微生物合成低分子质量及寡聚透明质酸研究进展

透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种天然线性糖胺聚糖,由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成[1](图1),具有良好的保湿性、黏附性、生物相容性和非免疫原性[2]。HA分为高分子质量(high molecular weight hydronic acid,HMW-HA≥100 kDa)、低分子质量(low molecular weight hyaluronic acid,LMW-HA,10～100 kDa)和寡聚透明质酸(o-HA,≤10 kDa,单糖残基数目为2～40个HA片段),其生物活性与分子质量高低密切相关[3]。与HMW-HA相比, LMW-HA和o-HA更容易被人体吸收,具有促进骨和血管生成、加速伤口愈合、增强免疫调节等生理功能[4, 5]。

LMW-HA和o-HA在医疗、化妆品和食品领域有着广泛应用。与HMW-HA相比,LMW-HA具有更强的渗透能力,可促进平滑肌细胞和原生细胞体内外迁移,帮助血管介质再生和生理功能重建[6]。人体皮肤细胞间隙仅为15～50 nm,HMW-HA无法渗透到真皮深层,而LMW-HA和o-HA凭借其良好渗透性,能够穿透皮肤起到修复肌底损伤、透皮保湿以及改善皱纹作用[7-8]。LMW-HA还能促进人间充质干细胞增殖及成骨分化,尤其o-HA可以增加细胞钙沉积量,显著提升细胞中钙含量,有效应用于牙周炎治疗[9]。在食品领域,HA作为食品添加剂大量应用于饮料、软糖、果冻等制作。此外,HA因其丰富的功能性质,目前海外市场各类保健食品和膳食补充剂中已广泛应用。例如,口服摄入LMW-HA补充剂可以抑制皱纹,起到维持皮肤健康作用[10]。作为关节滑液主要成分和贡献者,向膳食营养液中补充LMW-HA还能有效缓解老年人常见的关节疼痛症状[11]。2021年1月7日,我国卫生健康委员会发文批准HA可作为“新型食品原料”添加于普通食品中[12],意味着未来食品级LMW-HA和o-HA新型产品开发将具有广阔发展前景。

目前HA生产虽然已达到大规模工业化水平,但以往工作侧重点是通过改善HA生产菌株发酵性能、解决发酵过程中溶氧供应不足等突出问题,来实现产量和分子质量提高[13-14],传统工业生产仍然对LMW-HA和o-HA产品的生产和应用关注较少。随着两者逐渐显现出巨大的应用和商业价值,使其需求量急剧增加。当前LMW-HA和o-HA生产已从天然野生菌发酵过渡到利用基因工程菌株获取,最新研究聚焦于突破原始菌株产物分子质量大小难以控制等瓶颈,对其生产关键影响因素透明质酸合成酶(hasA)的差异和特性进行比较,同时针对前体表达量与HA分子质量大小相关性开展研究,以望实现LMW-HA和o-HA高效生产。然而,迄今为止HA聚合机制等生物合成关键步骤并未完全阐明,导致调控分子质量技术尚不成熟。基于此,本文总结了LMW-HA和o-HA生物合成途径及其在工业生产上的应用,并对HA分子质量调控策略进行探讨,以期为构建产LMW-HA和o-HA工程菌株提供新思路。

1 HA生物合成及其相关途径

1.1 HA生物合成途径

HA生物合成由“HAS操纵子”负责,其中最关键的3个基因hasA、hasB和hasC,分别编码hasA、UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。目前,研究较多的化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、马链球菌(Streptococcus equisimilis)和兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)中都含有负责HA前体合成以及聚合的重要基因。HA合成始于糖酵解途径中间体葡萄糖-6-磷酸(图2),其分别流向HA单糖前体UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcUA)和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)的合成。首先,α-磷酸葡萄糖酶(pmg)将葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖-1-磷酸,接着在hasC和hasB作用下,游离UTP磷酸基团转移到葡萄糖-1-磷酸上产生UDP-葡萄糖,并进一步氧化形成UDP-GlcUA。UDP-GlcNAc合成途径中,葡萄糖-6-磷酸通过磷酸葡萄糖异构酶(hasE)转化为果糖-6-磷酸,并在glmS基因编码的谷氨酰胺-酰氨基转移酶(glmS)催化果糖-6-磷酸生成氨基葡萄糖-6-磷酸,再由磷酸葡萄糖突变酶(glmM)修饰产生氨基葡萄糖-1-磷酸。该中间体在hasD基因编码的双功能酶(葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶/葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶)催化下依次进行乙酰化和磷酸化,形成UDP-GlcNAc。在hasA作用下,UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc聚合成线性长链,并转运到胞外形成HA。

1.2 HA竞争代谢途径

HA合成与细胞内糖酵解、磷酸戊糖途径等重要代谢途径由于共享部分前体,因此在生物合成过程中不可避免会存在碳源相互竞争[15]。当葡萄糖-6-磷酸运输到糖酵解、磷酸戊糖途径和HA合成途径分支点后,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf编码)将部分前体转化为6-磷酸葡萄糖内酯,分流进入磷酸戊糖通路。同时,6-磷酸果糖激酶(pfkA编码)将果糖-6-磷酸转化为果糖-1,6-二磷酸,进入糖酵解途径、乳酸代谢途径和三羧酸循环合成其他代谢产物(如乳酸、乙酸)。即使是葡萄糖-1-磷酸、UDP-葡萄糖和UDP-GlcNAc等直接负责HA合成的前体,也同时参与细胞壁合成和细胞生长。因此,推动更多碳通量集中流向HA合成途径,是实现高浓度HA生产关键所在。

2 LMW-HA合成

HA主要通过A族和C族链球菌发酵获得,然而大多数生产菌株除了自身对培养基营养条件要求苛刻外,其内部分子质量调控机制也十分复杂,在生产过程中难以通过传统发酵实现LMW-HA和o-HA可控生产。为了更有效地获取产物以满足市场需求,工业上常采取物理法、化学降解法及生物法调节HA分子质量。物理法主要利用热降解、超声波等处理方法[16-17],操作过程简单,所得产品分子质量分布范围窄,但其所需降解时间较长。使用化学法处理能减少降解时间和成本[18-19],但整个反应过程十分剧烈,易造成HA结构破坏,影响产品质量。相比而言,生物法通过调控发酵过程中影响分子质量大小的关键因素,可进一步实现HA可控尺寸生产,具有专一性强、无副作用等优点[20](图3)。

2.1 hasA调控HA分子质量

hasA具有催化单糖UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc聚合形成HA的能力,其自身性质很大程度上决定产物分子质量大小,是调节LMW-HA和o-HA生物合成的良好选择[21]。2003年,PUMMILL等[22]首次比较了不同来源hasA氨基酸序列,推断不同HA分子质量大小与蛋白一级结构差异有密切联系。为验证此推测,KUMARI等[23]和WEIGEL等[24]利用基因定点突变技术修饰多种来源hasA残基,证实该酶关键位点突变会导致HA分子质量降低。BAGGENSTOSS等[25]向兽疫链球菌sehasA中引入带负电荷的Glu398突变,得到HA产物分子质量大小仅为野生型的20%。此外,通过极性(Asn、Ser、Thr)、疏水性(Ile、Leu、Met、Val)或芳香性(Phe、Trp、Tyr)氨基酸残基替换,得到一系列分子质量仅为野生型8%～14%的LMW-HA,进一步证实hasA一级结构在分子质量调控中具有关键作用。

目前hasA调控分子质量具体机制暂未阐明,一种假设是将分子质量差异归因于酶亲和力不同[26]。基于此猜想,YANG等[27]通过自由能干扰模拟实验,计算出多个sehasA羧基末端残基突变体之间HA结合自由能差异。结果显示,当Arg413突变为Lys413时,酶与HA结合作用力显著减小,表明重要残基突变会导致HA-hasA亲和力受到影响,同时使产量和分子质量显著下降。该现象可以解释为Arg中胍基基团可以与HA羧基形成双齿氢键,而Lys中胺基基团只能形成单齿氢键,因此突变残基造成酶与HA链之间作用力减小;另外,与含有5个氢键供体的Arg相比,Lys仅含3个氢键供体,其潜在相互作用空间变小,导致C端与HA结合更为松散。相反,ZHANG等[28]在sehasA中引入多个带正电荷残基突变,结果观察到HA-hasA之间表现出更高的亲和力,同时产物分子质量增加。MANDAWE等[29]将多杀巴氏杆菌pmhasA两个极性残基Thr替换为疏水性残基Leu和Ala,在高盐浓度下疏水氨基酸与HA链疏水面产生相互作用使两者结合更加稳定,产生较高分子质量HA。上述研究表明,HA分子质量变化与酶亲和力改变密切相关,通过分子修饰改变酶与产物之间相互作用强度来调节分子质量大小是一种直接有效的方法。

此外,WEIGEL等[30]提出hasA使用2种离散功能分别控制HA生成率和分子质量大小的假设,将sehasA四个保守Cys残基以单独或特定组合方式突变,结果显示大多数突变体均表现出单一酶活性改变或分子质量变化,由此认为HA合成速率和分子质量可以单独进行调控。为进一步验证此猜想,BAGGENSTOSS等[25]基于sehasA两个B-X7-B串联基序序列对残基进行定点突变,结果表明,第一个B-X7-B基序中大部分突变体产物分子质量与野生型相比显著降低,然而其酶活性改变较小,说明该基序更多涉及HA大小控制;另一个B-X7-B基序突变体HA分子质量无较大变化,但多数位点突变后酶活性显著提高,比活性范围达野生型70%～177%,说明该基序更多参与hasA活性和HA合成速率调节。由于hasA含有多个跨膜区域,因此HA合成和分子质量调控或受其影响。ZANJANI等[31]应用截断不同C端跨膜区域长度的hasA进行生产,同样观察到所有截短形式酶均表现出HA产量显著变化,但产物分子质量保持在较低的50～60 kDa。上述研究说明HA产物大小与hasA特定聚合活性并不耦合,2种酶功能可以独立改变,在发酵过程中通过酶工程定向改造可实现低分子质量HA的高浓度生产。

2.2 糖前体比率调控HA分子质量

HA生物合成严格受细胞代谢和能量底物可用性影响,需要葡萄糖和谷氨酰胺经代谢途径分别生成前体UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA[32],2种底物水平影响产物分子质量大小。当糖前体比率趋于一致时产物分子质量最高[33],相反,2种糖前体比率发生偏斜则会导致HA分子质量降低[34-35]。为进一步探究两者相关性,CHEN 等[36]首先单独过表达hasA,发现其导致酶对固定UDP单体竞争加剧,造成前体比例不理想,使产物分子质量降低。随后作者通过向培养基中外源添加碳源影响前体比例,以确定分子质量具体调控机制[37]。当外源摄入氨基葡萄糖导致细胞内UDP-GlcNAc水平增加1倍以上,且UDP-GlcUA处于较低检测水平时,所产HA分子质量下降。该现象解释为单一过量UDP-糖前体可以同时结合到hasA的UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA结合位点并与之相互作用,阻碍后续产物正常合成,导致分子质量减少。相反,通过添加葡萄糖和GlcNAc混合物可以解决上述糖前体不平衡现象,两者摄入使UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA同比例增加,此时产物分子质量维持原状。此外,NAD+/NADH比率也能直接影响糖前体表达。JEEVA等[38]向乳酸乳球菌中补充血红素以调控辅因子表达,在有氧条件下随着辅因子水平变化,UDP-GlcNAc/UDP-GlcUA比例发生明显倾斜,HA分子质量呈现显著下降趋势。上述结果说明前体比率与分子质量具有较强正相关性,在HA合成过程中任何一种前体过量都可能成为另一种前体竞争性抑制剂,从而影响糖链的聚合和延伸。

2.3 透明质酸酶(HAase)调控HA分子质量

HAase是一种内源性糖苷酶,可通过切断β-1,4糖苷键实现不同分子质量HA聚合物加工[39]。目前该酶已广泛应用于LMW-HA和o-HA的生产和制备(表1)。HUANG等[40]采用启动子和信号肽组合优化策略在毕赤酵母中高效表达水蛭透明质酸酶(LHAase),并建立基于该酶体外制备LMW-HA与o-HA工艺。WANG等[41]在发酵过程中补充外源LHAase以消除HA荚膜对细胞生长的影响,经合成途径优化后,工程化谷氨酸棒杆菌HA产量达74.1 g/L,产物分子质量比出发菌株降低84%。上述研究为体外酶促制备低分子质量产物提供理论依据,然而该方法需逐步发酵获得HAase和HA,整个过程十分费力。为合理调控LMW-HA和o-HA生产,HU等[42]将HAase和前体基因组合表达质粒转化至谷氨酸棒杆菌,经分批补料发酵获得12.1 g/L o-HA二糖和四糖。JIN等[43]采用Cre/lox系统将LHAase基因整合到枯草芽孢杆菌E168T染色体上,得到产物HA分子质量从1 570 kDa大幅下降到2.2 kDa。另外,作者采用核糖体结合位点优化策略精确调控LHAase表达,实现了特定LMW-HA有效生产。韦朝宝等[44]在兽疫链球菌WSH-24中过表达LHAase,也同样观察到HA分子质量从1 634.8 kDa解聚至72.2 kDa。上述研究表明,利用基因工程技术直接在微生物体内合成高活性HAase可以更好地实现LMW-HA和o-HA高效生产。另外,在此基础上LI等[45]进一步使用温敏性载体过表达HAase,并通过温度调控在32 ℃下获得4.25 g/Lo-HA,其分子质量与出发菌株相比下降97.8%,该研究为采用单一重组菌株调控不同大小HA生产奠定基础。

尽管HA体内外酶解方法已得到大量应用,但固定尺寸HA生产相关报道仍然较少。传统体外降解过程中,常通过调节酶水解时间和浓度来控制LMW-HA长度。为此,VALCARCEL等[46]模拟HA与HAase解聚过程构建pseudo-mechanistic模型,用于计算在不同酶和底物比率下酶促反应所产HA分子质量的反应方程式,以此定义反应过程中酶添加量和反应时间,为实际反应提供参考。该策略可进一步应用于重组菌株表达调控,为深入研究体内LMW-HA和o-HA合成开辟新思路。

3 总结与展望

LMW-HA和o-HA在工业生产中具有广阔应用前景,目前利用基因工程菌株合成LMW-HA和o-HA能够减少传统发酵产品纯化工艺,避免采取物理和化学降解HMW-HA等繁琐步骤;同时以模式微生物菌株为底盘开发的重组工程菌与天然生产菌(如兽疫链球菌)相比不含致病性或内源致病因子,具有更高安全性,在遗传改造中操作也更为简便。本文主要从代谢工程及基因工程角度总结了LMW-HA和o-HA高效生产策略,包括:(1)通过残基修饰定向改造hasA;(2)改变糖前体浓度及比率调节HA分子质量大小;(3)利用体内外HAase酶解实现特定分子质量HA生产。从生物合成角度看,定点修饰hasA已成功实现对多样化HA的精细调控,这是目前调节产物分子质量的有效方法。尽管如此,LMW-HA和o-HA产品的获取仍存在诸多问题,如HA分子质量大小受关键合成酶hasA影响,但由于不同来源hasA自身特性与其所控制的产物大小均存在较大差异,且已报道和分子质量调控有关的残基突变位点与所在酶结构域之间缺乏规律性,无法进一步解释分子质量调控机制。此外,虽然前体表达水平和比率与产物大小存在相关性,但生产菌株前体代谢途径调控复杂,难以有效控制LMW-HA和o-HA生产。另外,部分底盘菌株基因编辑系统及表达调控技术尚未成熟,细胞内质粒表达不稳定,导致产量仍然偏低,限制其产业化应用。

基于当前对上述两者生产调控的认识,未来该领域研究方向可以(1)继续挖掘HA结构调节和组装关键机制,阐明不同分子质量产物合成差异原因;(2)探索不同来源hasA稳定性、活性、底物亲和力等诸多方面存在差异的原因,深入解析该酶结构和作用机制,为利用蛋白质工程以及其天然存在的差异蛋白序列调控HA分子质量生产提供理论基础;(3)筛选高效底盘宿主,完善细胞工厂改造,拓展多个策略组合改造,将定向修饰hasA与代谢前体表达优化策略相结合,提高目标低分子质量产物生产效率;(4)利用分子生物学和生物信息学等手段挖掘新型hasA和HAase,实现高效精准控制HA分子质量大小;(5)通过基因编辑技术实现HA合成相关基因或代谢途径整合或敲除,消除异源表达不稳定影响,使碳通量集中流向HA合成途径,提高LWM-HA和o-HA产量。当前仍需要更多研究来阐明HA分子质量调控机制,在此基础上进一步改造生产菌株和完善生产工艺,以实现低成本、高效率LWM-HA和o-HA生产。

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