苦味是5种基本味觉之一,与其他4种味觉(酸、甜、咸和鲜)相比具有更低的阈值。苦味物质的呈味机理十分复杂,分子结构完全不同的化合物能产生相同的苦味,这与味蕾的味觉苦味受体密切相关。
苦味受体是一类7次跨膜的G蛋白偶联受体,至今为止已发现25种苦味受体,它们可以识别各种类型的苦味物质[1]。当苦味物质与味蕾中的受体结合时,会引起苦味受体的构型改变,激活G蛋白α-亚基途径,从而引起细胞膜内外电位差,信号传递到大脑,产生苦味感知。食品中的苦味物质广泛来源于天然产物及其衍生物,植物本身的次生代谢产物(如酚酸、类黄酮、生物碱)、发酵食品中蛋白的水解产物多肽及美拉德反应产物等都会带有苦味[2]。此外,腐败、未成熟的食物和天然毒素也会带有苦味[3]。
苦味是黄酒的基本滋味之一,适宜的苦味赋予黄酒刚劲、爽口的感觉,但是过重则会破坏酒体的协调性[4-5]。有关报道认为,黄酒的苦味物质为苦味氨基酸、苦味多肽和酪醇等化合物[4, 6],但这些报道尚停留在经验推测阶段,缺乏对黄酒苦味物质基于感官导向的分离鉴定和验证研究。本文综述了国内外学者对清酒、葡萄酒、啤酒和果酒的研究文献,梳理了目前对黄酒苦味的研究现状,介绍基于感官导向的分离鉴定技术,并提出研究黄酒苦味可能的技术思路,旨在为有效降低黄酒苦味的研究提供借鉴。
1 苦味物质的分离鉴定方法
1.1 苦味物质的分离方法
近年来,德国慕尼黑工业大学HOFMANN教授建立了一套系统研究食品中呈味物质的方法——味觉稀释分析(taste dilution analysis,TDA)[2, 7],它能准确高效地鉴定食品中的关键呈味物质。TDA方法以感官评价为导向,运用凝胶色谱(gel permeation chromatography,GPC)、制备色谱等技术分离得到关键呈味物质,进而利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等技术对关键物质进行鉴定,经定量分析和味觉阈值测定后,计算其活性味觉值(dose-over-threshold,DoT),以评价该物质对食品味觉的贡献。目前,利用TDA方法已经成功鉴定了葡萄酒[8]、清酒[9]、白酒[10-11]、奶酪[12]等许多食品中的关键苦味物质。
常见苦味物质的分离方法有溶剂萃取、固相萃取、凝胶色谱、反相制备色谱等[13-14],各方法的优缺点如表1所示。由于样品组分的复杂性,使用单一分离技术难以达到理想的分离纯化效果,因此需要依据不同分离纯化原理选择合适的方法并进行合理联用。HUFNAGEL等[13]在葡萄酒中关键苦味物质羟基苯甲酸乙酯和羟基肉桂酸乙酯类物质的分离鉴定中,依次通过正戊烷和乙酸乙酯萃取分离,得到正戊烷相、乙酸乙酯相和水相3部分,发现苦味组分主要存在于乙酸乙酯组分,对乙酸乙酯组分进一步利用反相制备色谱分离。赵腾飞等[15]在白酒中主要难挥发性苦味物质2种三羟基十八烯酸的分离鉴定中,对旋转蒸发得到的白酒难挥发性组分,通过C18固相萃取后,依次用20%、40%、60%、80%和100%甲醇水溶液洗脱,收集相应组分,发现苦味主要存在于60%甲醇水溶液洗脱组分,进一步对60%甲醇组分进行2次反相制备色谱分离。
表1 苦味物质的不同分离纯化方法比较
Table 1 Comparisons of different separation and purification methods for bitter compounds
分离纯化方法原理优点缺点溶剂萃取有机溶剂的相似相溶样品处理量大,可以选择不同溶剂进行多级萃取萃取效率低,有机试剂耗费量大固相萃取柱填料对样品的保留可以根据目标组分的性质选择相应的柱填料对于未知化合物分离,分离效果有限超滤膜表面的微孔对物质分子量大小进行选择设备简单,快速高效,不影响生物大分子的活性粗分离,分离效果有限凝胶色谱利用凝胶的网状结构,按照分离物的分子量大小差异分离设备简单,无需有机溶剂适合多肽的分离,需要根据待测物质的分子量选择合适的凝胶反相高效液相色谱基于样品在固定相和流动相之间吸附或分配的差异而分离适用性广,分辨率高,高效仪器设备昂贵
1.2 苦味物质的鉴定方法
质谱是鉴定未知物质最重要的手段,尤其是近年来发展的高分辨质谱(high resolution mass spectrometry,HRMS)。质谱常用的电离源有电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)、电子电离(electron ionization,EI)、基质辅助激光解析电离(matrix assisted laser desorption ionization,MALDI)等。飞行时间(time of flight,TOF)和四级杆串联飞行时间(quadrupole tandem time of flight,Q-TOF)是鉴定未知呈味物质最重要的质量分析器。串联质谱法,特别是LC-ESI-MS/MS被广泛应用于各种物质的鉴定[16-19],也有采用MALDI-TOF/TOF-MS对多肽进行鉴定[20]。
NMR也是鉴定未知物质的一个重要工具,通过提供多种一维、二维谱数据,反映出大量物质的结构信息,常用的有一维的1HNMR、13CNMR和全相关谱(total correlation spectroscopy,TOCSY)、异核单量子关系(heteronuclear singular quantum correlation,HSQC)、二维NOE谱(nuclear overhauser effect spectroscopy,NOESY)等。但是NMR对物质的纯度要求较高,如果目标化合物的纯度不够,往往难以利用NMR鉴定。
对于酒精饮料中未知苦味物质,通常需要采用多种方法联用才能准确鉴定其化学结构。HASHIZUME等[9]采用Edman降解、LC-MS和NMR分析,鉴定出清酒的主要苦味物质有焦谷氨酸肽、阿魏酸、阿魏酸乙酯等,并通过对准分子离子m/z[M+H]+为1 214.5和m/z[M+H]+为1 186.5的2个苦味多肽1HNMR对比,发现在δ1.03和δ4.05上存在差异,从而确定前者为焦谷氨酸肽乙酯Pyr-LFNPSTNPW-COOC2H5;赵腾飞等[15]通过HRMS、NMR分析鉴定出白酒难挥发性苦味物质三羟基十八碳烯酸。
2 酒中苦味物质的种类及来源
2.1 清酒中苦味物质
日本清酒和我国黄酒在酿造原料、工艺上最为接近,两者均以大米为酿酒原料,主要不同之处是,黄酒原料多为糯米,精米率约为90%、蛋白质含量约为6%～8%,且以麦曲作酒曲;日本清酒原料为粳米,精米率20%～75%、蛋白质含量在5%以下,且以纯种米曲作酒曲[21]。近年来,HASHIZUME等[9, 22-23]对日本清酒的苦味物质种类及其来源等做了较为详细的研究,分离鉴定出清酒的主要苦味物质有5种苦味肽和2种多肽乙酯。5种苦味肽分别为Pyr-LFNPS、Pyr-LFNPSTNP、Pyr-LFNPSTNPWH、Pyr-LFNPSTNPWHSP和Pyr-LFGPNVNPWHNP,2种多肽乙酯分别为Pyr-LFNPSTNPW-COOC2H5和Pyr-LFGPNVNPW-COOC2H5。苦味多肽的阈值远低于苦味氨基酸,且DoT值均大于1,而多肽乙酯比多肽具有更低的苦味阈值[9]。MAEDA等[24]研究发现上述5种苦味肽在清酒曲中含量低,而大量存在于发酵醪液中,且这些苦味肽均来自水稻谷蛋白(AGT59178.1或type-B4 XP_015626321.1)[22]。KIYONO等[25]在醪液中添加13C-Leu,发现Pyr-13C-Leu/Pyr-12C-Leu的比例未增加,而经米曲霉酶解后醪液中的Pyr-Leu含量明显上升,因此认为清酒中Pyr-Leu是大米蛋白经米曲霉蛋白酶水解形成的,而不是由酵母代谢形成。
相关报道中,清酒中的苦味肽均为焦谷氨酸肽,它普遍存在于发酵食品中[26-27],多肽的N端为焦谷氨酸,是谷氨酰胺的α-氨基和γ-侧链缩合形成的2-吡咯烷酮-5-羧酸(焦谷氨酸),如图1所示。该反应为不可逆反应,加热条件下会加快反应的转换[25]。焦谷氨酸的γ-内酰胺(吡咯烷酮)的存在提高了多肽生物稳定性,不易被蛋白酶降解[28]。
图1 在水溶液中谷氨酰胺(Gln)肽转变为 焦谷氨酸(Pyr)肽的变化[25]
Fig.1 Production of pyro-glutamyl peptide from glutaminyl peptide at the amino-terminal position
2.2 啤酒中苦味物质
啤酒中苦味物质主要来自生产过程中添加的啤酒花,其中α-酸、β-酸和黄腐酚在煮沸阶段发生异构化,形成的异α-酸、β-酸氧化物和黄腐酚氧化产物都是啤酒的苦味物质。其中,异α-酸对啤酒苦味的贡献率较大,占80%,而顺式异α-酸的稳定性较强,反式异α-酸较易降解,因而伴随异α-酸的降解,啤酒的苦味也有所衰减[29-30]。研究表明,随着啤酒的老化,苦味强度逐渐下降,苦感由舒愉转为粗糙和不良的后苦味[31]。INTELMANN等[32]分析了啤酒中苦味物质的变化,发现28 ℃储藏8个月,异α-酸减少了27%,其中反式异α-酸减少了66%,而在0 ℃贮藏,异α-酸几乎没有变化。因此,为减少啤酒储藏过程中异α-酸的降解,通常需要采取控制溶氧量(<100 mg/L)和低温储藏等措施。
2.3 葡萄酒和果酒中苦味物质
不同水果原料酿成的酒中苦味物质存在明显差异,目前对葡萄酒的苦味物质研究最为深入。多酚赋予葡萄酒出色的抗氧化能力,同时也给葡萄酒带来苦味。RUDNITSKA等[33]对31款葡萄酒的苦味和多酚含量进行测定,发现中高苦味的葡萄酒样品中多酚化合物(儿茶素、表儿茶素、没食子酸和咖啡酸等)含量明显高于低苦味的葡萄酒。HUFNAGEL等[8, 13]基于感官导向对葡萄酒中苦味物质进行了系统分离鉴定,发现羟基苯甲酸乙酯和羟基肉桂酸乙酯类物质是葡萄酒的苦味物质。在葡萄酒储存过程中,橡木桶中的苦味多酚栎木素类、鞣花酸等苦味化合物可能进入葡萄酒中,从而形成葡萄酒的苦味[34-35]。柑橘酒的苦味主要由柑橘果实中无苦味的前体物质柠檬苦素A-环内酯在柠檬苦素D-环内酯水解酶的作用下转化而成的具有苦味的柠檬苦素类似物,包括柠檬苦素、诺米林等[36]。
综上所述,不同类型的酒由于其原料和酿造工艺等差异,表现出不同的苦味特性。葡萄酒中的苦味物质多为多酚类化合物,包括儿茶素、表儿茶素、没食子酸乙酯等,主要由葡萄原料带入[8, 13];啤酒的苦味主要来源于酒花中的α-酸,包括葎草酮、合葎草酮和加葎草酮,它们在煮沸阶段发生异构化,形成的异α-酸,如异葎草酮、异合葎草酮和异加葎草酮[32, 37];柑橘酒中的苦味物质有三萜类化合物柠檬苦素和诺米林,以及黄酮类化合物柚皮苷等;清酒中的主要苦味物质是大米蛋白的水解产物苦味肽[9, 22]。对这些化合物的化学结构进行比较可以发现,苦味物质具有一定的共性,通常含—NO2、—N
、—SH、苯环等基团。各类酒中主要苦味物质如表2所示,其化学结构和来源如图2和图3所示。
表2 各类酒中的主要苦味物质
Table 2 The bitter compounds in alcoholic drinks
酒类编号化合物名称化合物类型阈值/(mg·L-1)参考文献葡萄酒A1儿茶素A2表儿茶素A3没食子酸乙酯A4阿魏酸乙酯A5对香豆酸乙酯A6咖啡酸乙酯A7鞣花酸黄烷醇类酚酸乙酯类多酚内酯类1192704381581372292[8, 13][34]啤酒B1葎草酮B2合葎草酮B3加葎草酮B4异葎草酮B5异合葎草酮B6异加葎草酮α-酸类1721217108[32]柑橘酒C1柠檬苦素C2诺米林C3柚皮苷三萜类黄酮类2220[36]清酒D1Pyr-LFNPSD2Pyr-LFNPSTNPD3Pyr-LFNPSTNPWHSPD4Pyr-LFGPNVNPWHNP多肽类316a160a436a240a[22]
注:a)单位为μg/L
图2 酒中苦味物质的化学结构式
Fig.2 Chemical structural formula of bitter substances in alcoholic drinks
图3 酒中苦味物质的来源
Fig.3 The sources of bitter compounds in alcoholic drinks
3 降苦方法
国内外学者对酿造酒中的苦味物质进行研究,并根据苦味物质的特性,采用合适的方法对酿造酒进行降苦,通常包括吸附法降苦、掩盖法降苦和生物酶法降苦。
吸附降苦利用吸附剂选择性吸附苦味物质以达到降苦目的,但吸附剂的使用可能会影响酒的品质[38],在果汁和酒的降苦中使用的吸附剂有活性炭、大孔吸附树脂[39]、活性硅酸镁[40]等。活性炭处理可以降低清酒中的苦味多肽和阿魏酸的含量,且随着活性炭用量的增加,苦味物质含量明显降低,当使用量为500 mg/L时,苦味肽和阿魏酸含量下降80%以上,但是活性炭处理使清酒口感失调[9,41]。
掩盖法通过添加掩蔽剂来掩盖、减轻苦味,主要用于蛋白质消解液的降苦。环糊精是常见的掩盖剂,环糊精拥有亲水的外部表面和疏水的内部空腔,当疏水性的苦味肽进入环糊精的内部空腔时可达到掩盖其苦味的目的[22]。大豆蛋白水解液中使用β-环糊精降苦效果显著[42],但未见酒精饮料中采用掩盖法的报道。
生物酶法降苦具有专一性强,且对样品风味品质影响较小的优点,是最理想的降苦方法,但需要先明确苦味物质,才能有针对性选择合适的酶。李睿晓[43]利用柚苷酶处理柚子汁以去除苦味物质柚皮苷,能保持柚子酒特有的风味。对于苦味肽的降苦,外加蛋白酶处理是常用的降苦方法[44],蛋白酶将苦味肽水解成氨基酸,从而降低苦味肽的含量。
4 黄酒中苦味物质研究进展及展望
黄酒被誉为“液体蛋糕”,其氨基酸含量居酿造酒之首[45],苦味氨基酸通常被认为是黄酒苦味的来源之一[4, 6]。但苦味氨基酸的阈值比较高[8],如表3所示,黄酒中的苦味氨基酸含量均不能达到其苦味阈值。HUFNAGEL等[8]对葡萄酒进行苦味重构,发现缺少苦味氨基酸对葡萄酒的苦味无明显差异。苦味氨基酸仅在帕玛森芝士中被认为是关键苦味物质,其中 L-亮氨酸和L-异亮氨酸含量分别达到11.55和10.48 g/kg,DoT分别为8.0和7.6[45]。黄酒中苦味氨基酸的DoT均小于0.2,均不能达到苦味阈值,且目前尚无对黄酒苦味氨基酸重构来验证苦味氨基酸的研究报道。
表3 苦味氨基酸阈值及其在黄酒中的含量
Table 3 Threshold of bitter amino acids and their contents in Huangjiu
苦味氨基酸阈值/(mg·L-1)含量/(mg·L-1)DoT(含量/阈值)L-亮氨酸1 441[8]76.1～260.8[46]0.05～0.18L-异亮氨酸1 310[8]24.5～77.8[46]0.02～0.06L-缬氨酸3 510[8]36.9～122.5[46]0.01～0.03L-酪氨酸 724[8]51.1～136.0[46]0.07～0.19L-色氨酸 816[45]42.2～54.1[47]0.05～0.07L-苯丙氨酸7 425[8]40.3～129.3[46]0.01～0.02L-组氨酸6 975[8]16.4～29.8[46]0.02～0.04L-精氨酸13 050[8]128.4～249.2[46]0.01～0.02L-赖氨酸11 680[8]77.5～124.6[46]0.01
黄酒中的蛋白质主要来源于麦曲和大米,少量来自酵母等微生物菌体自溶[48]。麦曲中的小麦蛋白大部分在制曲中分解,并带到醪液中[49]。麦曲蛋白和大米蛋白在蛋白酶作用下,进一步水解成多肽及氨基酸。大多数苦味肽具有较高的疏水性,在完整的球蛋白分子中,大部分疏水性侧链藏在内部,它们不接触味蕾,不易产生苦味,而当蛋白质水解时,肽链含有的疏水性氨基酸被充分暴露出来,接触味蕾产生苦味[50]。NEY[51]提出苦味肽和多肽疏水性相关,并提出了Q值作为评估苦味的指标。Q=∑Δf/n,其中:Q表示肽的平均疏水性,Δf指氨基酸的疏水性(cal/mol),n为多肽的氨基酸残基数。当Q>1 400 cal/mol时呈现苦味,Q<1 300 cal/mol时不呈现苦味,Q值介于1 300～1 400 cal/mol则不能判断该肽是否具有苦味,并对21种化学合成的和37种文献报道的苦味肽进行Q值判断验证,发现绝大多数苦味多肽均符合此规律。但该指标仅考虑了组成多肽的氨基酸的种类和数量,事实上氨基酸的序列、空间结构也会影响苦味[52-53]。
本研究团队基于苦味导向分离,利用正丁醇萃取、C18固相萃取、半制备HPLC分离和UPLC-Q-TOF-MS鉴定,以及焦谷氨酸肽酶酶切验证,首次从黄酒中分离得到苦味物质焦谷氨酸多肽Pyr-LFNPSTNPWHSP[54],并通过NCBI数据库检索,确定其来源于大米谷蛋白(GenBank号为AGT59178.1)。分别采用风味蛋白酶、木谷蛋白酶和酸性蛋白酶进行黄酒中Pyr-LFNPSTNPWHSP降解实验,发现3种蛋白酶处理对黄酒的理化指标和挥发性风味物质无明显影响,而以风味蛋白酶的降苦效果最佳,Pyr-LFNPSTNPWHSP降解率为25.2%,苦味强度由7.2降至5.8。利用UPLC-QTOF-MS对不同蛋白酶酶解产物进行分析,结果显示风味蛋白酶能够作用Pyr-LFNPSTNPWHSP的多个位点,得到苦味强度较低的色氨酸(W)、焦谷氨酰亮氨酸(Pyr-L)等小分子氨基酸和多肽片段,从而达到降低黄酒苦味的效果。
基于生产经验,对于已知可能的苦味物质,通过定量分析和苦味验证,能够快速寻找黄酒的苦味物质。然而,只有对未知苦味物质的深入挖掘,才能了解黄酒苦味物质之间相互作用的全貌。虽然其他酒类中苦味物质研究方法可为黄酒苦味物质的研究提供有益借鉴,但由于黄酒酿造工艺复杂,原料涉及大米和小麦,参与酿造的微生物和酶的种类繁多,对黄酒中未知苦味物质的研究仍是一项严峻挑战。
黄酒是我国的历史经典产业,也是中华文化的代表性符号之一。过量的苦味是制约黄酒酿造向机械化自动化发展和消费者接受度提升的行业共性关键难题[4]。期待通过系统深入研究,明确黄酒中关键苦味物质,并在此基础上进一步研究其形成机制,夯实黄酒风味化学的理论体系,为黄酒苦味的定向调降提供理论依据和技术支撑。
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