食品样品中的噻虫胺和烯唑醇。其中，烯唑醇的IC50为13.14 μg/L，检出限为0.029 μg/L，检测范围为0.029～814 μg/L，在小麦、玉米、大米、苹果、梨、葡萄、番茄、黄瓜、菠菜、白菜等食品中的添加回收率为79.3%～108.7%，与GC检测结果一致。
2.4 免疫亲和色谱法
免疫亲和色谱方法(immunoaffinity chromatogramphy，IAC)是基于免疫亲和层析柱进行分离和纯化的方法。将待测物抗体固定于色谱柱上，样品流过色谱柱时，其中的待测物与抗体选择性吸附，经洗脱后联合HPLC或 ELISA等方法检测样品中待测物的含量。由于抗体对特测物具有高特异性和高选择性，从而能对待测物进行高效的净化和浓缩，去除基质干扰。LIU等[51]使用溶胶-凝胶包埋烯唑醇单克隆抗体，制备了免疫亲和色谱柱，从含有大量脂肪和天然色素的基质中纯化烯唑醇。所制备的免疫亲和色谱柱的柱容量为0.180 mg/g，可以重复使用约20次而不会对柱容量产生较大的影响。
三唑类杀菌剂的免疫检测方法及对应检测能力见表1。
表1 三唑类杀菌剂的免疫检测方法
Table 1 Immunoassays of triazole fungicides
名称免疫检测方法抗体类型检测能力参考文献ELISApAbIC50为2.4 ng/mL[25]ELISApAb检出限为0.2 ng/mL,IC50为2.0 ng/mL[36]三唑酮ELISAmAb检出限为0.5 mg/kg,IC50为3.0 μg/L[20]ELISAmAb检测范围为1.09～25.35 ng/mL,IC50为5.25 ng/mL[42]AuNP-ICAmAb检出限为10 ng/g[42]AuNP-ICAmAb检出限为1 mg/kg[41]AuNP-ICAmAb干烟草、湿烟草的检出限分别为5、3 mg/kg[43]三唑醇ELISAmAb检测范围为2.29～43.61 ng/mL,IC50为9.98 ng/mL[42]AuNP-ICAmAb检出限为10 ng/g[42]ELISApAb检出限为(1.28±0.80) μg/L,检测范围为0.005～5 mg/L,IC50为(0.071±0.013) mg/L[21]烯唑醇TRFIApAb检出限为0.029 μg/L,IC50为13.14 μg/L[50]IACmAb柱容量为0.180 mg/g[51]ELISApAb检测范围为0.3～200 μg/mL,IC50为(4.9±0.5) μg/mL[22]腈菌唑ELISAmAbIC50为2.5 μg/L[27]AuNP-ICAmAb检出限为0.01 μg/g[47]ELISApAb检测范围为0.02～20 μg/mL[23]ELISAmAb检出限为0.123 ng/mL,检测范围为0.245～1.304 ng/mL,IC50为0.565 ng/mL[37]戊唑醇AuNP-ICAmAb检出限为6.25 ng/mL[44]AuNP-ICAmAb检测范围为0.02～1.25 ng/mL[24]ICAmAb比色模式的检出限为1 μg/mL,荧光模式的检出限为100 ng/mL[48]己唑醇ELISApAb检出限为0.1 ng/mL,检测范围为1～60 ng/mL,IC50为8 ng/mL[38]ELISAmAb检出限为0.3 μg/L,检测范围为0.5～3.8 μg/L,IC50为1.3 μg/L[27]戊菌唑ELISAmAb检出限为0.3 μg/L,IC50为1.0～1.2 μg/L[26]ELISAmAbIC50为0.7 μg/L[27]四氟醚唑ELISApAb检出限为2 ng/mL,检测范围为1.9～1 000 ng/mL[40]ELISAmAbIC50为0.5 μg/L[27]ELISAscFv检出限为1～2 ng/mL[28]ELISApAbdc-ELISA的检出限为(8.86±0.34) μg/L,IC50为(67.96±2.73) μg/L[35]苯醚甲环唑ELISApAbic-ELISA的检出限为4.58 μg/L,IC50为29.10 μg/L[31]AuNP-ICAmAb检出限为0.5 mg/kg[45]丙环唑AuNP-ICAmAb定量检出限为0.13 ng/g,视觉检出限为80 ng/g,检测范围为0.5～80 ng/g[46]TRFMs-LFIApAb定量检出限为1.92 ng/mL,视觉检出限为100 ng/mL[49]氟硅唑AuNP-ICApAb检出限为25 μg/kg[34]联苯三唑醇ELISAmAb检测范围为5～500 ng/mL,IC50为1 ng/mL[52]三环唑ELISAmAb检测范围为0.1～10 ng/mL[53]环丙唑醇ELISAmAbIC50为1.0 μg/L[27]
注：mAb表示单克隆抗体；pAb 表示多克隆抗体；scFv 表示重组单链抗体
3 讨论与结论
目前，大部分三唑类杀菌剂都已经制备出了抗体并建立了免疫检测方法，但是还有一些三唑类杀菌剂如：粉唑醇、叶菌唑等还没有半抗原合成及免疫检测方法的报道。已报道的三唑类杀菌剂的抗体以多克隆抗体和单克隆抗体为主，仅有四氟醚唑制备了scFv。虽然多克隆抗体和单克隆抗体制备技术成熟、应用广泛，但是其对动物不友好，且抗体稳定性差，批次之间差异大，不易于纯化、标记和大批量生产。重组抗体制备周期短，可以实现分子水平定向改造，因此具有广阔的应用前景。
基于制备的三唑类杀菌剂抗体，已建立了酶联免疫分析方法、免疫层析试纸条、荧光免疫分析方法和免疫亲和色谱法等多种免疫检测技术，而不同免疫检测方法也具有各自的优、缺点(表2)。酶联免疫分析方法是现阶段三唑类杀菌剂免疫检测技术中最常见的一类，具有特异性强、灵敏度高的优势，但操作步骤繁琐，检测时间较长。免疫层析条体积小而便携、结果判定简单直观，可应用于田间地头实现现场快速检测，但灵敏度和精确度普遍偏低，多用于定性及半定量检测。荧光免疫分析以荧光物质作为标记材料，准确度高，但有一定的技术成本且易受环境因素的影响。免疫亲和色谱法可高效地从复杂基质中分离纯化目标分析物，是理想的样品前处理方法，但其还需与HPLC、ELISA或其他方法联用来实现定性定量。
表2 三唑类杀菌剂不同免疫检测方法的优缺点
Table 2 Advantages and disadvantages of different immunoassays for triazole fungicides
免疫检测方法优点缺点酶联免疫分析法特异性强、灵敏度高、检测结果准确、适合大批量样品的检测操作繁琐耗时,自动化程度低免疫层析试纸条简单快捷、结果直观、适合现场大批量初筛灵敏度和精确度普遍较低,多用于定性检测荧光免疫分析法线性范围宽、重复性和稳定性好极易受到环境因素的影响免疫亲和色谱法可高效分离纯化目标分析物仅作为前处理方法,需结合其他方法进行定性和定量
尽管三唑类杀菌剂的免疫检测技术已经取得了较大的进展，但是目前我国GB 202763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中推荐的三唑类杀菌剂的检测方法仍以LC-MS和GC-MS等仪器分析方法为主。LC-MS和GC-MS等仪器方法的灵敏度高，对大部分三唑类农药的检出限可达到0.001～0.05 mg/kg，而且可实现对多种三唑类杀菌剂的同时检测[54-56]。从已经建立的三唑类杀菌剂免疫检测方法来看，三唑醇、戊唑醇、己唑醇、戊菌唑、四氟醚唑、丙环唑、三环唑、烯唑醇、联苯三唑醇的免疫检测方法的灵敏度已达到甚至超过LC-MS和GC-MS的检出限，但仍有部分三唑类杀菌剂的免疫检测方法灵敏度较低，如三唑酮、腈菌唑、苯醚甲环唑、氟硅唑、环丙唑醇等。由于免疫检测方法是以抗原、抗体之间的特异性结合为基础，因此在特异性和选择性方面具有显著优势，但也造成目前所建立的免疫检测方法只能检测某一种三唑类杀菌剂，而无法像仪器方法一样能够同时对多种三唑类杀菌剂的残留进行多残留检测。这就需要将多种特异性抗体结合起来，开发多残留快速检测的免疫分析方法，从而提高检测效率和应用范围。此外，传统的仪器分析方法依赖于大型且昂贵的设备，对操作人员的专业要求较高，难以满足现如今对杀菌剂残留快速监测的现实需求。免疫检测技术一定程度上弥补了传统仪器分析方法的不足，应用前景广阔。
4 展望
三唑类杀菌剂的免疫检测技术还蕴藏着巨大的发展空间，未来可以从以下几个方向展开相应的研究工作：
(1)针对未有免疫检测方法或抗体灵敏度差的三唑类杀菌剂，设计合成新的更为接近母体结构的半抗原，扩大三唑类杀菌剂抗体的种类，提高抗体的灵敏度和特异性。
(2)基于分子生物学技术，开发制备三唑类杀菌剂的基因工程抗体、纳米抗体等，提高抗体的稳定性，减小批次间差异。
(3)结合纳米材料、生物传感器、免疫芯片、生物条形码等新技术，开发更为灵敏、便捷的高通量免疫检测方法，提高检测灵敏度，降低基质干扰。
(4)开发能够同时快速检测多种三唑类杀菌剂残留的免疫检测方法，实现三唑类杀菌剂多残留现场快速检测。
(5)将免疫检测方法与云计算、大数据、人工智能等结合，对食品采收、加工、贮藏和运输等各个过程中三唑类杀菌剂的残留进行数字化和智能化监控。
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