便秘(constipation)是一类常见的胃肠道疾病，其临床症状主要表现为排便困难，排便不完全或伴有阻塞感，每周自发排便次数少于3次，粪便干硬等。目前，全球便秘疾病的患病率大概为14%[1-3]。有研究表明，长时间的便秘会破坏肠黏膜屏障，致使肠黏膜通透性提升，有害物质更易通过受损后的屏障，从而引发多种疾病[4-5]。慢性便秘常带来更严重的炎症反应，加重便秘程度和肠黏膜屏障的破坏[6]。而目前用于治疗便秘的药物，部分具有较强的毒副作用，且容易产生药物依赖。例如，在JOHANSON等[7]的试验中，应用鲁比前列酮能够促进肠道蠕动缓解便秘，但伴随有恶心等副作用，并且对于便秘导致的肠道炎症并无缓解作用。如今，通过补充一定的益生菌已成为治疗便秘的重要手段，已有研究表明益生菌能缓解肠道炎症[8-9]。在缓解便秘时，双歧杆菌是目前选用较多的益生菌，BAZZOCCHI等[10]使用双歧杆菌与乳杆菌组合，缓解了患者的便秘，并在便秘患者肠道中检测到该组合的所有菌株的定植，益生菌作为一种药物替代品在缓解便秘的同时不会存在毒副作用，但其缓解便秘的具体机制还有待探究。基于此，本研究从不同株双歧杆菌对宿主的胃肠调节肽、神经递质、代谢产物和免疫方向的影响来探究双歧杆菌缓解便秘的可能机制。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
盐酸洛哌丁胺(loperamide hydrochloride)胶囊，西安杨森制药有限公司；阿拉伯树胶粉、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、活性炭粉，国药集团化学试剂公司；小鼠胶质脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)ELISA试剂盒、小鼠血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)ELISA试剂盒、小鼠胃泌素(gastrin，Gas)ELISA试剂盒、小鼠胃动素(motilin，MTL)ELISA试剂盒，南京森贝伽生物；小鼠白细胞介素10(IL-10)ELISA试剂盒、小鼠白细胞介素17(IL-17)ELISA试剂盒、小鼠白细胞介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒，美国R&D Systems公司；小鼠CD4单克隆抗体(GK1.5)、小鼠FOXP3单克隆抗体，美国英杰生命技术有限公司；小鼠CD25单克隆抗体，美国Biolegend；胞内因子固定破膜剂，福麦斯生物。
真空冷冻干燥机，美国LABCONCO公司；Multiscan Go多功能酶标仪、1300-ISQ型Trace GC-MS、Sorvall MX120+型超高速离心机，美国Thermo公司；Attune NxT AFC2声波聚焦流式细胞仪，美国Life Technologies；SCIENTZ-48型组织破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2 菌株培养活化
本研究使用的两歧双歧杆菌CCFM1167(保藏编号：FHNFQ25M12)(Bifidobacterium bifidum)、两歧双歧杆菌FXCJ32M2(B.bifidum)和短双歧杆菌FBJSJS1M2(B.breve)均取自江南大学食品生物技术研究中心菌种保藏库。用一次性接种环取少量-80 ℃冷冻保藏的菌液在添加0.1%(质量分数)半胱氨酸的MRS固体培养基上进行划线分离，37 ℃厌氧培养48 h；使用接种环挑取单菌落接种于添加0.1%(质量分数)半胱氨酸的液体MRS培养基中，37 ℃厌氧培养20 h，以3%的接种量传代2次后进行扩大培养，37 ℃厌氧培养24 h。4 ℃下，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌泥，用无菌生理盐水洗涤2次后重悬于100 g/L脱脂乳至菌体密度达到6×109 CFU/mL，根据每次的灌胃量分装，然后冻干成菌粉，于-80 ℃冻存。灌胃时，将分装好的菌粉用一定体积的无菌水重悬为菌体密度达到6×109 CFU/mL的菌悬液[11]。菌粉冻存后第14天对用无菌水重悬后的菌液进行活菌计数，结果表明冻存2周不会引起双歧杆菌活菌数量级的变化，因此动物实验中每2周制备一次菌粉。
1.3 动物实验设计
30只5周龄的雄性SPF级BALB/c小鼠，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。动物伦理编号：JN.No20201130b1260125。饲养的环境温度为(23±2) ℃，相对湿度为(50±10)%，控制灯光模拟12 h光照和12 h黑夜。小鼠随机均分为5组：空白组、模型组、两歧双歧杆菌CCFM1167组(CCFM1167)、两歧双歧杆菌FXCJ32M2组(FXCJ32M2)和短双歧杆菌FBJSJS1M2组(FBJSJS1M2)。适应性饲养1周后进入干预期。干预期持续4周，空白组与模型组每天灌胃0.2 mL 100 g/L脱脂乳，两歧双歧杆菌CCFM1167组、两歧双歧杆菌FXCJ32M2组、短双歧杆菌FBJSJS1M2组分别灌胃0.2 mL无菌水重悬的相应菌液(6×109 CFU/mL)。第3周开始造模，灌胃造模1 h后，开始灌胃双歧杆菌和脱脂乳，空白组灌胃0.2 mL无菌水，其他组灌胃0.2 mL盐酸洛哌丁胺溶液，造模第1周盐酸洛哌丁胺的灌胃量为10 mg/(kg·bw)，造模第2周盐酸洛哌丁胺的灌胃量为15 mg/(kg·bw)，造模第3周盐酸洛哌丁胺的灌胃量为20 mg/(kg·bw)。动物实验按图1所示流程进行。
图1 动物实验流程
Fig.1 Animal experiment schedule
1.4 实验指标测定
1.4.1 便秘相关指标测定(首粒黑便时间、粪便含水量、小肠推进率)
在动物实验第34天，完成造模灌胃2 h后，每只小鼠灌胃0.2 mL墨汁，记录灌入墨汁至排出首粒黑便所需要的时间，为首粒黑便时间。
在动物实验第35天，将每只小鼠放入垫有无菌吸水纸的透气笼盒中收集粪便，称重后冻干，按照公式(1)计算粪便的含水量：
粪便含水量
(1)
在动物实验的第35天晚上对小鼠进行禁食不禁水的处理。12 h后，在动物实验第36天，空白组灌胃无菌水，模型组与菌株干预组灌胃0.2 mL的20 mg/(kg·bw)盐酸洛哌丁胺悬浊液。1 h后，每只小鼠灌胃0.2 mL墨汁，30 min后麻醉处死小鼠，打开小鼠腹腔，剪取小肠肠段，测量幽门至盲肠上端为“小肠总长度”，幽门至墨汁前沿为“墨汁推进距离”，按照公式(2)计算小肠推进率：
肠道推进率
(2)
1.4.2 小鼠粪便中短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的测定
收集到的小鼠粪便冻干后参照文献[12]的方法进行浸泡，酸化，用无水乙醚萃取后使用GC-MS测定粪便中的SCFAs含量。使用软件Xcalibur分析结果。
1.4.3 小鼠结肠组织IL-10、IL-17、L-1β水平的测定
将-80 ℃保藏的结肠组织缓慢解冻后，除去附着的脂肪，按照1∶9(质量比)添加预冷的无菌PBS溶液与2粒灭菌过的氧化锆珠，一起放入离心管，用组织破碎仪对组织进行破碎。然后在4 ℃、6 000 r/min条件下离心10 min，取上清液[11]。按照相关ELISA试剂盒说明书提供的步骤进行操作，测定小鼠结肠匀浆IL-10、IL-17和IL-1β的含量。
1.4.4 小鼠脾脏组织调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)比例的测定
用流式细胞仪测定小鼠脾脏Treg细胞的比例。具体方法如下：
(1)将小鼠解剖后无菌取脾脏，将脾脏研磨，过200目筛后重悬于1 mL无菌PBS溶液中，制备成细胞浓度为2×106 CFU/mL的单细胞悬浮液。
(2)取100 μL步骤(1)得到的单细胞悬浮液，加0.3 μL单克隆抗体CD4-FITC和0.35 μL单克隆抗体CD25-APC，在冰上避光孵育20 min，进行细胞表面蛋白的染色，300×g，4 ℃离心5 min，去上清液。加500 μL的PBS溶液，轻弹混匀，300×g，4 ℃离心5 min，去上清液。
(3)加1 mL固定破膜液，轻弹混匀，冰上避光孵育60 min，对单细胞进行固定破膜，300×g，4 ℃离心5 min，去上清液。加500 μL的PBS溶液，轻弹混匀，300×g，4 ℃离心5 min，去上清液。
(4)加100 μL的PBS溶液，轻弹混匀，添加1.25 μL单克隆抗体FoxP3-PE，冰上避光孵育60 min，300×g，4 ℃离心5 min，去上清液，400 μL的PBS溶液重悬。
(5)使用流式细胞仪检测Treg细胞占CD4+细胞的比例。
2.结果与分析
1.4.5 小鼠血清中便秘相关神经递质的测定
取-80 ℃冰箱冻存的血清40 μL，按照小鼠MTL、VIP、BDNF和GasELISA试剂盒说明书进行操作，通过外标法获得标准曲线，从而根据吸光度计算出样品中所含待测物质的浓度。
2.1 两歧双歧杆菌CCFM1167可缓解便秘
便秘症状表现为为肠道内容物转运能力减弱，导致转运时间增加。患者症状常表现为排便频率下降、大便干结、排便敏感性下降，并可能伴有腹痛和腹泻[13]。造模使用的盐酸洛哌丁胺是一种阿片受体抑制剂[14]，可以抑制肠道平滑肌收缩，减缓肠道蠕动，从而降低肠道转运时间而达到便秘的病征[15]。本研究用肠道推进率和首例黑便时间来反应肠道转运能力，用粪便含水量作为小鼠便秘程度的另一项指标，同时评价3株双歧杆菌缓解小鼠便秘的效果[16]。
如图2所示，造模后，模型组小鼠便秘相关指标显示造模成功。两歧双歧杆菌CCFM1167组小鼠的粪便含水量相对于模型组有上升趋势，首例黑便时间显著减少，小肠推进率显著提升，且3种表观指标均优于两歧双歧杆菌FXCJ32M2组；短双岐杆菌FBJSJS1M2缩短了首粒黑便时间，增加了小肠推进率，对粪便的含水量无显著影响，根据《保健食品评价技术规范》中缓解便秘阳性结果的评价标准，提示CCFM1167具有缓解便秘的作用。以往的研究表明，便秘会导致机体出现轻微的炎症[17]，我们推测双歧杆菌可能通过缓解炎症来实现便秘的缓解。
2.2 两歧双歧杆菌CCFM1167缓解便秘途径解析
2.2.1 两歧双歧杆菌CCFM1167上调粪便中乙酸和戊酸的含量
有报道表明，乙酸含量增加能促进肠道蠕动[18]。如图3所示，造模后，模型小鼠粪便中SCFAs的含量显著降低。而CCFM1167显著提升了便秘小鼠粪便中乙酸和戊酸的含量，另两组干预组小鼠粪便中SCFAs含量无显著性变化。有研究表明，SCFAs可以抑制促炎细胞因子的释放[19]，促进抑炎细胞因子IL-10的产生[20]，进而减轻炎症，提示我们可以从炎症和SCFAs的关系去讨论缓解便秘的差异。SCFAs能刺激肠道蠕动缓解便秘，降低肠道局部微环境的pH值，抑制致病菌与条件致病菌的生长代谢[21]，从而避免肠道免疫系统由于抵御致病菌而造成的炎症反应。
a-首粒黑便时间；b-小肠推进率；c-粪便含水量
图2 小鼠便秘相关指标
Fig.2 Constipation-related indicators in mice
注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1(与模型组比较)(下同)
a-乙酸；b-丙酸；c-丁酸；d-异丁酸；e-戊酸；f-异戊酸
图3 小鼠粪便中SCFAs含量
Fig.3 Contents of short-chain fatty acids in the mice feces
2.2.2 两歧双歧杆菌CCFM1167对便秘相关神经递质水平的影响
如图4所示，小鼠灌胃盐酸洛哌丁胺后，Gas和BDNF含量显著降低，VIP显著提升，MTL无显著性差异。该结果表明，便秘会引起胃肠活性肽和神经营养因子水平的变化，通过影响胆碱类、单胺类以及肽类等神经递质的释放，抑制神经元细胞的分化和生长，对肠道平滑肌的收缩与舒张产生影响，抑制肠道蠕动。各双歧杆菌干预组均能下调便秘小鼠的VIP含量，对于Gas和BDNF没有显著性影响。
a-Gas；b-BDNF；c-VIP；d-MTL
图4 小鼠便秘相关神经递质含量
Fig.4 Contents of constipation-related neurotransmitters in mice
2.2.3 两歧双歧杆菌CCFM1167上调Treg细胞水平以抑制炎症
如图5所示，小鼠便秘造模后，结肠组织中抑炎因子IL-10浓度降低，促炎因子IL-17和IL-1β浓度升高。如图5-a～图5-c所示，CCFM1167可回调小鼠结肠组织中的IL-10含量，并降低IL-17和IL-1β的浓度。FXCJ32M2显著提升IL-1β的含量，对IL-10和IL-17没有显著影响。FBJSJS1M2显著下调了便秘小鼠IL-1β和IL-17的含量，对IL-10无显著性影响。如图5-d和图5-e所示，造模后小鼠脾脏Treg细胞比例显著降低，CCFM1167显著上调小鼠脾脏内的Treg细胞比例，而两歧双歧杆菌FXCJ32M2和短双岐杆菌FBJSJS1M2对Treg含量无显著性影响。Treg细胞是一类CD4+T细胞的子细胞群，具有免疫抑制作用，能分泌TGF-β、IL-10等细胞因子，抑制炎症[22]。而CD4+FoxP3+Treg细胞分泌的IL-10能刺激产生更多的FoxP3+Treg细胞[23]。CCFM1167能同时提升Treg和IL-10的含量，下调IL-17的含量，且对便秘具有显著的缓解作用。有研究表明，益生菌可以促进肠道生长并强化结肠炎小鼠肠道上皮细胞的屏障功能，从而减轻结肠受损程度[24]。因此，我们推测CCFM1167可能通过减轻炎症来缓解便秘。
a-IL-10；b-IL-17；c-IL-1β；d-Treg；e-小鼠脾脏组织中CD4+ CD25+ FoxP3+占T细胞中的比例
图5 小鼠炎症指标
Fig.5 Indicators of inflammation in mice
2.2.4 便秘表观评价指标与生化指标间相关性分析
根据前期的研究结果，对便秘表观评价指标与生化指标进行Pearson相关性分析。如图6-a所示，小肠推进率与IL-17具有显著负相关性，粪便含水量则和乙酸、戊酸、IL-10水平和Treg细胞比例呈现显著的正相关。因此推测，乙酸和戊酸能够促进便秘小鼠Treg细胞分泌更多的IL-10，下调IL-17的含量，减轻肠道的炎症反应，从而缓解便秘；乙酸和戊酸水平的升高能够提升粪便含水量，使粪便保持湿润更易排出，缓解便秘。
SCFAs是肠道菌群的重要代谢产物，实验结果表明两歧双歧杆菌对便秘小鼠粪便中SCFAs的提升具有差异性。目前有研究报道SCFAs能够降低局部肠道微环境的pH值，抑制病原菌的繁殖，减轻肠道的炎症。为了探究具体哪一种SCFAs对炎症反应具有缓解作用，进一步分析了不同SCFAs与炎症指标的相关性。从图6-b可以看出，乙酸与Treg和IL-10显示出显著的正相关性，异戊酸仅与IL-10呈显著正相关，推测起主要作用的是乙酸。
a-便秘表观评价指标与各生化指标相关性； b-SCFAs与各炎症指标相关性
图6 各指标间的相关性分析
Fig.6 Correlation analysis among indicators
3 结论
本研究发现两歧双歧杆菌CCFM1167能够改善洛哌丁胺构建的便秘小鼠的各项便秘相关指标，表明其能够缓解便秘。同时发现CCFM1167能够改善便秘小鼠炎症的各项相关指标，减轻结肠炎症。对便秘相关胃肠调节肽、结肠炎症因子和代谢产物SCFAs进行相关性分析表明，乙酸水平与Treg和IL-10显示出显著的正相关性，推测CCFM1167可能通过提升便秘小鼠肠道中乙酸的含量，上调IL-10与Treg细胞含量，减轻肠道炎症并提升粪便含水量，最终缓解便秘。
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