随着社会的发展,过量摄入高热量糖,如葡萄糖、果糖和蔗糖等,会导致肥胖、糖尿病、心脑血管疾病和高血压等慢性疾病的发生,已引起世界范围内的广泛关注。为此,低热量、高甜度的甜味剂受到不同消费者的青睐[1],其中人工甜味剂如糖精、安赛蜜、三氯蔗糖和阿斯巴甜等已被广泛应用于食品领域[2]。然而许多的研究表明,人工甜味剂的大量使用存在潜在的健康风险[2-4],因此,植物来源的天然甜味剂越来越受到广泛的应用。其中,来源于植物甜叶菊的甜菊糖苷已成为了天然甜味剂中最受欢迎的甜味剂[5]。甜叶菊(Stevia rebaudianaBertoni)是一种南美灌木,属于菊科泽兰属,原产于巴拉圭和巴西边境的高山草甸,也被称为“巴拉圭草”[6],在当地甜叶菊叶子作为天然甜味剂的使用历史已有几百年。目前,已从甜叶菊中分离出60余种甜菊糖苷,包括甜菊糖、莱鲍迪苷A(rebaudioside A,Reb A)、莱鲍迪苷D(rebaudioside D,Reb D)、莱鲍迪苷M(rebaudioside M,Reb M)和甜菊双糖苷等。由于它们具有安全性高、甜度高和性质稳定等特点[6],通过了美国食品药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)级别的安全认证[7],获得了联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)和世界卫生组织(World Health Organization,WHO)等的许可[8]。纯度不低于95%的甜菊糖苷可以作为甜味剂使用[7-8],而其中Reb D和Reb M具有高甜度、无热量和近似于蔗糖口感的优点,更被认为是高热量糖的理想替代品,具有广阔的应用前景[9-10]。为此,本文将从Reb D和Reb M的结构、性质以及生物合成相关的糖基转移酶等方面的研究进展进行综述。
1 Reb D和Reb M的结构与性质
1.1 Reb D和Reb M的结构
甜菊糖苷是通过在核心骨架贝壳杉烯的萜烯苷元的C-13位和C-19位通过1,2-、1,3-、1,4-和1,6-α或者β糖苷键连接不同数目和不同类型的糖分子而形成的一类糖苷(图1)[6]。
图1 主要甜菊糖苷的化学结构
Fig.1 Structure of major steviol glycosides
目前,已从甜叶菊中分离出60余种甜菊糖苷,其结构的多样性也导致它们性质的差异性,如甜度、苦度和溶解度等。1977年首次报道了Reb D的化学结构(图1),分子式为C50H80O28,Reb D是在甜菊醇C-19位和C-13位上分别连接2和3个葡糖基而形成[11]。2014年首次报道了Reb M的化学结构(图1),分子式为C56H90O33,Reb M是在Reb D的结构基础上在C-19位通过β-1,3糖苷键连接1个葡糖基而形成[9]。Reb D和Reb M在甜叶菊中含量较低,质量分数约为0.4%～0.5%[12],因此利用传统的植物提取方法进行制备不仅成本高而且产量难以满足市场需求。
1.2 Reb D和Reb M的甜味和苦味
相较于甜菊糖和Reb A,Reb D和Reb M具有更高的甜度(约为蔗糖的250～350倍)和更少的回苦味,这些性质使其成为新一代的甜味剂[9]。在人类味觉系统中,甜菊糖苷甜味和苦味的感知由味蕾中味觉受体细胞G蛋白耦联受体蛋白所介导。其中,甜味的检测和传导是由受体蛋白hTAS1R2和hTAS1R3构成的杂合甜味受体所介导,该杂合甜味受体还可以检测出各种化学成分化合物的甜味,如单糖、二糖、甜蛋白质、甜菊糖苷以及人工合成的非营养甜味剂[13]。而甜菊糖苷苦味的检测和传导是由受体蛋白hTAS2R4和hTAS2R14专一地介导,hTAS2R家族中其他受体蛋白(约23个)则负责其他苦味物质的检测和感知,它们对苦味物质的检测范围表现出差异性但又有部分重叠[13]。
甜菊糖苷结构之间的差异导致了它们在甜味、苦味以及回味方面具有较大差异。在以时间-强度动态感官模型对6种甜菊糖苷甜味和苦味的研究中,发现与甜茶苷、甜菊糖、Reb A和莱鲍迪苷C相比,Reb D和Reb M具有更快的甜味和更短的回味,且几乎没有回苦味,而甜茶苷和甜菊糖则表现出非常明显的苦味和持久回味[14]。此外,研究还发现甜菊糖苷C-19位的葡糖基越少,甜味刺激时间越短,对苦味的感知时间越长;C-13位的葡糖基越多,其甜味则表现越强和越快。其原因为甜菊糖苷C-19位的取代基越多和越大,解吸附率越高,甜味衰减越快,而甜菊糖等糖基较少的化合物解吸附率较低,回味较苦[14]。
1.3 Reb D和Reb M的溶解性和稳定性
Reb D和Reb M的水溶性较差,在水中的溶解度分别仅为0.05%和0.1%,而在醇溶液中它们的溶解度较高[9],较差的水溶性限制了它们作为甜味剂的应用。目前已有多种策略用于提高Reb D和Reb M的溶解度,研究发现提高温度可以增加Reb D的溶解度,当温度提升至70～80 ℃时,Reb D的溶解度则增加至0.6%[15]。Reb D的晶型也会影响Reb D的溶解度,Reb D在50 ℃左右和70 ℃左右通过溶解分别转变为具有更好水溶性的多态形式α形和β形[16]。此外,研究发现固体分散技术可以通过增加Reb D和山梨酸钾的表面积/体积比以及氢键增加Reb D的溶解度[17]。研究表明,通过Reb M和其他甜菊糖苷混合形成不同的混合物可以提高Reb M的水溶性[18]。
除溶解性外,稳定性是影响甜味剂使用的重要因素。在热加工饮料中,如调味冰茶、果汁、运动饮料、调味奶、饮用酸奶和非酸化茶,Reb D在高温短时间热处理和后续产品储存中表现出良好的稳定性[16]。Reb M在作为饮料、口香糖和餐桌糖甜味剂使用时能够在规定储存期中保持合格的甜度和性状稳定性[9]。在酸奶中使用时,Reb M在巴氏消毒和发酵过程中甜度无明显损失,且在酸奶储存6周时能够保持性状稳定[9]。Reb D和Reb M良好的稳定性使它们适用于食品领域。
1.4 Reb D和Reb M的安全性
Reb D和Reb M作为甜味剂的代谢安全性也被研究证明。NIKIFOROV等[19]通过对Sprague-Dawley模型大鼠饲喂不同剂量的Reb D,证明Reb D对动物一般状况和行为无治疗相关的影响,对血液、血清或尿液分析证明Reb D无毒理学或者治疗相关的影响。在体外厌氧条件下使用身体健康的志愿者粪便匀浆测定对Reb A、莱鲍迪苷B、Reb D、Reb M和甜菊糖的水解作用,结果显示每种甜菊糖苷在孵育8 h内大部分水解成甜菊醇,在24 h内完成全部代谢,高浓度甜菊糖苷的水解时间比低浓度的稍长,但甜菊糖苷浓度对代谢量无明显影响,各种甜菊糖苷的代谢速率和程度无明显差异[20]。
2 Reb D和Reb M的生物合成
Reb D和Reb M的合成方法主要包括化学法和生物酶法。其中,QIAO等[21]以甜叶菊叶子粗提物为原料,通过俞氏糖基化反应、施密特(Schmidt)糖基化反应和相转移催化糖基化反应协同作用,实现了位阻型和酸敏感型甜菊醇的高效糖基化,合成了Reb A、Reb D以及Reb M。然而化学法步骤繁琐、条件复杂,且在合成过程中立体选择性控制难度较大。目前,Reb D和Reb M的合成方法主要集中在生物酶法催化合成,因此本文将主要综述Reb D和Reb M生物酶法合成相关糖基转移酶的研究进展。
2.1 Reb D的生物合成
2.1.1 Reb D合成相关糖基转移酶的挖掘和改造
随着对甜菊糖苷生物合成路径研究的深入,Reb D的生物合成路径也被解析,其合成路径主要分为两种:一种是以Reb A为底物合成Reb D,另外一种则是以莱鲍迪苷E为底物合成Reb D(图2)。2016年王勇课题组基于甜叶菊基因组和转录组的分析,在甜叶菊中鉴定出能够催化Reb A合成Reb D的糖基转移酶UGT91D2[22]。然而,不同品种甜叶菊中Reb D的含量存在差异,ZHANG等[23]分析了10种不同基因型且甜菊糖苷含量存在差异的甜叶菊中UGT91D2的基因序列,发现大部分(超过50%)的基因序列与已报道的具有催化形成β-1,2糖苷键的UGT91D2e_No.5保持一致,UGT91D2在各基因型中的表达水平和Reb D的含量呈正相关。此外,OLSSON等[24]报道了糖基转移酶UGT76G1能够催化Reb E合成Reb D,并通过定点突变提高了UGT76G1催化Reb E合成Reb D的活性。
除了已鉴定的UGT91D2外,其他具有催化Reb A合成Reb D活性的糖基转移酶相继被挖掘和鉴定。在番茄中分离鉴定出具有催化Reb A合成Reb D活性的糖基转移酶UGTSL2,而该酶在催化过程中有副产物Reb D2和Reb M2生成[25]。CHEN等[12]利用在大肠杆菌表达系统中共表达UGTSL2和马铃薯来源的蔗糖合酶StSuS1实现了以74.6%的产率合成17.4 g/L Reb D,并采用定点饱和突变策略在UGTSL2中引入突变N358F,通过与UGT76G1构建级联反应实现了以20 g/L甜菊糖合成14.4 g/L Reb D。
此外,在水稻中也鉴定出具有催化Reb A合成Reb D活性的糖基转移酶EGUT11,并在酿酒酵母中进行了异源重组表达[26]。WANG等[27]通过毕赤酵母X-33分泌表达了EUGT11,采用温度控制两步法(28/35 ℃)实现了在发酵液中高效合成Reb D,转化率达到95.31%。杨玉凤等[28]利用大肠杆菌成功重组表达了EUGT11,并利用重组大肠杆菌全细胞催化Reb A合成Reb D,产量为0.123 6 g/L。费理文等[29]通过改造大肠杆菌中的尿苷二磷酸葡萄糖(Uridine diphosphate glucose,UDPG)代谢途径以增强UDPG的循环,并在宿主菌SG4中过表达EUGT11进行全细胞催化Reb A合成Reb D,在最优条件下催化1 mmol/L Reb A合成了1.11 g/L Reb D,转化率达到98.5%。为了解析EUGT11的催化机制及提高其催化活性,LIN等[30]在无蛋白结构的前提下利用蛋白质结构的计算策略开发了预测、序列优化和分子动力学模拟的技术手段对EUGT11进行突变改造,获得催化活性是野生型EUGT11的2.18倍的突变体F379A。
图2 催化合成Reb D的糖基转移酶
Fig.2 Glycosyltransferases involved in the biosynthesis of Reb D
2.1.2 OsUGT91C1的蛋白质结构
为了进一步解析糖基转移酶催化Reb A合成Reb D的催化机制,ZHANG等[31]解析了糖基转移酶OsUGT91C1(原名为:EUGT11)的蛋白质复合物结构(PDB ID:7ERY、7ES0、7ES1、7ERX、7ES2)。OsUGT91C1具有典型的GT-B折叠家族糖基转移酶结构特征,其中包括Rossman结构域(β/α/β)组成的N端结构域和C端结构域,催化活性位点为H27和D128(图3-a)。C端结构域中包含尿苷二磷酸(Uridine diphosphate,UDP)的结合区域,其结构高度保守,并通过蛋白质复合物结构分析了与UDP结合的氨基酸残基(图3-b)。而N端结构域主要用于底物的结合和识别,结构较为灵活。通过结构分析揭示了在OsUGT91C1中存在疏水氨基酸残基(V129、F130、L149、M155、I159、R162、A205、F208)形成的疏水底物口袋(图3-c),通过疏水相互作用与甜菊糖苷的二萜骨架结构识别,使OsUGT91C1能够分别催化甜菊糖苷C-13位或C-19位葡糖基发生糖基化反应。在OsUGT91C1催化过程中,活性位点H27攻击甜菊糖苷C-13位或C-19位葡糖基羟基夺取质子,使其成为亲核试剂进而攻击糖基供体UDPG的葡糖基C-1位,从而发生糖基化反应形成β-1,2糖苷键(图3-d)。基于OsUGT91C1的蛋白质复合物结构,选取与甜菊糖苷有相互作用的氨基酸残基并改造获得突变体F208M/F379A,其催化合成Reb D的活性是野生型的4.2倍,并降低了OsUGT91C1催化形成β-1,6糖苷键的活性。
a-OsUGT91C1蛋白质结构;b-UDP结合的氨基酸残基;c-疏水氨基酸形成的疏水口袋;d-OsUGT91C1的催化机制
图3 糖基转移酶OsUGT91C1的蛋白质结构和催化机制
Fig.3 Protein structure and catalytic mechanism of glycosyltransferase OsUGT91C1
2.2 Reb M的生物合成
2.2.1 Reb M合成相关的糖基转移酶的挖掘及改造
2016年OLSSON等[24]报道了甜叶菊中糖基转移酶UGT76G1具有催化Reb D合成Reb M的活性(图4)。此外,UGT76G1还具有催化甜菊糖合成Reb A的活性以及催化其他甜菊糖苷形成β-1,3糖苷键的活性[24, 32]。为了提高UGT76G1催化Reb E合成Reb D和Reb M的催化活性,OLSSON等[24]通过同源建模识别存在与底物结合口袋中的关键氨基酸,通过对所选取的氨基酸残基定点饱和突变,筛选出包含1 748个UGT76G1突变体的突变体文库,其中突变体T146G和H155L可以增加Reb D和Reb M的产量。为了高效制备Reb M,WANG等[33]利用固定化技术将上述报道的EUGT11与UGT76G1固定化在壳聚糖材料上,以72.2%的产率催化Reb A制备出4.8 g/LReb M,并且经过4次和8次重复使用后,共固定化的酶仍保持了75.5%和53.1%的原酶活性。
2.2.2 UGT76G1的蛋白质结构
为了解析UGT76G1能够催化多个甜菊糖苷形成β-1,3糖苷键而形成多种甜菊糖苷的催化机制以及底物识别的机制,YANG等[32]解析多种UGT76G1与不同底物的复合物蛋白质结构(PDB ID:6INF、6ING、6INH、6INI),UGT76G1具有典型的GT-B折叠糖基转
图4 UGT76G1催化合成Reb M
Fig.4 Synthesis of Reb M catalyzed by UGT76G1
移酶的特征,其N端和C端结构域是由Rossman结构域(β/α/β)构成,催化活性位点为H25和D124(图5-a)。C端结构域较为保守,其中包含UDP结合区域,并通过蛋白质复合物结构分析了与UDP结合的氨基酸残基(图5-b)。而N端结构域主要用于底物的识别和结合而结构较为灵活。在UGT76G1中存在氨基酸残基(L85、M88、I90、I199、L200、I203)形成的疏水口袋,其利用疏水相互作用进行底物识别,但在底物识别过程中缺乏严格的底物识别以及氢键作用(图5-c)。因此,在催化过程中UGT76G1利用催化活性位点H25和D124在甜菊糖苷C-13位或C-19位葡糖基催化形成β-1,3糖苷键,这也是UGT76G1能够催化多种甜菊糖苷进行糖基化的分子基础(图5-d)。
a-UGT76G1蛋白质结构;b-UDP结合的氨基酸残基;c-疏水氨基酸形成的疏水口袋;d-UGT76G1的催化机制
图5 糖基转移酶UGT76G1的蛋白质结构和催化机制
Fig.5 Protein structure and catalytic mechanism of glycosyltransferase UGT76G1
LEE等[34]通过解析UGT76G1的蛋白质复合物结构(PDB ID:6O86、6O87、6O88)并通过定点突变分析了活性位点以及底物结合位点,同时证明了疏水口袋在底物识别中的作用。LIU等[35]通过研究UGT76G1的蛋白质结构(PDB ID:6KVI、6KVJ、6KVK、6KVL)确定了较大的底物口袋用于识别甜菊糖苷和其他底物,其中,关键氨基酸残基G87和L204负责底物二萜和黄酮类糖基化之间的切换。通过基于蛋白质结构的改造获得突变体T284S,其催化合成Reb M的活性是野生型UGT76G1的1.5倍,同时减少了催化Reb A合成副产物Reb I的活性。
在解析UGT76G1的蛋白质结构后,基于蛋白质结构的理性改造策略被用于UGT76G1的改造。YU等[36]基于UGT76G1蛋白质结构通过单点饱和突变对其进行改造获得突变体S195Q,其对Reb E和Reb D的催化活性分别是野生型的1.2倍和2倍。利用突变体S195Q与微藻来源的蔗糖合酶McSuSy构建级联反应,利用裂解液以20 g/L Reb E为底物制备得到了10.5 g/L Reb D和12.8 g/L Reb M。本课题组基于UGT76G1的蛋白质结构,通过分子对接分析与Reb D可能有相互作用的氨基酸残基,并选取这些氨基酸残基位点以UGT76G1-T284S作为出发酶进行丙氨酸扫描、定点饱和突变和组合突变,得到催化活性是UGT76G1-T284S的2.38倍的突变体UGT76G1-T284S/M88L/L200A,利用突变酶UGT76G1-T284S/M88L/L200A与拟南芥来源的蔗糖合酶AtSuSy构建级联反应,并通过优化级联反应实现了以90.5%的产率制备出23.37 g/L Reb M[37]。UGT76G1的基因挖掘、功能鉴定、结构解析以及蛋白质改造,为规模化生产Reb M奠定了基础。
2.2.3 UGT76G1的重组表达
UGT76G1是目前已知唯一具有催化合成Reb M活性的糖基转移酶,然而UGT76G1在异源重组表达时表达水平相对较低,尤其是在原核表达系统中进行表达时多以包涵体形式存在,这也限制了酶法制备Reb M的应用。CHEN等[38]为了增强UGT76G1的可溶性表达水平,在大肠杆菌表达系统中测试了3种N端融合蛋白的作用效果,其中,3′-磷酸腺苷-5′-磷酸酶CysQ与UGT76G1融合表达后,UGT76G1的可溶性表达水平提高了40%。SHU等[39]筛选5种助溶蛋白与UGT76G1进行融合表达,发现Smt3使UGT76G1的可溶性表达提高了60%,通过在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达内源基因prpD和malK,使Smt3-UGT76G1的表达量提高了2倍,在发酵罐中实现了Smt3-UGT76G1高效表达,产量达到1.97 g/L。此外,毕赤酵母细胞表面展示技术用于UGT76G1的表达,通过锚定蛋白Gcw61p实现了UGT76G1在毕赤酵母GS115细胞表面的成功展示,并通过优化拷贝数提高了UGT76G1的表达量[40]。
3 总结与展望
Reb D和Reb M作为高热量糖的理想替代品,被许多国家和卫生组织批准在食品和医药领域广泛应用。目前,Reb D和Reb M合成相关的糖基转移酶的结构和功能已解析清晰,并通过基于蛋白质结构的定向进化改造提高了酶的催化活性和区域选择性,这也为Reb D和Reb M进一步的规模化生产以满足市场需求奠定了基础。然而,目前Reb D和Reb M合成相关的糖基转移酶依然存在催化活性低且异源重组表达时可溶性表达水平较低的问题,尚不能满足规模化生产的要求。因此,对Reb D和Reb M的生物转化还应在以下几个方面深入研究:(1)基于已解析的OsUGT91C1和UGT76G1的蛋白质结构,对它们进行更深入的突变改造研究进一步提高它们的催化活性。(2)筛选具有催化合成Reb D和Reb M活性且在异源重组表达时能够良好可溶性表达的糖基转移酶作为替代酶用于Reb D和Reb M的合成。(3)基于蛋白质结构,采用截短柔性区域、优化分子内相互作用力、刚化催化活性区域以及计算机辅助筛选柔性位点等策略对已有的糖基转移酶进行热稳定性改造,提高其热稳定性用于制备Reb D和Reb M。(4)探究级联反应体系利用甜叶菊中含量较高的甜菊糖和Reb A用于制备Reb D和Reb M,结合固定化相关策略提高级联反应体系中酶的稳定性和重复使用次数以降低生产成本。(5)由于Reb D和Reb M的水溶性较差,因此需探索方法增加它们溶解度和实现制备过程中产物的初级分离,实现Reb D和Reb M的高效制备。
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