保鲜技术的研究是食品领域一项重要的研究内容，果蔬的易腐烂特性和货架期等原因使得果蔬的保鲜研究受到广泛关注。目前世界范围果蔬贮藏保鲜常用方法有低温保鲜、气调保鲜、超声波保鲜、化学保鲜、微生物拮抗保鲜、植物精油保鲜、涂膜保鲜等，其中涂膜剂保鲜技术是主要的研究方向之一[1]。涂膜保鲜、是利用可食性涂膜剂干燥后在果蔬表面形成的一层无色半透明薄膜而发挥保鲜作用。涂膜构成气体与水蒸气迁移的屏障，减少外界气体和微生物对果蔬的影响，抑制果蔬的呼吸作用，减少蒸腾失水，同时延缓糖、维生素、矿物质元素等营养成分的氧化分解，从而保持果蔬的品质以及以及延长货架期[2]。使用可食性涂膜剂不仅可以避免对环境造成化学污染，还可以减少一次性包装的使用，是一种既环保又安全的保鲜方法[3]，是未来果蔬保鲜广泛应用到实际的一个趋势。
普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性黏质多糖。其水溶液成膜性好，高度不透氧，可以降低果实的呼吸速率，延缓果实的腐败程度；还可以抑制微生物菌群的呼吸作用，减少微生物的增长，延长果实的货架期。又由于所形成的膜透明，不影响外观品质和色泽。目前已有研究表明，普鲁兰多糖涂膜的保鲜技术在食品保鲜行业中广泛应用，对多种水果具有很好的保鲜作用[4]。普鲁兰多糖复合液被膜可以维持枇杷的感官品质和营养价值，延长果实货架期；普鲁兰多糖水溶液被膜有效降低荔枝的褐变，维持荔枝的新鲜程度，有效保持了可溶性固形物、pH、可滴定酸、维生素C的营养含量[5]。
樱桃番茄(Lycopersicon esculenlum var)，又称袖珍番茄、迷你番茄，其果实表面光亮、色泽鲜艳、口味独特，富含番茄红素、维生素和矿物质等多种营养成分，深受消费者喜爱。但番茄属于呼吸跃变型果实，采摘后易失水萎蔫而衰老，不易贮存，从而失去商业价值[6]。关于番茄保鲜的研究已有很多报道，如用植物精油对樱桃番茄保鲜效果研究[7]；利用PBAT/PE气调保鲜膜来提高番茄货架期[8]；通过超声波辅助涂膜提高番茄的果实品质[9]。而普鲁兰多糖涂膜对樱桃番茄的保鲜效果研究较少，特别对涂膜的最适浓度以及保鲜机理尚不清楚，限制了这种安全环保涂膜剂在番茄保鲜中的应用。本研究探究普鲁兰多糖对樱桃番茄的保鲜效果以及作用机制，为延长樱桃番茄的货架期提供可行的技术参考[10]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
樱桃番茄购于水果超市，果实个体均匀、色泽相近、新鲜健康；普鲁兰多糖购于生工(上海)生物工程有限公司；其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平，瑞士METTLER-TOLEDO公司；CNT65数显糖度仪，杭州陆恒生物科技有限公司；CHB-100金属浴，上海智城分析仪器制造有限公司；HPX-9272MBE电热恒温培养箱，上海博迅实业有限公司； TA.XTplus物性测试仪，英国Stable Micro System公司；CFX connet荧光定量PCR仪,美国BIO-RAD公司；UH5300紫外可见光分光光度计，日立高新技术公司；PK-S22恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；Heraeus pico17微量高速离心机，美国Thermo公司；905超低温冰箱，美国Thermo公司。
1.3 实验方法
1.3.1 普鲁兰多糖涂膜的配制
配制0.1 g/mL的普鲁兰多糖溶液，用0.22 μm 的水系滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。以0.1 g/mL普鲁兰多糖为母液，稀释配制0.005、0.01、0.02 g/mL的普鲁兰多糖涂膜工作液。
1.3.2 设计与处理
试验采用随机分组设计，设有0.005、0.01、0.02 g/mL的试验组和蒸馏水对照组，每个试验组72个果实，3组重复。
樱桃番茄去除果蒂，依次用清水清洗2次；1%的次氯酸钠溶液中浸泡5 min；清水清洗2次，晾干备用。处理后的樱桃番茄分别置于0.005、0.01、0.02 g/mL的普鲁兰多糖涂膜液中浸泡1 min(以蒸馏水为对照组)，取出沥水并晾干，并置于保鲜盒内，25 ℃室温保存。
1.3.3 失重率测定
失重率采用称重法[11]，计算如公式(1)所示：
(1)
式中：η，失重率，%；W1，初次称量总质量，g；W2，再次称量总质量，g。
1.3.4 硬度测定
使用质构仪进行测定果实硬度(采用P/36 R探头，条件为：测前速度：3 mm/s；测定速度：1 mm/s；测定后速度：1 mm/s；2次压缩之间停留时间为5 s；穿刺距离3 mm；弹性力度10 g。
1.3.5 可滴定酸(titratable acid，TA)
采用酸碱滴定法测定[12]，滴定至溶液初显粉色并在0.5 min内不褪色时为滴定终点(pH=8.1～8.3)，记录氢氧化钠滴定液的用量，重复3次。
1.3.6 总可溶性固形物(total soluble solids，TSS)含量测定
采用数字式折射仪测量。测量折光度，每个果实测定3次并计算平均值。
1.3.7 番茄红素含量测定
称取1 g果实组织，液氮研磨，加10 mL V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1至于超声中；充分溶解30 min 后，加3 mL H2O，振荡10 s；在冰上静置10 min使液相分离；测定有机相在503 nm下的吸光度并计算含量。
1.3.8 丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定
参照《果蔬采后生理生化实验指导》中的硫代巴比妥酸法测定[13]。
1.3.9 聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)测定
采用南京建成生物工程研究所的果胶酶测试盒(货号:A140-1-1；DNS比色法)，进行测定。
1.3.10 SlPG1基因表达量测定
提取樱桃番茄果实总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，番茄SlUBI3(正向引物：5′ AGGTTGATGACACTGGAAAGGT 3′；反向引物：5′ AATCGCCTCCAGCCTTGTTGTA 3′)作为内参基因，利用实时荧光定量聚合酶链式反应-SYBR Green方法检测果实中SlPG1基因(正向引物:5′ AGTCTTTGGGCTTGCAAAACG 3′；反向引物:5′ CTGGCGCGGAGATCTTTACT 3′)的相对表达量[14]。采用Step One Realtime PCR仪(AB Applied Biosystems)，反应条件为：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39个循环。
1.4 数据处理
Microsoft Excel 2018统软件分析和整理基础数据，GraphPad Prism 8进行统计学分析并作图。
2 结果与分析
2.1 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄失重率变化的影响
新鲜水果在采后贮藏过程中仍然保持呼吸作用和蒸腾作用，导致水分丢失，从饱满状态逐渐变为皱缩形态，导致果实品质下降和衰老腐烂，失去商品价值。在贮藏过程中，水分散失导致果实中营养物质的损耗，因此常用失重率评定营养物质损失的程度。不同浓度普鲁兰多糖处理对樱桃番茄失重率的影响变化曲线如图1所示。随着贮藏时间的延长，樱桃番茄的失重率均呈现上升趋势，但对照组失重率较普鲁兰糖处理组明显更高。其中0.01 g/mL和0.02 g/mL普鲁兰糖处理后，果实失重率明显低于对照组，在贮藏14 d之后，0.01 g/mL和0.02 g/mL普鲁兰糖处理组与对照组之间差异极显著(P<0.05)，表明0.01 g/mL 和0.02 g/mL普鲁兰多糖形成的涂膜具有良好的密封性，可以有效地阻碍水分的散失，从而降低失重率，延长果实的货架期并维持果实品质。
图1 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄失重率的影响
Fig.1 Effects of pullulan polysaccharides coating treatment on weight loss ratio
注：图中不同字母表示显著性差异(下同)
2.2 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄硬度变化的影响
新鲜水果在采摘及贮藏阶段由于细胞壁发生酶解，导致果实硬度下降，因此硬度是反映果实品质和贮藏效果的一个重要指标[15]。检测普鲁兰多糖处理对果实硬度的影响，随着贮藏时间延长，果实硬度均呈下降趋势，但处理组果实硬度下降趋势较慢。特别是在贮藏后期(两周后)，0.01 g/mL和0.02 g/mL处理组果实硬度下降的速度显著低于对照组(P<0.05)，并且在整个贮藏周期中处理组果实的硬度均高于对照组。说明普鲁兰多糖涂膜处理可以有效延缓樱桃番茄硬度的降低，从而使果实保持较好的品质[16]。
图2 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄硬度的影响
Fig.2 Effects of pullulan polysaccharides coating treatment on hardness
2.3 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄TA和TSS含量变化的影响
TA和TSS是影响果实风味品质的重要因素[17]，因此本研究测定了贮藏果实中TA和TSS的含量变化。可滴定酸是果实中所有有机酸的统称,在果实成熟期，有机酸作为呼吸基质，是细胞内很多生化过程所需中间代谢物的提供者，其含量随着贮藏时间延长而下降。图3表明，在贮藏的过程中，TA的含量均呈下降趋势，但试验组与对照组比，TA在两者之间无显著差异。TSS是指果实中能够溶于水的糖、酸、维生素、矿物质等物质的含量，糖分是其中最主要的部分[18]。由图4可知，果实TSS含量随着贮藏时间的延长呈现下降的趋势，普鲁兰多糖试验组与对照组比，两者之间无明显差异。以上结果说明普鲁兰多糖涂膜处理对贮藏期樱桃番茄果实中TA和TSS含量的维持无显著作用。
图3 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄 可滴定酸含量的影响
Fig.3 Effects of pullulan polysaccharides coating treatment on TA content
图4 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄可溶性 固形物含量的影响
Fig.4 Effects of pullulan polysaccharides coating treatment on TSS content
2.4 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄的番茄红素含量变化的影响
番茄红素是类胡萝卜素的一种，抗氧化能力较强，可清除体内的自由基，具有预防多种癌症、提高免疫力等生理功能[19]。番茄红素在番茄果实含量丰富，是评定番茄果实品质的一个重要指标。如图5所示，在贮藏期间，处理组和对照组中番茄红素含量呈先上升后下降的趋势，在贮藏14 d之后0.01 g/mL和0.02 g/mL处理组与对照组相比下降速度更为缓慢，处理组中番茄红素含量显著高于对照组(P<0.05)。表明普鲁兰多糖涂膜处理能有效地保持果实番茄红素含量，从而维持樱桃番茄的营养价值。
图5 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄番茄红素的影响
Fig.5 Effects of pullulan polysaccharides coating treatment on lycopene content
2.5 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄的MDA变化的影响
果实在衰老和腐败过程中会发生质膜过氧化，MDA则是质膜过氧化作用的产物，因此MDA含量能够衡量果实衰老和质膜过氧化的程度[20]。如图6所示，在贮藏过程中，樱桃番茄中MDA含量随时间的延长而升高，贮藏9 d之后试验组的MDA含量显著低于对照组(P<0.05)，其中0.01 g/mL和0.02 g/mL的处理组效果更明显。由此说明，普鲁兰多糖涂膜处理对贮藏期番茄果实中MDA含量的增加有延缓作用。
图6 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄丙二醛含量的影响
Fig.6 Effects of pullulan polysaccharides coating treatment on MDA content
2.6 普鲁兰多糖涂膜处理对樱桃番茄的PG活性以及SlPG1基因表达量的影响
PG是一种细胞壁结合蛋白,可以催化细胞壁成分果胶分子中α-1-4-半乳糖苷键的裂解，从而使细胞壁结构解体导致硬度降低、果实软化，加速果实的衰老与腐败。PG将果胶水解为低脂果胶和果胶酸，导致果实发生凹陷、软化失水等现象，对果品品质尤其是硬度的破坏很大，严重影响果实的保鲜和品质[9]。如图7所示，处理组的果胶酶含量均低于对照组，其中0.01 g/mL和0.02 g/mL处理组呈显著差异,这说明0.01 g/mL和0.02 g/mL实验组能有效抑制果胶酶，使酶活性维持在较低水平，更有利于果实的保鲜和贮藏。SlPG1基因是合成PG的关键基因之一，参与了PG的合成。在樱桃番茄贮藏期间，SlPG1基因表达量升高，合成的PG含量增加，PG活性急剧上升，果实硬度降低，果实软化程度升高，从而加速了果实的衰老腐败。如图8所示，用实时荧光定量PCR分析SlPG1基因在不同处理条件下的表达量差异，处理组中SlPG1基因的相对表达量均低于对照组，0.01 g/mL 和0.02 g/mL实验组呈显著差异(P<0.05)。这进一步说明，0.01 g/mL和0.02 g/mL普鲁兰多糖涂膜处理通过抑制PG合成关键基因SlPG1的表达从而能降低PG的活性，延缓了果实的衰老，延长樱桃番茄的货架期。
图7 普鲁兰多糖涂膜处理对PG 酶的影响
Fig.7 Effects of pullulan polysaccharides coating treatment on PG gene
图8 普鲁兰多糖涂膜处理对SlPG1基因表达量的影响
Fig.8 Effects of pullulan polysaccharides coating treatment on PG activity
3 结论与讨论
本研究对普鲁兰多糖涂膜处理樱桃番茄的保鲜机理进行探讨，确定了针对樱桃番茄的最佳保鲜浓度，评价了普鲁兰多糖处后的保鲜效果，探究了普鲁兰多糖的保鲜机理，对提高樱桃番茄的保鲜提供了理论支撑和技术参考。本文研究得出，0.01 g/mL和0.02 g/mL普鲁兰多糖涂膜具有较好的保鲜效果较好，在该浓度处理后，番茄果实失重率显著降低，MDA含量、PG活性以及SlPG1基因(合成PG的关键基因)表达量保持较低的水平，硬度能够有效地保持，从而提高了樱桃番茄的贮藏期，并且普鲁兰多糖处理可以有效减缓番茄红素的降解速率，保持贮藏期番茄较好的营养价值。综合考虑保鲜效果和经济因素，0.01 g/mL普鲁兰多糖涂膜为樱桃番茄的适宜保鲜方式。
果实水分散失、硬度是保鲜研究中常用的感官指标，决定果实的口感、风味；果实中的有机酸、可溶性固形物、番茄红素是重要的营养成分，决定果实的品质、成熟衰老程度，是果实贮藏保鲜的重要生化指标。本研究中，普鲁兰多糖涂膜处理能够有效减少樱桃番茄水分的散失、番茄红素的降解，保持较高的硬度，从而维持果实较好的口感和品质。此外，MDA是果实在衰老和腐败过程中发生质膜过氧化作用的主要产物，造成细胞膜的损伤，从而加速果实的衰老腐败；PG是细胞壁水解有关的酶，SlPG1基因是编码PG的关键基因，这些物质的含量和活性可以表征果实的成熟老化程度。研究结果表明，试验组中樱桃番茄MDA含量、PG活性以及SlPG1表达量保持在较低水平，说明普鲁兰多糖涂膜处理有效抑制了质膜过氧化反应，维持较高的果实硬度，从而延缓了果实的衰老、延长果实的贮藏。
普鲁兰多糖作为一种可食用性果蔬保鲜剂，已经得到广泛研究和应用。一方面，由于普鲁兰多糖具有较好的成膜性和较强的气密性，有效地抑制了樱桃番茄外表面微生物菌群的呼吸作用，减少了微生物的生长。另一方面，普鲁兰多糖涂膜处理还可以通过延缓水分、营养成分的散失，诱导果实硬度关键基因的表达而维持果实硬度等方式延长番茄的货架期。本研究为开发绿色、经济、安全、可行的新型可食用涂膜保鲜剂提供了技术支持。
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