永丰辣酱是湖南省双峰县的一种地方特色调味品,其主要原料为小麦、糯米和鲜辣椒,一般以小麦为主料制曲成熟后加入盐水发酵,后期再分别加入糯米和鲜辣椒混合发酵,其具有香、咸、甜等风味,营养丰富、食用方便[1]。永丰辣酱制曲阶段的主要原料为小麦,麦曲的制作是敞开式的自然接种制曲,微生物的种类、数量与环境等条件密切相关。霉菌往往是永丰辣酱制曲阶段的主要功能微生物[2],可产生蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等[3]代谢分解小麦中的蛋白质、淀粉、纤维素等[4],从而促进永丰辣酱独特风味的形成。

传统可培养方法被广泛用于分离鉴定食品中的微生物,但对丰度低、需要特定营养物质[5]和不可培养微生物的研究存在局限性[6]。随着分子生物学的发展,高通量测序技术在分析微生物组成方面表现出突出的优势[7]。高通量测序技术高效、准确,可以更全面分析样品中微生物群落的组成及相对丰度[8]。唐清兰等[9]利用高通量测序技术分析浓香型白酒制曲阶段真菌多样性的变化情况,发现伊萨酵母属、嗜热子囊菌属、曲霉属为制曲不同阶段的优势菌属。石聪等[10]通过高通量测序技术发现浏阳豆豉制曲阶段的优势真菌属为根霉属和曲霉属。

目前,还没有研究报道永丰辣酱麦曲中微生物群落的组成情况。因此本研究以不同厂家麦曲为研究对象,对其可培养微生物进行分离鉴定,并结合高通量测序技术全面分析麦曲中真菌群落结构。最后通过相关性分析,探究麦曲真菌群落对理化指标的影响,以期为筛选优良的发酵功能微生物奠定基础,并为进一步揭示永丰辣酱发酵机理及风味物质、品质形成原因提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品采集

样品取自湖南省双峰县,为6个不同厂家自制麦曲样品(分别编号为JDT、S721、T、FX、JY、ZF),麦曲样品均为在制曲房中自然制曲10 d的麦曲。样品分别装至透明PE袋中,置于含有冰袋的泡沫采样箱中低温运回实验室。部分样品直接用于传统分离培养及理化指标测定,部分样品加入适量无菌水混合均匀并使用孔径为0.22 μm的水系滤膜进行过滤,过滤后将滤膜装入已灭菌的50 mL离心管中,置于-20 ℃冰箱保藏待高通量测序分析。

1.1.2 主要试剂

孟加拉红琼脂,广东环凯微生物科技有限公司;甲醛、邻苯二甲酸氢钾、NaOH、无水乙醇、NaCl,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

雷磁PHS-3C型酸度计,上海仪电科学仪器股份有限公司;LDZX-50 KBS型立式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;SW-CJ-1FD型无菌操作台,苏州净化设备有限公司;MJ-25085-Ⅱ型霉菌培养箱,上海新苗医疗器械制造有限公司;Centrifuge 5424型常温离心机,Eppendorf;Microfuge R 22R Centrifuge冷冻离心机,上海鹏仪电子科技有限公司;WH-861型旋涡振荡仪,太仓华利达实验室设备公司;DK-8D型三温三控恒温水浴锅,上海博迅实业有限公司;A200型PCR仪,杭州朗基科学仪器有限公司;MiSeq测序仪,Illumina公司;Tanon EPS300型电泳仪、Tanon-2500型凝胶成像仪,上海天能公司。

1.3 实验方法

1.3.1 理化指标

水分含量根据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法进行测定;总酸根据GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》中的酸碱指示剂滴定法进行测定;氨基酸态氮根据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度计法进行测定。

1.3.2 可培养真菌分离及鉴定

1.3.2.1 分离培养

称取25.0 g样品加入至225 mL无菌生理盐水后混匀,稀释至合适梯度后取100 μL涂布至孟加拉红琼脂培养基平板上,在28 ℃培养3～5 d后挑取形态各异的单一菌落进行分离纯化。

1.3.2.2 菌种鉴定

菌落观察:将分离纯化得到的菌株点接于孟加拉红平板上观察其菌落特征,包括直径、形状、大小、表面特征、孢子颜色以及是否产生色素等。

菌丝形态观察:于洁净载波片上,滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液,用接种环挑取菌落边缘的少量菌丝孢子放入棉蓝染色液中,盖上玻片观察菌株细胞形态。

分子生物学鉴定:上游引物:5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′;下游引物:5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′。PCR扩增体系:PCR Mix缓冲溶液25 μL,两端引物浓度均为10 μmol/L,模版DNA 1 μL,再加入20 μL双蒸水(ddH2O)。PCR扩增条件:98 ℃预变性2 min;98 ℃变性10 s,57 ℃退火10 s,35个循环;72 ℃延伸30 s,72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,送杭州联川生物有限公司测序部测序,将所得序列在NCBI上进行序列比对。

1.3.3 高通量测序

1.3.3.1 总DNA的提取

通过CTAB法对小麦样品进行微生物组总DNA的提取,并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量,同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。

1.3.3.2 PCR扩增

利用ITS rDNA ITS2区引物ITS3F～ITS4R进行扩增。PCR扩增体系总体积为25 μL,其中包含50 ng模板DNA,2×Master Mix 12.5 μL,上下游引物各2.5 μL,ddH2O补齐至25 μL。PCR扩增条件:98 ℃预变性30 s;98 ℃变性10 s,54 ℃退火30 s,32个循环,72 ℃延伸45 s,72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

取PCR产物10 μL用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,将检测合格样品送至杭州联川生物技术有限公司进行高通量测序。

1.3.3.3 数据处理

对下机数据首先根据样品的条形码(barcode)信息对数据进行拆分,再根据双端序列的重叠(overlap)关系,将序列拼接成长的序列(tags),并将序列上建库引入的barcode和引物序列去除。使用Vsearch(V2.3.4)软件过滤掉质量值低的序列以及嵌合体序列,再将具有97%以上相似性的序列分配给相同的可操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)[11]。每个OTU选择代表性序列,然后使用核糖体数据库项目(ribosomal database project, RDP)分类器将数据归类到每个代表性序列。利用MAFFT(V7.310)软件对不同类群优势种群的差异进行多序列比对,研究不同OTU间的系统发育关系。以Chao1、Shannon、Simpson和Observed OTUs为指标,用QIIME(1.8.0版)计算所有样品的各项指标并进行聚类,再通过α及β多样性分析单个样本中物种的多样性以及不同样本菌群结构间的差异,根据每个OTU代表序列与RDP数据库和Unite数据库的比对,得到各个样本所有OTU的物种注释,对OTU进行物种分类统计后获得门水平和属水平上的物种丰度表。

1.4 数据分析

理化指标数据均有3次重复,真菌群落数据分析均有4个生物学重复,以平均值±标准差表示。使用Excel绘制麦曲样品中真菌门水平及属水平柱状图。通过https://www.omicstudio.cn/tool进行冗余分析(redundancy analysis,RDA)。

2 结果与分析

2.1 不同厂家麦曲理化指标测定结果

由表1可知,不同厂家麦曲中水分含量差异较大,S721水分含量最高(49.2%),T、FX、ZF为晒后麦曲,水分含量都降低至5%左右。麦曲中总酸含量为7.13～14.9 g/kg,可能是发酵过程中微生物代谢产生有机酸造成的,也可能是脂肪、淀粉和蛋白质降解生成酸类物质[12]。制曲阶段的微生物主要是形成酶系,并代谢产生碳源、氮源等为后发酵时细菌生长代谢提供适宜条件,因此不同厂家麦曲发酵程度不是很高,氨基酸态氮含量为0.16～0.29 g/100 g。

2.2 麦曲中可培养真菌的分离鉴定

通过可培养方法从样品中共分离得到14株真菌,由形态分析及核酸序列分析可知其一共分为4个属共12个种,分别为根霉属、曲霉属、脉孢菌属、横梗霉属。在FX样品中分离出少根根酶(Rhizopus arrhizus)、总状横梗霉(Lichtheimia ramosa)、脉孢菌属(Neurospora sp.)和黄曲霉(Aspergillus flavus)4株真菌。JDT样品中分离出根霉(Rhizopus sp.)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。ZF中分离出少根根酶(Rhizopus arrhizus)和黄曲霉(Aspergillus flavus)。S721中分离出根霉(Rhizopussp.)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。JY中分离出少根根酶(Rhizopus arrhizus)和2株黄曲霉(Aspergillus flavus)。T中分离出少根根酶(Rhizopus arrhizus)。所有麦曲样品中均分离出根霉属菌株,因此,根霉可能是永丰辣酱制曲阶段的主要优势微生物。基因测序及BLAST比对结果如表2所示,分离菌株的菌落及显微形态如图1所示。

2.3 麦曲高通量测序结果分析

2.3.1 测序数据统计

由表3可知,将原始数据进行拼接、质控和过滤之后,所有样品最终均得到80 000个以上有效序列,且Q20值均>99%,Q30值均>95%,表明测序结果达到了真菌多样性分析测试的要求。

2.3.2 α多样性分析

α多样性通常用来表示样品中物种组成的多样性和丰富度。如表4所示,所有样品的Goods coverage均达0.99以上,说明本次检测基本可以真实反映样品中微生物群落组成的情况。样品FX中的ObservedOTUs、Chaol、Shannon和Simpson值最高,表明该麦曲样品中物种组成的丰富度及多样性最高。可能是原料本身的微生物及制曲环境中的微生物污染所致。

2.3.3 真菌群落组成分析

由图2-a可知,接合菌门(Zygomycota)和子囊菌门(Ascomycota)为不同厂家麦曲样品中的优势菌门。JDT(97.20%)、T(80.04%)、FX(69.88%)、ZF(93.08%)样品中的优势菌门为接合菌门(Zygomycota),而S721(97.02%)和JY(92.00%)样品中的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)。这2种菌门同样为大曲发酵中常见的优势菌门[13-14]。

根霉属(Rhizopus)、石座菌属(Petromyces)、脉孢菌属(Neurospora)为不同厂家麦曲样品中的优势菌属(图2-b)。不同厂家麦曲中真菌群落结构差异较大,可能是自然制曲环境不同导致。其中根霉属(Rhizopus)在所有样品中均存在(2.27%～97.19%),与可培养结果一致,在6个样品中均分离出了根霉(Rhizopus sp.)或少根根霉(Rhizopus arrhizus)。根霉属(Rhizopus)为样品JDT(97.19%)、T(80.04%)、FX(69.74%)、ZF(93.07%)中的最优势菌属,因此分离出的JDT-1(Rhizopus sp.)、T-1(Rhizopus arrhizus)、FX-1(Rhizopus arrhizus)、ZF-1(Rhizopus arrhizus)可能为各样品中的优势菌株。

小麦中淀粉含量高,少根根霉(Rhizopus arrhizus)通常可以产生多种淀粉酶和脂肪酶,在制曲过程中使淀粉转化为糖类物质,为微生物生长提供碳源等营养物质,还可以水解脂肪酸链产生醛、酯等多种风味物质,促进食品风味的形成[15]。石座菌属(Petromyces)是JY中的优势菌属(90.95%),其次在FX中相对丰度较高(21.63%)。石座菌属(Petromyces)为曲霉目(Eurotiales)真菌,属于有性型曲霉[16],黄曲霉复合物中的2种有性繁殖物种为Petromyces alliaceus和Petromyces albertensis,为石座菌属(Petromyces)微生物[17]。在所有样品中共分离出4株黄曲霉,分别为FX-4(Aspergillus flavus)、ZF-2(Aspergillus flavus)、JY-2(Aspergillus flavus)、JY-5(Aspergillus flavus)。因此JY-2(Aspergillus flavus)和JY-5(Aspergillus flavus)可能为JY样品中的优势菌株。脉孢菌属(Neurospora)在S721中相对丰度最高(96.86%),其次为FX(1.72%)。可培养方法在FX和S721中分别分离出脉孢菌(FX-3, Neurospora sp.)和粗糙脉孢菌(S721-2, Neurospora crassa),2种方法结果相似。S721-2(Neurospora crassa)可能为S721样品中的优势菌株。粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)是高产纤维素酶真菌[18-19],广泛应用于发酵工业中[20-21]。

2.4 麦曲中真菌群落与理化指标相关性分析

不同厂家麦曲中优势真菌群落(相对丰度>1%)与其理化性质的相关性分析如图3所示。水分含量A与脉孢菌属(Neurospora)具有较强的正相关性。而总酸B与根霉属(Rhizopus)、Meyerozyma和威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)正相关。根霉属(Rhizopus)真菌通常含有淀粉酶等酶系,从而可以代谢产生酸类物质[22]。魏满红等[23]研究发现,酵母菌具有一定的产蛋白酶活性,与本研究氨基酸态氮C与Meyerozyma和威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)正相关的结论一致。

3 结论

本研究采用可培养方法结合高通量测序技术对不同厂家永丰辣酱麦曲中的微生物进行分析。由分离鉴定结果可知,麦曲样品中共分离得到4个属的真菌,分别为根霉属(Rhizopus sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、脉孢菌属(Neurospora sp.)、横梗霉属(Lichtheimia sp.)。高通量测序结果显示根霉属(Rhizopus)、石座菌属(Petromyces)、脉孢菌属(Neurospora)为不同厂家麦曲样品中的优势菌属,与可培养结果较一致。传统可培养方法虽然对微生物的全面分析具有一定的限制,但本研究通过传统分离方法分离得到了不同厂家麦曲样品中的优势真菌。通过RDA相关性分析可知,根霉属(Rhizopus)、Meyerozyma和威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)与总酸含量呈正相关,Meyerozyma和威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)与氨基酸态氮含量正相关。在后续的研究中,可以通过纯种发酵探究不同优势菌株制曲对永丰辣酱风味及品质形成的影响,从而筛选出具有优良发酵功能的菌株、揭示永丰辣酱风味物质形成原因并提高永丰辣酱产品的安全性及品质。

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Fungal community structure and physicochemical properties in wheat koji of Yongfeng chili paste from different manufacturers

YIN Hanliang1, LIU Yang1,2*, JIANG Liwen1,2, OU Lijun3, XIE Songlai4

1(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China) 2(Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)3(College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)4(Shuangfeng Fengxin Agricultural Development Co.Ltd., Loudi 417000, China)

ABSTRACT In this study, traditional culture method and high-throughput sequencing were used to explore the fungal diversity in wheat koji from different manufacturers of Yongfeng chili paste, and the correlation between fungal community and physicochemical indicators was studied by RDA redundancy analysis. The results showed that Rhizopus, Petromycesand Neurosporawere the dominant genera in wheat koji samples from different manufacturers. The strains of Rhizopus sp., Aspergillus sp., Neurosporasp. andLichtheimia sp. were isolatedby traditional separation methods, which were similar to the results of high-throughput sequencing, indicating that the isolates might be the main functional strains in the wheat koji samples. Correlation analysis showed that Rhizopus was positively correlated with total acid content, and Meyerozymaand Wickerhamomyces were positively correlated with total acid and amino acid nitrogen content. This study lays a foundation for exploring the dominant functional fungi in wheat koji, revealing the reasons for the formation of flavor substances and improving the quality of Yongfeng chili paste products.

Key words wheat koji; traditional isolation and culture; high-throughput sequencing; physicochemical properties; correlation analysis

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032501

引用格式：尹含靓,刘洋,蒋立文,等.不同厂家永丰辣酱麦曲中真菌群落结构及其理化性质[J].食品与发酵工业,2023,49(7):112-117.YIN Hanliang, LIU Yang, JIANG Liwen, et al.Fungal community structure and physicochemical properties in wheat koji of Yongfeng chili paste from different manufacturers[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(7):112-117.

第一作者：硕士研究生(刘洋讲师为通信作者,E-mail:Fs.ly@hunau.edu.cn)

基金项目：湖南农业大学1515人才团队项目

收稿日期：2022-05-30,改回日期:2022-06-22