基于全二维气相色谱-飞行时间质谱及感官分析不同等级汾酒香气特征

香气是白酒品质的重要影响因素,决定了一款白酒的质量及消费者的接受程度[1]。目前,白酒香气品质的表征方法主要分为物质分析和感官分析。在白酒香气物质检测分析方法中,全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry, GC×GC-TOFMS)近年来发展迅速,相比于普通的一维气相色谱质谱技术,它具有高峰容量、高分离度、高分辨率、高灵敏度等优点,能够对复杂成分进行定性定量分析[2-3]。目前GC×GC-TOFMS已广泛用于酒类香气分析中,如程伟等[4]采用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)结合GC×GC-TOF-MS分析了不同质量等级馥合香白酒中的挥发性组分,共鉴定出341种挥发性化合物。高梦昕等[5]采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS在明绿液酒中共鉴定出810种挥发性组分,包括386种潜在香气活性组分,丰富了白酒挥发性风味物质数据库。陈双等[6]采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS从芝麻香型白酒中共鉴定出了340种挥发性化合物,其中首次鉴定出了11种挥发性含硫化合物和12种萜烯类化合物。

在感官分析中,定量描述分析法(quantitative descriptive analysis, QDA)是一种综合的,能够全面描述产品感官特性的描述性分析方法。QDA实用性很强,它能够同时进行多个样品的评估,既有描述产品感官特性的功能,又具有区分不同产品间的感官差异,对同一属性进行样品间排序的功能,因此被广泛应用于酒类的感官分析[7-9]。陆佳玲等[10]采用QDA表征了清香型白酒在降度过程香气属性强度的变化规律,发现在降度过程中,果香、酸香、醇香属性强度显著降低,而糠味、霉味、粮香显著增加,清香和甜香变化不显著。HE等[11]通过QDA比较了四川和江淮地区浓香型白酒的感官特性差异,发现四川酒样大多呈现粮香、窖香、青草香、酸香、烘烤等属性,而江淮地区大多呈现甜香、果香、花香、醇香等属性。

清香是我国著名的白酒香型,汾酒作为清香型白酒的典型代表,由于其香气馥郁芬芳、优雅细腻,深受消费者喜爱[12-13]。目前对于清香型白酒中香气的研究已经逐渐展开,如丁云连[13]通过对汾酒中的香气物质进行定性定量分析,初步确定了辛酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙醛、4-乙基愈创木酚、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇、1-辛醇、苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯和β-苯乙醇这10种香气物质为汾酒的特征香气物质。GAO等[14]通过香气重组和遗漏实验,成功模拟了以果香和花香为主的汾酒典型香气,证明了乙酸乙酯和β-大马士酮是汾酒香气的主要贡献者。NIU等[15]通过偏最小二乘回归(partial least squares regression, PLSR)分析,证明了清香型白酒关键香气化合物、感官属性和样品之间的相关性,并首次发现了二甲基三硫和3-巯基乙酸己酯是清香型白酒中的关键硫化合物。虽然目前对于清香型白酒香气解析的研究已有较多开展,然而不同质量等级清香型白酒间的物质差异、感官差异以及物质与感官间的联系仍不清晰,对于其品质间差异的研究还尚不多见。

针对上述问题,本研究以汾酒的4款不同质量等级的成品酒为研究对象,通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS仪器分析结合QDA感官分析,从物质和感官两个角度探究了不同等级汾酒香气品质的特征及差异,利用PLSR分析感官和物质间的联系。研究不仅可以丰富清香型白酒风味化学的理论体系,同时也为生产上清香型白酒的质量分级及生产工艺的改进提供了物质基础及感官导向依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验以山西杏花村汾酒的4款不同等级的成品酒样品为研究对象。4款酒分别为黄盖玻汾(汾00),老白汾10(汾10),青花20(汾20)和青花30(汾30),成品酒酒精度均为53%vol。

NaCl(分析纯),上海国药集团;C7～C30直链正构烷烃(色谱纯)、半定量内标(1-己烷-D13-醇;愈创木酚-D3;乙酸苯乙酯-D3;苯乙醇-D5;叔戊酸,纯度均≥98.0%,色谱纯)、乙醇(99.9%,色谱级),Sigma-Aldrich公司;超纯水,Milli-Q纯水仪制备。

1.1.3 仪器和设备

固相微萃取三相头(2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美国Supelco公司;Agilent 7890 N-Pegasus 4D全二维气相色谱-飞行时间质谱,美国Agilent、Leco公司;MPS多功能自动进样系统,德国Geststel公司;DB-FFAP毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Agilent公司;Rx-17 Si毛细管柱(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美国Restek公司;Milli-Q纯水仪,美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析

1.2.1.1 HS-SPME方法

用煮沸的超纯水将白酒样品稀释至酒精度为10%vol[16],然后取5 mL加入到20 mL顶空样品瓶中,加入1.5 g NaCl、50 μL同位素混标(内标1:23.252 mg/L 1-己烷-D13-醇;内标2:20.88 mg/L愈创木酚-D3;内标3:20.40 mg/L乙酸苯乙酯-D3;内标4:20.79 mg/L苯乙醇-D5)以及2 μL内标5(3 160 mg/L叔戊酸)。萃取温度40 ℃,平衡5 min,以250 r/min搅拌萃取40 min,萃取结束后于250 ℃下解吸附5 min,不分流进样,每个样品重复3次。

1.2.1.2 GC×GC-TOFMS方法

参考实验室前期所建立的方法进行[17]。

GC×GC条件:气相色谱为安捷伦7890B,第一维色谱柱为DB-FFAP毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),第二维色谱柱为Rx-17 Si毛细管柱(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm)。一维色谱柱和二维色谱柱之间通过四喷口双级热调制器串联,传输温度240 ℃。一维色谱柱起始温度45 ℃,保持3 min,然后以4 ℃/min升温至150 ℃,保持2 min;接着以6 ℃/min升温至200 ℃;最后以10 ℃/min升温至230 ℃,保持10 min。分析总时长53 min,二维柱温箱的温度全程比一维柱温箱的温度高出5 ℃。调制器补偿温度20 ℃,调制器的调制周期4 s,其中热脉冲时间0.8 s。样品采用恒流模式,以He(>99.999%)作为载气,流速1 mL/min。

TOF/MS条件:离子源电压70 eV,温度230 ℃,传输线温度240 ℃,检测器电压1 430 V,采集质量数范围35～400 amu,采集频率100 spestra/s。

1.2.1.3 GC×GC-TOFMS数据处理方法

定性:利用仪器自带的ChromaTOF®4.61.1.0 software(LECO Corporation)软件对采集的数据进行解析,自动识别信噪比大于200的色谱峰,然后进行自动解卷积,并和质谱库(Wiley 9和NIST 2014)比对,筛选相似度大于700的组分,过滤掉柱流失产生的化合物(含Si、金属元素的化合物),以及卤素化合物、烷烃、烯烃等无香气贡献的化合物[18]。通过在相同的色谱条件下进样正构烷烃(C7～C30)来计算相应物质的保留指数(retention index, RI),与文献中报道的进行比对,筛选RI相差50以内的化合物,最后采用部分标准品进行验证。

定量:不同种类的化合物选用性质相近的内标化合物进行相对浓度的计算,计算公式如公式(1)所示:

式中:Ci, 化合物相对浓度;C内标,内标浓度;A内标,内标峰面积;Ai,化合物峰面积;n,稀释倍数。

1.2.2 定量描述分析

1.2.2.1 品评员的筛选与培训

参照国际标准ISO 8586—2012对品评员进行筛选和培训。在江南大学的学生中,采用自愿报名的方式进行品评员的招募,通过填写调查问卷以及香气和味觉测试的形式,筛选出25名身体健康,无吸烟史、无酒精或其他香气过敏史,具有白酒品评经历,无嗅觉及味觉缺陷的品评员。对选出的25名品评员进行为期1个月培训,每周3～5次,每次1～2 h,培训内容包括白酒的基本感官感知培训,通过香气识别检验,差别检验,标尺使用检验,复筛出16人(10名男性,6名女性,年龄19～24岁)组成感官品评小组,定期使用Panelcheck对品评员的重复性、区分度以及一致性进行检测,以此来检验培训的效果[19]。

1.2.2.2 描述词的确定

采用随机方式将样品呈递给品评员,并要求小组成员写出8～10个所能感知到的香气属性,收集所得的描述词,通过集体讨论后,去除含义模糊不清以及词义相似或相近的描述词,最终选出了11个感知频率高、能够准确描述4款不同等级清香型汾酒的特征性及差异性的描述词。

1.2.2.3 参考样的配制

根据品评员集中讨论的结果,最终选定了糟香、清香、粮香、醇香、花香、果香、青草香、酸香、甜香、曲香、陈香11种香气属性。根据文献[20]及实际情况选取合适的香气参照物来对品评员进行强度的培训,香气属性的具体含义及参照如表1所示。

此后,小组成员经过6次,使用0～7分的打分标准对白酒样本进行评分。最终从16名品评员中挑选了结果重复性、一致性、区分度较好的10名品评员(6男,4女,19～23岁)参与正式的QDA实验。

1.2.2.4 正式实验

白酒样品(15 mL)装在GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》所规定的标准品酒杯中,并用随机的3位数字进行编码。使用0～7分的打分标准对不同等级汾酒的香气属性强度进行评分。

1.3 数据处理

使用SPSS 25进行单因素方差分析及数据归一化处理,利用Heml 1.0.3.7制作热图,Origin 2022用于绘制香气化合物相对浓度对比柱状图及感官雷达图,SIMCA 14.1用于计算香气化合物变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值。感官数据的有效性使用R Studio进行检验。主成分分析和PLSR使用XLSTAT 2016分析处理。

2 结果与分析

2.1 GC×GC-TOFMS解析不同等级汾酒中的挥发性成分

通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析,从不同等级汾酒中共检测出400种挥发性化合物(表2,电子增强出版附表1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033206),其中,汾10中检测出的挥发性物质最少,为272种,汾30中检测出的物质最多,为309种。不同等级汾酒挥发性物质的数量具有差异,高等级的汾20和汾30的物质数量比低等级的汾00和汾10多。所有的物质种类中,酯类物质是数量最多的一类化合物,其次是醇类、醛类、酮类和萜烯类,与先前对于清香型白酒的研究结果相一致[21-22]。此外,高等级汾酒中酯类物质种类较多。

2.2 不同等级汾酒香气组分分析

通过Flavornet Home(http://www.flavornet.org)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)2个香气数据库对于已经定性的化合物进行筛选[23],最终锁定了192种具有香气特征的挥发性化合物。对筛选出的香气化合物进行相对浓度的计算(图1),在所有的物质种类中,酯类物质的相对浓度最高,其次是醇类、酸类和醛类。此外,样品等级越高,酸类化合物、内酯类化合物以及芳香族化合物的相对含量越高。

进一步采用单因素方差分析,筛选出了84种在不同样品间具有显著差异(P≤0.05)的香气化合物,对数据进行归一化处理后制作热图(图2)。从热图分析的结果可以看出,不同等级汾酒香气组分具有显著差异。从聚类结果来看,低等级的汾00和汾10聚为了一类,而高等级的汾20和汾30聚为了一类。不同等级汾酒在物质组成上具有一定的特征性。汾30中相对含量较高的化合物大多为一些酯类(乙酸苯甲酯、2-甲基丁酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、肉桂酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯、异戊酸乙酯、丙酸乙酯、十一酸乙酯、己酸己酯、癸酸甲酯、水杨酸甲酯)、酸类(2-甲基丁酸、癸酸、壬酸、辛酸)、萜烯类(土味素、大根香叶烯D、1-石竹烯、月桂烯、(-)-a-卡地醇、α-石竹烯、β-法尼烯、Δ-杜松烯),而汾00中相对含量较高的化合物大多为醛类(2-己烯醛、4-乙基苯甲醛、癸醛、庚醛、异丁醛、辛醛)。

2.3 定量描述性分析

2.3.1 感官数据有效性检验

利用R语言对品评小组的感官结果进行方差分析,以评估感官数据的可靠性和有效性[24]。其结果如图3所示,图中灰色的数据表示具有显著性(P<0.05)。样品在不同属性上均具有显著差异,说明样品间的差异可以被品评员很好的感知到。品评员、样品×品评员中除了粮香和清香具有显著性外,其他均不具有显著性,说明品评员在评估时所使用的标尺较为一致,且不同品评员间的感知也具有较好的一致性。重复、样品×重复和品评员×重复之间没有显著性,说明感官数据的重复性很好。综上所述,定量描述分析的感官数据可靠,具有有效性。

2.3.2 不同等级汾酒感官特征及差异

雷达图结果显示(图4-a),4款不同等级汾酒在所有感官属性上均具有显著差异,汾20和汾30的香气轮廓更为相似。进一步通过主成分分析(图4-b)可以发现,高等级和低等级的汾酒差异明显,分别位于坐标轴的两侧,汾00和汾10主要表现为糟香、酸香、粮香和曲香等香气特征,而高等级的汾20和汾30则主要呈现出愉悦的花果香、甜香、青草香和陈香等香气特征。

2.4 化合物与感官属性间的联系

对84种具有显著差异的香气化合物进行偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),筛选其中31种贡献程度大(VIP值>1)的物质,将这些物质的相对浓度与感官数据进行PLSR分析,将物质与感官相关联。通过化学计量法可以揭示不同等级汾酒之间物质与感官的差异,图5可以看出,汾00主要表现为糟香,和苯酚、4-乙基愈创木酚、4-乙基苯甲醛、2-丁醇、癸醛、二甲基二硫等物质呈正相关;汾10主要表现为醇香,和甲酸乙酯、乙酸己酯、丙二酸二乙酯、己醛、乙酸异丁酯、丁醛、正己醇、苯乙醛呈正相关;高等级汾酒汾20和汾30更多表现为青草香、陈香、果香、甜香、花香、清香,与反式-2,4-癸二烯醛、月桂烯、1-石竹烯,丙酸乙酯、苯乙酮、苯甲酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯等物质呈正相关。

3 结论

采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析了4款不同等级汾酒中的挥发性物质,共检测出400种挥发性化合物,其中汾30中物质最多,汾10最少,高等级汾酒中酯类物质种类较多。热图结果表明,不同等级汾酒中香气化合物的相对含量具有显著差异。QDA结果显示了4款不同等级汾酒在感官属性上的差异,汾00和汾10主要表现为糟香、酸香、粮香和曲香等香气特征,而高等级的汾20和汾30则主要呈现出愉悦的花果香、甜香、青草香和陈香等香气特征。最后通过PLSR将物质与感官相关联,筛选出与不同等级汾酒特定感官特征相关的潜在化合物。本研究从物质和感官两个角度表征了不同等级汾酒的香气品质差异,不仅丰富了清香型白酒风味品质表征的研究,同时也为生产上的分级提供了数据支撑及理论依据。

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