组胺作为常见的生物胺,是由高蛋白食品中的某些微生物合成脱羧酶分解游离氨基酸而形成,广泛存在于水产品和发酵制品[1-2]。人体摄入少量的组胺能够参与核素、激素和关键蛋白质的合成,具有控制胃酸分泌、调节细胞因子和促进肾上腺素释放等生理功能。然而,当组胺在体内积累达到一定浓度或过量摄入时,诱发中毒症状,临床表现为头痛、恶心、呼吸困难和血压紊乱,严重者甚至死亡[3]。近年来,黄酒、豆酱、虾酱和腌制鱼中生物胺的平均超标率达13.58%[1-2,4],由其引发的食物中毒在我国多地均有报道[4-5],该类食品安全问题已成为除了食源性致病菌外,严重威胁公共健康安全的风险因子之一。
目前公认的组胺中毒螯合剂主要有苯海拉明和扑尔敏,但频繁使用引发机体中性粒细胞减少、肠胃不适、肾功能异常以及头晕嗜睡等副作用[6]。肠道是人体最大的免疫器官之一,在外源物的吸收、分布和排泄过程发挥关键作用,其功能障碍会诱导机体损伤[7]。因此,组胺对机体的危害可能与肠道功能紊乱密切相关。最新研究指出,通过食品功能因子调节肠道微生态平衡可有效缓解致病菌[8]、真菌毒素[9]和重金属[10]等危害因子产生的毒害作用。益生菌作为重要的新型功能食品,已被大量的动物和临床实验证实不具有侵袭性和致病性,进入肠道后可以与病原体和毒素竞争,黏附于肠黏膜上皮细胞,促进肠上皮细胞存活,增强屏障功能并与免疫细胞直接相互作用,从而调节机体免疫,抑制炎症反应和氧化应激[11]。但是,有关益生菌通过调控肠道健康缓解组胺食物中毒的研究鲜有报道。
枯草芽胞杆菌JZXJ-7(Bacillus subtilisJZXJ-7,Bs-JZXJ-7)是本团队从锦州乌虾酱中分离得到的一株益生菌,经生理特性和体外降胺实验证实,Bs-JZXJ-7在广泛的pH值范围和高渗环境下,对尸胺、腐胺、酪胺和组胺等多种生物胺均有显著的清除能力,尤其是对组胺的去除率达到68.89%[12],但其对于组胺诱导机体损伤的保护作用还未见探究。本文拟以Bs-JZXJ-7为研究对象,通过体外模拟胃肠环境,阐明其在胃肠消化液的稳定性;自主构建小鼠组胺中毒模型,检测模型小鼠经Bs-JZXJ-7干预前后,一般行为学变化、腹腔脏器指数、靶标器官病理损伤、肠黏膜紧密连接蛋白、肠组织炎症相关因子和抗氧化功能等指标,综合评价Bs-JZXJ-7对组胺中毒小鼠的保护作用,以期为基于Bs-JZXJ-7开发抗组胺的膳食补充剂奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 试剂
组胺(纯度≥98.9%)、胃蛋白酶(3 000 U/mg)、胰蛋白酶(3 000 U/mg)、HCl、KH2PO4、NaOH,沈阳化学试剂厂;病理组织染色液、蛋白质免疫印迹试剂盒,生物工程(上海)股份有限公司;多聚甲醛、磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.2)、NaCl、无水乙醚、脑心浸液肉汤(brain heart infusion,BHI),北京奥博星生物技术有限公司;小鼠细胞因子白介素(interleukin,IL)-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫(ELISA)试剂盒,武汉酶免生物科技有限公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)测试盒、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)测试盒、D-乳酸(D-lacticacid,D-LA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、总抗氧能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)试剂盒,南京建成生物工程研究所。
1.1.2 菌株
枯草芽胞杆菌JZXJ-7(Bacillus subtilisJZXJ-7,Bs-JZXJ-7)由渤海大学大宗水产品贮藏加工与安全控制团队保藏。将冻存于-80 ℃冰箱中的Bs-JZXJ-7取出,以2%(体积分数)接种量接种至3% NaCl-BHI培养基,37 ℃恒温培养24 h。连续活化2代后,以同样接种量接种至200 mL,3% NaCl-BHI培养基中扩培,同样条件培养后,菌悬液4 ℃,8 000×g离心20 min,弃上清液,得到Bs-JZXJ-7沉淀。用预冷PBS清洗沉淀,重复离心操作后,弃上清液,获得干净的菌株沉淀。随后,使用无菌PBS重悬沉淀,采用平板计数法明确Bs-JZXJ-7初始菌量,根据实验需要10倍稀释至109CFU/mL,并通过平板计数检测终菌液实际浓度,4 ℃保存备用。
1.1.3 仪器
DL-CJ-2N双人单面净化工作台,苏州净化公司;SPX-25生化培养箱,宁波海曙赛福仪器厂;5804R高速冷冻离心机,湖南湘仪;ABI stePone Plus PCR仪,德国艾本德公司;GI54DS立式高压蒸汽灭菌锅,致微(厦门)仪器有限公司;Multiskan FC酶标仪,赛默飞世尔;HS-B7126-B生物组织自动包埋机、HS-S7220-C石蜡包埋机、KD-P组织摊片机,湖北贝诺医疗科技有限公司;EcliPse E100尼康光学显微镜,日本尼康公司。
1.2 模拟胃肠液消化实验
模拟胃消化液配制:取0.1 g NaCl和38 mg胃蛋白酶,加入35 mL双蒸水和365 μL 0.1 mol/L HCl溶液,用HCl溶液调整pH值至3.2后,加蒸馏水定容至50 mL。模拟肠消化液配制:取0.35 g KH2PO4溶于12.5 mL双蒸水,依次加入9.5 mL 0.2 mol/L KOH溶液、20 mL蒸馏水和0.5 g胰蛋白酶,用0.2 mol/LNaOH溶液调整pH值至7.5,加蒸馏水定容至50 mL,同时配制无胃蛋白酶和无胰蛋白酶的胃液和肠液。
根据体外消化实验的操作要求并稍作修改,取1 mLBs-JZXJ-7菌悬液(1.1.2步骤制备)置于20 mL模拟胃消化液中,放入37 ℃水浴锅中孵育1.5 h后,常温8 000×g离心20 min,收集沉淀,测定胃液胁迫后的活菌数量,随后重悬于20 mL模拟肠消化液中,37 ℃水浴锅中孵育2.5 h。再次对样品进行梯度稀释,采用平板计数法统计活菌数,实验平行3次。存活率的计算如公式(1)所示:
存活率
(1)
式中:N1和N2分别代表Bs-JZXJ-7经模拟胃肠液孵育前后的活菌数目,lg CFU/mL。
1.3 动物实验
无特定病原菌级(specific pathogen free,SPF)8周龄C57BL/6J小鼠30只,体重(20±2) g,北京斯贝福生物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2018-06073,动物房温度(20±2) ℃,湿度(45±5)%,12 h日光灯明暗交替循环,自由进食和饮水,适应性饲养7 d。适应期结束,将30只小鼠随机分为3组:对照组(control,CK)、模型组(histamine,HIS)和Bs-JZXJ-7干预组(Bs-JZXJ-7+HIS)。研究表明人体摄入超过40 mg HIS出现明显的中毒症状,由此换算出小鼠HIS的给药剂量,益生菌的摄入剂量参照文献[8]并结合Bs-JZXJ-7的抗胃肠消化特性设定。实验分为干预期、造模期和恢复期,共计15 d。第1～7天为干预期,Bs-JZXJ-7+HIS组小鼠每天灌胃0.1 mL Bs-JZXJ-7菌悬液(约108CFU,1.1.2步骤制备),CK和HIS组灌胃等量无菌PBS;第8天为造模期,HIS和Bs-JZXJ-7+HIS组小鼠灌胃0.1 mL HIS溶液(约20 mg/kgBW),CK组灌胃等量无菌PBS;第9～15天为恢复期,CK、HIS和Bs-JZXJ-7+HIS组小鼠恢复正常饮食饮水,实验设计思路如图1-a所示。实验结束,使用乙醚麻醉小鼠,摘眼球取血,4 ℃,1 500×g,离心10 min收集血清,随后颈椎脱臼迅速处死小鼠,解剖收集脏器组织,用于后续检测。所有程序遵循中国实验动物保护协会要求,实验动物伦理审查批准文号:GDOU-LAE-2022-12。
1.3.1 行为学指标测定
小鼠模型暴露HIS期间,观察并记录各组小鼠的活动、饮食、精神状况、粪便形态和体质量变化等指标,并在解剖后观察小鼠脏器损伤差异。参考疾病活动指数评价标准[13],结合体质量变化百分比(与各小鼠初始体重相比)、粪便形态和过敏中毒症状等3项指标进行评分,合计12分。
1.3.2 脏器指数测定
各组小鼠解剖后,立即取出心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、肠组织,用预冷PBS冲去脏器表面残血和修剪多余的脂肪,滤纸吸干,称质量并按公式(2)计算各脏器指数。
脏器指数=脏器质量(mg)/小鼠体重(g)
(2)
1.3.3 脾脏和结肠组织病理学观察
取厚度为2～3 cm,大小为1～5 cm的脾脏组织,以及距离肛门2 cm处结肠组织,分别置于4%多聚甲醛溶液室温浸泡固定24 h,经酒精梯度脱水、透明处理,包埋制作石蜡切片,厚度5 μm。常规脱蜡复水、经苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,中性树胶封片后于光学显微镜(100×/400×)下观察脾脏和结肠组织结构完整性。从CK、HIS和Bs-JZXJ-7+HIS组分别随机选取5张脾脏和结肠组织病理切片,统计溃烂程度、水肿和炎性细胞浸润,进行脏器组织病理学评分。
1.3.4 肠黏膜屏障功能检测
针对肠黏膜屏障结构基础—胞质紧密连接蛋白-1(Zonula occluden-1,ZO-1)和闭合蛋白(Occludin),采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting,WB)检测ZO-1和Occludin蛋白表达量,操作如下:根据WB试剂盒说明书,使用含体积分数1%苯甲基磺酰氟的裂解液提取肠组织总蛋白,用质量分数8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,然后转移至聚偏二氟乙烯膜,将膜用质量分数5%脱脂奶粉试剂封闭1 h,在与一抗β-actin、ZO-1(1∶500)和Occludin(1∶500)4 ℃下过夜孵育,然后与4 μL对应的二抗(抗兔免疫球蛋白和抗鼠免疫球蛋白,1∶5 000)25 ℃摇床孵育1.5 h。采用WB图像用超灵敏增强型化学发光底物试剂盒成像,通过FluorChem E系统获得结果图。CK、HIS和Bs-JZXJ-7+HIS组样本分别平行3次检测。进一步检测肠壁通透性标志物,血清中LPS、DAO和D-LA含量,结合WB结果评价肠黏膜屏障功能。
1.3.5 肠组织细胞因子和抗氧化能力分析
使用试剂盒,按照说明书要求制备肠组织样品,测定试样中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10含量,单位为pg/mL;试样中抗氧化指标SOD、CAT和T-AOC,氧化胁迫因子MDA,单位为U/mg。
1.4 数据处理
使用Excel整理原始数据,所有数据的差异分析使用One-way ANOVA。根据Bartlett’s检验差异是否具有显著性,进而选择Dunnett’s或Tukey’s进行各组间的比较检验。结果用平均值±标准差表示,当P<0.05时,组间存在显著差异;Origin Lab Pro软件作图,AlphaView软件对紧密连接蛋白条带定量分析。
2 结果与分析
2.1 模拟胃肠液对Bs-JZXJ-7稳定性的影响
益生菌对胃肠液的耐受性是衡量能否发挥益生功效的关键指标。Bs-JZXJ-7菌株在模拟胃肠道条件下,首先经胃液中胃蛋白酶和强酸环境胁迫,其初始和胃液孵育后的活菌数分别为(9.21±0.0)和(8.89±0.15)lg CFU/mL,存活率为96.52%;随后Bs-JZXJ-7在肠液胰蛋白酶和碱性环境下孵育,剩余活菌数仍有[(8.38±0.31) lg CFU/mL],与初始菌量相比,活菌数进一步下降,但差异不显著(P>0.05),存活率仍有91.53%。与已有研究报道的Lactobacillus plantarum R101、Pediococcus pentosaceus P440和Lactobacillus casei LC2W的胃肠液耐受性相比[13-14],本研究发现Bs-JZXJ-7菌株比乳酸菌属具有更强的抗胃肠蛋白酶酶解和耐酸碱腐蚀能力,可以较高活性通过胃肠消化道,其抗逆性可能与该菌株在生长稳定期(≥109CFU/mL)形成高抗性芽胞体有关,且这一推论在FRITTS等[15]研究中得到证实。
2.2 Bs-JZXJ-7对组胺中毒小鼠一般行为学的影响
组胺经口攻毒C57BL/6J小鼠构建中毒模型,疾病活动指数(disease activity index,DAI)是评价组胺诱导机体损伤的重要指标。小鼠的自发活动行为、体重变化及DAI评分,如图1所示。实验期间,对照组(CK)小鼠活动自如、毛色光泽、粪便没有变化,小鼠暴露组胺后,模型组(HIS)和干预组(Bs-JZXJ-7+HIS)小鼠出现不同程度中毒症状,其中模型组约90%小鼠快速搔抓、摩搓鼻周围、弯呈弓形、伴有扎堆和腹泻现象,Bs-JZXJ-7干预组仅有10%小鼠出现行动缓慢、轻微腹泻和呼吸急促症状(图1-b)。模型小鼠暴露组胺2 d后,与对照组相比,模型组小鼠体重明显下降,干预组未见下降;实验初始小鼠体重(20.12±0.69)g随着攻毒时间延长,模型组小鼠体重持续下降,暴露第7 d,体重约(14.34±1.47) g,而干预组小鼠体重趋于稳定,终体重约(18.82±1.11) g,二者存在显著差异(P<0.05,图1-c)。如图1-d所示,实验结束时,模型组小鼠DAI评分(7.33±0.61)显著高于干预组(4.28±0.41)(P<0.05)。传统观点认为,组胺仅造成过敏性食物中毒症状,不影响机体正常的饮食饮水,体重变化平稳[16]。然而,本研究发现,组胺除了诱导小鼠过敏,还会引起体重减轻,产生这种结果差异可能与机体暴露组胺剂量有关,本文模拟高剂量(20 mg/kg BW)组胺急性食物中毒,而前人针对低剂量(10 mg/kg BW)组胺慢性食物中毒。成艳波等[17]也证实饲料中较高含量的组胺会阻碍水产动物生长发育,引起生长性能下降和机体发育异常。此外,有研究表明益生菌可显著改善机体的免疫能力和抗逆功能[14],这与本研究一致,Bs-JZXJ-7干预不仅缓解了组胺诱导的小鼠体重减轻,还显著降低小鼠DAI评分,提示Bs-JZXJ-7有望成为缓解组胺食物中毒的潜在益生菌。
a-动物实验设计思路;b-小鼠一般活动行为,红色箭头表示稀便情况;c-小鼠体重变化率;d-疾病活动指数(DAI)评分
图1 枯草芽胞杆菌JZXJ-7对组胺暴露小鼠行为、体重和疾病活动指数的影响
Fig.1 Effect of Bacillus subtilisJZXJ-7 on behavior, body weight change, and DAI score in histamine exposed mice 注:**,组间在P<0.01水平上差异显著;***,组间在P<0.001水平上差异显著(下同)
2.3 Bs-JZXJ-7对组胺中毒小鼠脏器指数的影响
组胺毒性造成小鼠体重波动的同时可能引起脏器组织发生变化,进而诱导器官形态和质量的改变。为了避免小鼠个体质量差异引起的脏器质量差别问题,本节利用脏器指数来评价各组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、肠组织受组胺的损伤程度。结果显示,与对照组(CK)相比,各组小鼠心脏、肝脏、肺、肾脏和胃的形态及脏器指数无显著差异(P>0.05);模型组(HIS)小鼠脾脏器指数为(4.75±0.65)mg/g,显著高于对照组的(2.28±0.22) mg/g(P<0.05),但干预组(Bs-JZXJ-7+HIS)的为(2.45±0.37) mg/g,与对照组无显著差异(P>0.05);模型组小鼠肠脏器指数为(92.14±3.65) mg/g极显著(P<0.01)高于对照组,干预组仅显著高于对照组(P<0.05),且模型组与干预组的(80.85±1.27) mg/g存在差异(P<0.05,图2-b)。脾脏和肠道受到外源物侵袭时,脏器出现充血,肥大和水肿症状[18],与本研究形态学观察结果相似(图2-a),这也解释了组胺暴露引起小鼠脾脏和肠组织脏器指数升高的原因。此外,脏器指数是探究外源化合物作用机体靶器官的重要线索[19],本研究结果表明,脾脏和肠道均为组胺侵袭的重要器官,但因组胺引起肠组织脏器指数极显著升高,提示肠道受损伤更严重。值得注意的是,Bs-JZXJ-7干预显著下调了小鼠脾脏和肠脏器指数,说明Bs-JZXJ-7菌株促进了小鼠腹腔脏器形态上的恢复,降低组胺中毒对机体的损伤。
a-小鼠腹腔脏器形态(红色箭头表示充血肿胀);b-脏器指数
图2 枯草芽胞杆菌JZXJ-7对组胺暴露小鼠脏器 形态学和脏器指数的影响
Fig.2 Effect of B. subtilisJZXJ-7 on organ morphology and organ coefficient in histamine exposed mice 注:不同小写字母表示组间存在显著差异(P<0.05)(下同)
2.4 Bs-JZXJ-7对组胺中毒小鼠脾脏和结肠病理组织学的影响
为进一步探明组胺诱导小鼠靶器官的病理改变,以及Bs-JZXJ-7对损伤的保护作用,本节选取形态上具有典型损伤症状的脾脏和结肠进行HE染色。结果显示,对照组(CK)小鼠脾小体形态及数量正常,脾细胞排列紧密有序,细胞核清晰;模型组(HIS)小鼠脾囊被破坏,生发中心分散,脾细胞数量明显减少,细胞排列稀疏无序;与模型组比较,Bs-JZXJ-7菌株干预后,小鼠脾细胞数量显著增加,细胞排列整齐,核仁清晰,少间隙,与对照组趋近(图3-a)。对脾脏病理损伤定量分析,如图3-b所示,模型组小鼠脾脏病理评分较对照组显著升高(P<0.05),而干预组病理评分与对照组无显著差异(P>0.05)。结肠病理组织学结果显示,对照组小鼠肠道腺体正常,肠黏膜结构完整、光滑,腺体清晰;模型组小鼠肠壁损伤、肠黏膜上皮糜烂,腺体隐窝结构破坏,杯状细胞减少消失,伴有大量中性粒细胞浸润;经Bs-JZXJ-7菌株干预后,小鼠肠黏膜结构相对完整,杯状细胞数量得以维持,中性粒细胞浸润区域明显减少(图3-c)。如图3-d所示,与对照组比较,模型组和干预组小鼠结肠病理评分均显著升高(P<0.01,P<0.05),但模型组病理评分明显高于干预组(P<0.05)。
a-小鼠脾脏病理学观察;b-脾脏病理评分;c-小鼠结肠病理学观察;d-结肠病理评分
图3 枯草芽胞杆菌JZXJ-7对组胺暴露小鼠脾脏和结肠病理学的影响
Fig.3 Effect of B. subtilisJZXJ-7 on splenic and colonic pathology in histamine exposed mice
脾脏是机体最大的外周淋巴器官,富含B细胞和浆细胞,与机体的免疫功能密切相关,本研究表明,组胺中毒不仅造成小鼠脾脏形态上的改变(脏器指数升高),还诱导其病理损伤,而Bs-JZXJ-7干预对组胺造成的小鼠脾脏损伤具有正向调节作用,此结果与乳酸菌属能改善免疫抑制小鼠脏器指数和病理损伤的结果相似[20]。组胺对小鼠结肠上皮组织结构完整性具有破坏作用,造成杯状细胞消失,杯状细胞是肠黏膜上皮细胞中能够分泌黏液,形成疏水性凝胶层的功能性细胞,其减少加剧组胺中毒形成多位点病灶,而Bs-JZXJ-7干预维持了杯状细胞数量,修复肠道黏液屏障,病变减轻,肠腺变性得到改善,黏膜仅有少量炎性细胞浸润,GARG等[21]也报道益生菌Lactobacillus reuteriLR6通过维持肠黏膜上皮细胞完整性,修复肠组织病理改变。据此,Bs-JZXJ-7菌株可缓解组胺中毒小鼠脾脏和肠组织病理损伤,减轻组胺危害。
2.5 Bs-JZXJ-7对组胺中毒小鼠肠黏膜屏障功能的影响
组胺诱导小鼠结肠病理改变可能增加肠内容物外溢风险,本节探究了组胺和Bs-JZXJ-7干预对小鼠肠黏膜紧密连接蛋白和肠壁通透性标志物的影响。结果显示,对照组(CK)小鼠结肠样品的ZO-1和Occludin蛋白条带清晰,模型组(HIS)的2种蛋白条带模糊,甚至消失,而Bs-JZXJ-7干预后,样品的ZO-1和Occludin蛋白条带亮度与对照组相近(图4-a)。对紧密连接蛋白表达定量分析(图4-b),与对照组相比,组胺暴露显著(P<0.001)降低ZO-1和Occludin蛋白表达量,经Bs-JZXJ-7干预可维持2种蛋白表达量,但仍与对照组存在差异(P<0.05)。血清检测结果显示,模型组小鼠血清LPS、DAO和D-LA浓度显著高于对照组(P<0.01,P<0.05,P<0.05),分别为对照组1.8倍、1.3倍、1.35倍,而Bs-JZXJ-7干预组与对照组组间数据无显著差异(P>0.05,图4-d～图4-f)。综上,组胺攻毒抑制了小鼠肠黏膜紧密连接蛋白表达,导致肠屏障紧密连接结构异常,造成肠壁通透性增加诱发内毒素移位,这也解释了模型组小鼠脾脏出现的病理损伤(图3-a)可能与LPS等有害物质扩散有关。LI等[22]指出当肠屏障功能障碍时,肠内毒素可以侵入深层组织和血液,诱导肾脏和脾脏等腹腔脏器多位点形态及病理损伤。与模型组相反,小鼠经Bs-JZXJ-7预处理可显著改善肠黏膜屏障功能,降低血清LPS、D-LA和DAO水平,这一过程与其上调ZO-1和Occludin蛋白表达相关。YIN等[23]也报道Pediococcus pentosaceusL1通过强化小鼠肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达,缓解了大肠杆菌感染造成的腹腔多脏器损伤。因此,Bs-JZXJ-7维系了小鼠肠黏膜屏障功能,减轻组胺暴露的健康危害。
a-ZO-1和Occludin免疫印迹定性分析(β-actin内参蛋白);b-ZO-1蛋白定量分析;c-Occludin蛋白定量分析;d-血清LPS含量; e-血清DAO含量;f-D-乳酸(D-LA)浓度
图4 枯草芽胞杆菌JZXJ-7对组胺暴露小鼠肠黏膜屏障功能的影响
Fig.4 Effect of B. subtilisJZXJ-7 on intestine mucosal barrier function in histamine exposed mice
2.6 Bs-JZXJ-7菌株对组胺中毒小鼠肠组织细胞因子和抗氧化酶活性的影响
组胺诱导小鼠肠屏障功能障碍,可加剧肠道炎症反应,本节针对组胺暴露和Bs-JZXJ-7干预小鼠肠组织中炎症相关的细胞因子开展研究。结果显示,与对照组(CK)相比,模型组(HIS)小鼠结肠IL-1β、IL-6和TNF-α含量均极显著升高(P<0.01),分别达到(382.34±22.05)、(219.15±14.28)和(288.63±19.81) pg/mL,而IL-10含量显著降低(P<0.01);与模型组相比,经Bs-JZXJ-7干预组小鼠结肠IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著降低(P<0.05),IL-10含量显著升高(P<0.05),且与对照组无明显差异(P>0.05,图5-a～图5-d)。细胞因子是由免疫细胞合成和分泌,其中IL-1β、IL-6和TNF-α具有促炎活性,IL-10具有抑炎活性,它们互制约,参与机体免疫,当二者比例失调,会对细胞产生伤害作用,导致炎症浸润[24]。因此,小鼠组胺暴露后,结肠组织中促炎和抑炎因子的动态平衡被破坏,朝向过度炎性反应发展,形成了结肠病理学观察的中性粒细胞浸润损伤(图3-c),预补充Bs-JZXJ-7可显著缓解组胺诱导的结肠炎症。PARK等[25]研究Lactobacillus acidophilus对炎症性肠道的保护作用时,发现L.acidophilus通过激活Treg细胞分泌IL-10,并抑制Th17细胞合成IL-1β、IL-6和TNF-α,减轻炎症损伤,与本研究结果相似。
a-IL-1β含量;b-IL-6含量;c-TNF-α含量;d-IL-10含量;e-SOD活力;f-CAT活力;g-T-AOC活力;h-MDA含量
图5 枯草芽胞杆菌JZXJ-7对组胺暴露小鼠结肠炎症和氧化应激的影响
Fig.5 Effect of B. subtilisJZXJ-7 on colonic inflammation and oxidative stress in histamine exposed mice
过度炎症会诱发氧化应激,如图5-e～5-h所示,与对照组相比,模型组小鼠结肠组织SOD、CAT和T-AOC指标均显著降低(P<0.05),仅为对照组76.62%、70.26%和66.45%,且伴有MDA含量显著升高(P<0.05),为对照组1.89倍;与模型组比较,经Bs-JZXJ-7干预提高了小鼠结肠组织中SOD和CAT活力(P<0.05)以及T-AOC能力(P<0.05),同时降低MDA含量(P<0.05)。SOD和CAT是天然的抗氧化酶,对维持机体氧化平衡起至关重要的作用,SOD通过催化不稳定的O2-产生稳定的H2O2来清除氧自由基,而CAT可继续催化H2O2,生成对机体无害的O2和H2O,一旦SOD或CAT活性降低或含量减少,将无法快速清除O2-和H2O2等,致使其在体内大量聚积而生成高活性的羟基,引起无法逆转的细胞损伤,此外,T-AOC可反映机体内总体的抗氧化水平,MDA与氧化胁迫密切相关[26]。
本研究表明,小鼠组胺暴露后结肠组织的抗氧化酶活性降低,抗氧化能力减弱,氧化胁迫程度加重,结肠组织发生氧化应激,当小鼠经Bs-JZXJ-7干预后结肠组织中失衡的抗氧化酶系统趋于正常,抗氧化能力提高,从而改善组胺诱导的氧化损伤。机体的健康离不开肠道菌群的调节作用,肠道微生物结构和功能的变化直接影响肠道免疫和炎症性肠病的发展和修复[7,23]。在未来研究中,将继续挖掘Bs-JZXJ-7对组胺中毒小鼠保护作用与肠道菌群的关联及潜在机制。
3 结论
虾酱源枯草芽胞杆菌JZXJ-7具有较强的胃肠消化液耐受性,组胺中毒小鼠模型经该菌株干预后,可显著缓解体重减轻、改善脾脏和结肠组织形态学及病理学损伤、维系肠黏膜ZO-1和Occludin蛋白表达、保护肠屏障功能、阻止LPS、DAO和D-LA等有害物质移位、抑制结肠组织炎症反应并提高其抗氧化能力,降低了组胺对机体的危害。综上所述,枯草芽胞杆菌JZXJ-7对组胺暴露小鼠具有明显的保护作用,研究成果将为益生菌类抗胺功能食品的开发及应用提供理论支持。
[1] SANGX, MA X X, HAO H S, et al.Evaluation of biogenic amines and microbial composition in the Chinese traditional fermented food grasshopper sub shrimp paste[J].LWT, 2020, 134:109979.
[2] HUM, DONG J, TAN G L, et al.Metagenomic insights into the bacteria responsible for producing biogenic amines in sufu[J].Food Microbiology, 2021, 98:103762.
[3] TABANELLIG.Biogenic amines and food quality:Emerging challenges and public health concerns[J].Foods (Basel, Switzerland), 2020, 9(7):859.
[4] 刘光明,梁一巍, 李传勇, 等.海洋中上层鱼类产品中生物胺的调查与控制[J].中国食品学报, 2019, 19(8):1-12.
LIU G M, LIANG Y W, LI C Y, et al.Investigation and control of biogenic amines in marine pelagic fishes products[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2019, 19(8):1-12.
[5] 徐梓童,孙文凯, 商庆发.食用河蟹致组胺中毒死亡1例[J].广东公安科技, 2021, 29(1):64-65.
XU Z T, SUN W K, SHANG Q F.One case died of histamine poisoning caused by eating crab[J].Guangdong Gongan Keji, 2021, 29(1):64-65.
[6] MAHDYA M, WEBSTER N R.Histamine and antihistamines[J].Anaesthesia &Intensive Care Medicine, 2011, 12(7):324-329.
[7] KCD, SUMNER R, LIPPMANN S.Gut microbiota and health[J].Postgraduate Medicine, 2020, 132(3):274.
[8] WANGR D, DENG Y J, ZHANG Y H, et al.Modulation of intestinal barrier, inflammatory response, and gut microbiota by Pediococcus pentosaceuszy-B alleviates Vibrio parahaemolyticusinfection in C57BL/6J mice[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2022, 70(6):1 865-1 877.
[9] JINJ, BEEKMANN K, RINGØ E, et al.Interaction between food-borne mycotoxins and gut microbiota:A review[J].Food Control, 2021, 126:107998.
[10] DUANH, YU L L, TIAN F W, et al.Gut microbiota:A target for heavy metal toxicity and a probiotic protective strategy[J].Science of the Total Environment, 2020, 742:140429.
[11] BALLANR, BATTISTINI C, XAVIER-SANTOS D, et al.Interactions of probiotics and prebiotics with the gut microbiota[J].Progress in Molecular Biology and Translational Science, 2020, 171:265-300.
[12] 邓义佳,王润东, 张宇昊, 等.乌虾酱长期发酵过程中细菌群落演替及对生物胺形成的影响[J].食品科学, 2022,43(24):164-173.
DENG Y J, WANG R D, ZHANG Y H, et al.Bacterial community succession during long-term fermentation of shrimp paste and its effect on formation of biogenic amines[J].Food Science, 2022,43(24):164-173.
[13] ATRAKIR, AZIZKHANI M.Survival of probiotic bacteria nanoencapsulated within biopolymers in a simulated gastrointestinal model[J].Innovative Food Science &Emerging Technologies, 2021, 72:102750.
[14] ZHANGH C, WEI S Y, YAN J, et al.Development of double layer microcapsules for enhancing the viability of Lactobacillus casei LC2W in simulated gastrointestinal fluids[J].LWT, 2021, 145:111319.
[15] FRITTSC A, KERSEY J H, MOTL M A, et al.Bacillus subtilisC-3102 (calsporin) improves live performance and microbiological status of broiler Chickens1[J].Journal of Applied Poultry Research, 2000, 9(2):149-155.
[16] 李倩,杜斌, 施建军, 等.VC对组胺致小鼠的毒性预防及治疗作用[J].食品与生物技术学报, 2011, 30(5):694-699.
LI Q, DU B, SHI J J, et al.Study of the prevention and treatment action of VCon histamine toxicity in mice[J].Journal of Food Science and Biotechnology, 2011, 30(5):694-699.
[17] 成艳波,李薇, 韩木兰, 等.罗伊氏乳杆菌对组胺引起黄颡鱼肝肠损伤修复效果评价[J].水生生物学报, 2019, 43(1):94-101.
CHENG Y B, LI W, HAN M L, et al.The enterohepatic protection of Pelteobagrus fulvidraco adding Lactobacillus reuteri induced by histamine[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2019, 43(1):94-101.
[18] 陈琼,陈朋, 徐旻珺, 等.锌加VC复合配方缓解环磷酰胺诱导的幼龄小鼠免疫抑制[J].食品与发酵工业, 2020, 46(22):118-124.
CHEN Q, CHEN P, XU M J, et al.The zinc and VCcompound formula relieves the cyclophosphamide-induced immunosuppression in immature mice[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(22):118-124.
[19] 王润东,孙力军, 王雅玲, 等.副溶血性弧菌ATCC33847在五种食品中代谢产物的溶血活性及对小鼠脏器的毒性差异[J].现代食品科技, 2016, 32(8):48-53.
WANG R D, SUN L J, WANG Y L, et al.Hemolytic activity of the metabolites produced by Vibrio parahaemolyticusATCC33847 in five food matrices and their toxicity toward mice organs[J].Modern Food Science and Technology, 2016, 32(8):48-53.
[20] WELSSJ, PUNCHAGO N, FELDT J, et al.The distribution of conjunctival goblet cells in mice[J].Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger, 2021, 234:151664.
[21] GARGS, SINGH T P, MALIK R K.In vivoimplications of potential probiotic Lactobacillus reuteriLR6 on the gut and immunological parameters as an adjuvant against protein energy malnutrition[J].Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2020, 12(2):517-534.
[22] LIY, LIU M F, ZUO Z Y, et al.TLR9 regulates the NF-κB-NLRP3-IL-1β pathway negatively in Salmonella-induced NKG2D-mediated intestinal inflammation[J].Journal of Immunology (Baltimore, Md.:1950), 2017, 199(2):761-773.
[23] YINH J, YE P F, LEI Q Z, et al.In vitroprobiotic properties of Pediococcus pentosaceusL1 and its effects on enterotoxigenic Escherichia coli-induced inflammatory responses in porcine intestinal epithelial cells[J].Microbial Pathogenesis, 2020, 144:104163.
[24] KHANH A, IBRAHIM K E, ALRASHOOD S T, et al.Immunohistochemistry of IL-1β, IL-6 and TNF-α in spleens of mice treated with gold nanoparticles[J].Saudi Journal of Biological Sciences, 2020, 27(4):1 163-1 168.
[25] PARKJ S, CHOI J W, JHUN J, et al.Lactobacillus acidophilusimproves intestinal inflammation in an acute colitis mouse model by regulation of Th17 and treg cell balance and fibrosis development[J].Journal of Medicinal Food, 2018, 21(3):215-224.
[26] LIA Y, WANG Y P, LI Z X, et al.Probiotics isolated from yaks improves the growth performance, antioxidant activity, and cytokines related to immunity and inflammation in mice[J].Microbial Cell Factories, 2019, 18(1):112.