苹果酒因独特的风味与丰富的营养,在欧洲尤其是西欧地区深受消费者们的喜爱,被誉为第二大果酒。根据欧洲苹果酒和果酒协会(European Cider and Fruit Wine Association,AICV)的报告[1],2018年西欧国家苹果酒消费量占全球消费总量的52.8%,亚洲国家消费量仅占1.4%。传统的苹果酒通常是以自然发酵酿造,需要数周甚至数月的时间。酿酒酵母属酵母是苹果酒酿造应用最广泛的菌株,具有高糖转化为乙醇的能力,纯种发酵苹果酒因缺乏风味而被一些挑剔的消费者所诟病[2]。近年来越来越多的酿酒师采用非酿酒酵母属酵母进行苹果酒酿造,以获得更健康、口感更丰富的苹果酒。例如,非酿酒酵母属的汉逊酵母(Hanseniaspora)能形成丰富的香气物质乙酸己酯和乙酸异戊酯[3]。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)能将味道尖锐的L-苹果酸转化为乙醇,使葡萄酒变得更顺滑易入口[4]。利用非酿酒酵母属酵母同样可以改善葡萄酒的香气风味。异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomaluse)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)协同发酵可以提高乙酸酯、乙酯、高级醇、醛和酮的种类和含量[5]。因此,非酿酒酵母属与酿酒属酵母混合发酵也会给苹果酒带来不同的风味,可以成为传统苹果酒酿造的一种替代方法。

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是常发现于酸奶制品中的一种非常规酵母,具有耐热性好、生长速度快、发酵碳源广等优点,通过了美国食品药品监督管理局公认为安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)和欧盟的安全资格认证(Qualified Presumption of Safety,QPS)认证。K.marxianus可用于乙醇发酵,同时还被应用于生物酶、木糖醇,以及2-苯乙醇、乙酸乙酯等芳香物质的生产[6]。此外,K.marxianus能够分泌果胶酶,有利于提高果酒的芳香成分。研究表明,Albario葡萄酒发酵过程中添加来源于K.marxianus的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PGase),可以产生更为丰富的柠檬香、香料、辛辣和花香的香气[7]。赤霞珠葡萄酒发酵添加K.marxianus粗酶提取物,多酚含量增加了28%,而添加商业果胶酶,多酚含量仅增加了15%[8]。本研究将对比分析K.marxianus与传统苹果酒酿造的贝氏酵母(Saccharomyces bayanus)在发酵苹果酒的成分、抗氧化活性、风味与感官等方面的差异。

1 材料与方法

1.1 实验材料

K.marxianusFim-1分离自西藏那曲酸奶,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC),保藏号10621。Saccharomyces bayanus SAF,法国乐斯福公司(S.I.Lesaffre)。

富士苹果采收于2020年10月云南大理,可溶性固形物含量约15°Brix,用HR1832飞利浦榨汁机榨汁后发酵。

1.2 试剂与设备

酵母提取物,Oxoid公司;蛋白胨,日本制药株式会社;葡萄糖,国药集团; DPPH、多聚半乳糖醛酸钠、2-氯苯丙氨酸,北京索莱宝科技有限公司;2-苯基- 4,4,5,5 -四甲基咪唑啉-1-氧基3-氧化物(2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-3-oxide-1-oxyl,PTIO),麦克林试剂;色谱及质谱用甲酸、乙腈、甲酸铵、甲醇,美国赛默飞世尔科技。

LB32T便携式折射仪,广州市速为电子科技有限公司;高效液相色谱仪及其色谱柱,HS-SPME-GC-MS色谱仪及其色谱柱,安捷伦科技有限公司;Vanquish超高效液相色谱仪及其色谱柱、Q Exactive HF-X质谱,美国赛默飞世尔科技。

1.3 酵母菌发酵剂制备与苹果酒发酵

K.marxianus接种于50 mL的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)培养基(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖),30 ℃、220 r/min培养24 h,5 000 r/min离心5 min收集酵母细胞,用无菌水洗净、重悬。苹果汁于68 ℃巴氏杀菌30 min,接入初始OD600=0.2的K.marxianus 和S.bayanus,加入0.05 g/L焦亚硫酸钾,静置发酵。当可溶性固形物含量降至9°Brix时,发酵液于5 000 r/min离心5 min收集上清液,后用0.22 μm膜过滤获得苹果酒。苹果酒分装成50 mL/管,-20 ℃冻存用于成分检测,或充入0.15～0.17 MPa CO2(20 ℃),制成气泡苹果酒用于感官分析。

1.4 基本理化指标的测定

可溶性固形物采用便携式折射仪测定。乙醇含量用安捷伦MetaCarb 87H(300 mm×7.8 mm)为分析柱的高效液相色谱1260检测,流动相为2.9 mmol/LH2SO4,流速0.6 mL/min,检测器为示差折光检测器。总可滴定酸含量用0.1 mol/LNaOH滴定,并以苹果酸计。苹果酒色度用分光光度计在波长430 nm测定。Pase活性测定采用0.5%多聚半乳糖醛酸钠为底物,通过DNS方法测定,酶活力定义为每分钟释放1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个单位(U)。

1.5 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(head space-solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分析

取5 mL样品,用固相微萃取(SPME)(50/30 μm DVB/CARonPDMS)50 ℃萃取30 min。以2-辛醇为内标物,在Agilent 7890B-5977B气相色谱仪上用DB-wax色谱柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm)进行测试。连接器温度260 ℃,离子源和四极杆的温度分别为230和150 ℃。以99.999%He作为载气,流速1 mL/min。质谱分析采用了70 eV的电子冲击模式,核质比(m/z)扫描范围为20～400,并用标准谱库NIST 2014数据库鉴定分析化合物。

1.6 抗氧化实验及抗氧化成分分析

用DPPH和PTIO作为自由基清除剂测定抗氧化水平。取1 mL样品与100 μL的10 mmol/L DPPH或PTIO混合,室温下静止孵育30 min,检测吸光度(DPPH检测波长517 nm,PTIO检测波长557 nm)。

采用Vanquish UPLC与Q Exactive HF-X质谱联用测定苹果酒抗氧化成分。UPLC检测采用ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱(2.1 mm×150 mm, 1.8 μm) (Thermo Scientific, USA)。测试样品与4.0 μg/L 2-氯苯丙氨酸-甲醇溶液等体积混合,后用0.22 μm PTFE膜过滤。进样2 μL,阳性模型质谱的UPLC分析采用0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)梯度洗脱,阴性模型用5 mmol/L甲酸铵水溶液(A)和乙腈溶液(B)梯度洗脱,流速均为0.25 mL/min。梯度程序如下:0～1 min,2% B;1～9 min,2%～50% B;9～12 min,50%～98% B;12～13.5 min,98% B;13.5～14 min,98%～2% B;14～20 min,2% B。

正负模式ESI-MS分别在3.5 kV和-2.5 kV的电压下进行,质量扫描范围为m/z81～1 000,采用动态排除过滤MS/MS谱。

1.7 感官分析

募集了20名未经培训的味觉品尝员(包括10名女性和10名男性),对冷藏气泡苹果酒的香味和味道进行了评估。香味标记为花香、果香,甜味、苹果味和酒香,味道分花香、甜味、酸度、果味和酒精味,香味和味道强度分为1～10分,感官分析结果以各分项的平均值表示。

2 结果与分析

2.1 K.marxianus和S.bayanus发酵苹果酒性能比较

在产乙醇酵母中,K.marxianus除了能发酵己糖、戊糖、木糖和阿拉伯糖等,还能分泌菊粉酶、乳糖酶/β-半乳糖苷酶和内聚半乳糖苷酶等天然酶[9]。然而,K.marxianus在苹果酒酿造中的发酵性能目前并不被了解。为此,我们研究了K.marxianus在温度范围为15～45 ℃内发酵苹果汁产生酒精的能力,结果如图1所示。K.marxianus Fim-1菌株在15～40 ℃表现出较高的酒精发酵能力。当发酵温度低于35 ℃,酒精发率随温度升高而升高,20、25、30和35 ℃发酵苹果汁糖度降至9°Brix,分别需要120、96、84和72 h,乙醇产量均在56.8 g/L左右。当发酵温度低于15或高于40 ℃发酵时,K.marxianus Fim-1糖消耗速度和乙醇产量明显下降,发酵120 h乙醇含量分别为39.25和52.34 g/L。

与K.marxianusFim-1相似,S.bayanusSAF适合的苹果酒发酵温度范围也是15～35 ℃(图1)。S.bayanusSAF是从葡萄酒和苹果酒中分离的一种低温酵母,由于它在低温下良好的发酵能力,广泛应用于啤酒和葡萄酒发酵[10]。与之相比,K.marxianusFim-1在15 ℃低温条件下,耗糖速率(图1)和生长速度(图2)均高于S.bayanusSAF,但在15～35 ℃,温度对2种酵母菌株乙醇发酵没有明显影响,乙醇含量仅与糖消耗量有关。温度高于40 ℃,K.marxianusFim-1和S.bayanusSAF的发酵能力均明显下降。BAJPAI等[11]也发现发酵温度超过35 ℃时,K.marxianus乙醇发酵和细胞生物量都急剧下降。

2.2 K.marxianus和S.bayanus发酵苹果酒的基本理化性质

用于理化分析的K.marxianus和S.bayanus发酵苹果酒是在25 ℃发酵至可溶性固形物含量9.0°Brix时终止。苹果酒的残糖、乙醇、总酸等含量如表1所示。K.marxianusFim-1苹果酒的乙醇质量浓度为40.1 g/L,略低于S.bayanusSAF苹果酒41.0 g/L。2种酵母发酵后总酸均有所提高,其中K.marxianusFim-1苹果酒总酸含量为3.63 g/L,比苹果汁高47.6%。S.bayanus SAF苹果酒总酸含量为3.42 g/L,略低于K.marxianusFim-1苹果酒。总酸与酸味的感知密切相关,K.marxianusFim-1的产酸能力有助于提高总酸的含量,改善苹果酒的感官品质。

在果酒酿酒过程中添加果胶酶可以提高出汁率和酒产出率,改善酒的风味和品质。BELDA等[12]从自发酵酒中分离了462株酵母菌,发现只有出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans), 美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)和美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)有PGase活性。K.marxianus Fim-1能够高分泌内源性的PGase,酶活力达到4.26 U/mL,约为S.bayanus SAF的6倍。大多数酿酒酵母的基因组中都存在pgu1基因,但只有少数菌株表达果胶酶活性[13],这也是以酿酒酵母作为发酵剂时通常需要额外添加果胶酶的原因。K.marxianusFim-1天然产PGase,以及高乙醇发酵能力,在苹果酒酿造中具有明显的优势。

2.3 苹果酒中的挥发性成分

采用HS-SPME-GC-MS测定了苹果汁和苹果酒的挥发性成分。苹果汁中检测到了57种挥发成分,包括13种醇和酚、4种醛和酮、4种挥发性酸、4种乙醇酯、4种乙酸酯、11种其他酯和11种烷烃、烯烃等其他类挥发性化合物(表1)。苹果汁中有33种挥发成分,包括3种醛、5种醇和酚类、15种酯和10种其他类挥发成分(如庚烷、2,2,4,6,6-五甲基-十二烷、癸烷等),但在K.marxianusFim-1和S.bayanus SAF发酵的苹果酒中均没有检测到(表2),2种酵母发酵后产生的39种挥发成分主要是一些醇类和酯类。

依据HS-SPME-GC-MS检测结果,苹果汁的特征性挥发物有2-己烯醛、1-己醇、乙酸-2-甲基-1-丁醇酯、己醛、2-甲基-1-丁醇和1-丁醇。这一结果与韩国、中国和巴西的富士苹果成分分析一致[14-16]。其中,1-己醇和(E)2-己烯醛的含量最高,2-己烯醛是苹果风味的重要贡献者,而1-己醇对苹果香气起负面作用,抑制了苹果风味[17]。植物中C6-不饱和醛、(E)-2-己醛和己醛是通过亚麻酸LOX/HPL途径合成[18]。苹果成熟过程中乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)能催化产生苹果风味化合物2-己烯醛及其还原产物2-己烯-1-醇(E)[19],这些成分在K.marxianusFim-1和S.bayanusSAF苹果酒中都未检测到,可能是它们在ADH作用下分别被还原成己醇、2-己醇-1-醇和1-辛醇[19]。此外,(E)-2-己烯醛在葡萄酒发酵时可以作为硫醇前体合成3-巯基己-1-醇(3-mercapto-1-hexanol,3MH)和3-巯基乙酸酯(3-mercaptohexylacetate,3MHA)[20],但在K.marxianusFim-1和S.bayanusSAF苹果酒中均未检测到3MH和3MHA的存在,表明2种酵母可能通过ADH还原己烯醛替代硫醇反应。

高级醇是发酵酒酯类重要前体,对酒的品质和风味有着重要的影响。相比之下,S.bayanusSAF比K.marxianus Fim-1多产生了2-乙基-1-己醇、2-甲基-1-丁醇、香茅醇和芳樟醇等4种醇,但没有丁香酚。具有玫瑰花香气的重要芳香醇苯乙醇的含量在K.marxianus Fim-1苹果酒和S.bayanus SAF苹果酒中分别增加了200倍和400倍[6]。

苹果汁中含有丁酸、2-甲基、辛酸、己酸和乙酸等4种挥发性酸。在K.marxianusFim-1和S.bayanusSAF苹果酒中,挥发性酸主要是正癸酸、戊酸和丙酸。S.bayanusSAF苹果酒还检测到2-甲基丁酸,但从含量上看,辛酸是2种苹果酒中最主要的挥发性酸。

酯类是苹果酒中最为主要的挥发性物质,K.marxianusFim-1和S.bayanusSAF苹果酒分别有38种和37种酯类。这些酯类大多是在发酵过程由醇类物质酯化而成。在香味成分上,乙酸-3-甲基-1-丁酯、辛酸乙酯和己酸乙酯含量最高,具有果味、甜味、花香和香蕉味,并且苹果汁中并没有检测到,说明它们是酵母发酵的产物。相比之下,K.marxianusFim-1苹果酒中这些优势酯类的含量明显高于S.bayanusSAF苹果酒,说明K.marxianusFim-1在酿酒过程中能够产生更多的酯类,丰富了苹果酒的酯香。

2.4 多酚含量及抗氧化活性

多酚具有苦味和涩味,是直接影响苹果酒质量和感官的重要化合物,也是主要抗氧化物。根据其化学结构的多样性,多酚类物质可分为黄烷醇、羟基肉桂酸、二氢查耳酮、黄酮醇和花青素,也可以分为类黄酮和非类黄酮等六类[21]。本研究采用DPPH自由基和PTIO自由基测定了苹果酒的抗氧化活性。如图3所示,在DPPH自由基清除率上,K.marxianusFim-1苹果酒的抗氧化活性高于苹果汁,但低于S.bayanusSAF苹果酒。而对于PTIO自由基清除率,K.marxianus Fim-1苹果酒明显高于S.bayanus SAF苹果酒和苹果汁。DPPH自由基和PTIO自由基清除率结果不一致性可能是由于2种自由基的偏好性不同导致,其中PTIO自由基更适合测定多酚的抗氧化活性[22],由此说明K.marxianusFim-1苹果酒多酚含量可能高于S.bayanus SAF苹果酒。

进一步,使用UPLC-MS检测了苹果酒和苹果汁中的抗氧化成分,在苹果酒中发现了41种抗氧化成分,包括14种黄酮、3种查尔酮、2种花青色素类、5种香豆素类、6种肉桂酸类和其他11种抗氧化成分(表3)。K.marxianusFim-1苹果酒中多酚类成分含量最高的是槲皮素-3-O-葡萄糖苷,占总多酚的21.9%,此外还含有丰富的儿茶酚。与PTIO自由基清除率结果一致,K.marxianusFim-1苹果酒中的总多酚含量比S.bayanusSAF苹果酒提高了17.5%。然而,UPLC-MS结果表明苹果汁的多酚含量高于苹果酒,但自由基清除实验结果表明其抗氧化活性较低,这可能是苹果压榨过程发生了氧化,在多酚氧化酶的催化下多酚氧化成有颜色的o-醌[23]。在酵母发酵过程中,糖酵解厌氧代谢产生的高还原力,还原部分o-醌成多酚,提升了苹果酒的抗氧化活性。

2.5 感官分析

如图4所示,20名未经训练的品尝员对苹果酒感官评价显示2种苹果酒的香味除了苹果香外几乎相同,但K.marxianus Fim-1苹果酒香味得分较高。风味评价上K.marxianus Fim-1和S.bayanus SAF苹果酒的风味评价得分为35.6分和32.1分。由于2种苹果酒的可溶性固形物含量基本一致,因而它们的甜味评价得分几乎一致。品尝员对K.marxianusFim-1苹果酒的酸度、苹果味、果味和酒味给了更高的得分,相比之下S.bayanus SAF苹果酒这些风味得分较低,表明K.marxianus Fim-1苹果酒口感更为丰富。

3 结论与讨论

本研究从乙醇发酵、挥发性成分和抗氧化多酚产量以及苹果酒感官方面的评价了K.marxianusFim-1发酵苹果酒的特征。与传统酿酒酵母S.bayanusSAF相比,K.marxianusFim-1在较宽的温度范围内均表现出更高的酒精发酵速率。以富士苹果为原料,添加K.marxianusFim-1酿制的苹果酒总酸含量提高了47.6%。由于我国苹果的品种以鲜食甜苹果为主,酸和单宁含量较低,通常<0.45%和<0.2%,K.marxianus的高产酸能力可增强甜苹果的酸味,丰富口感。

K.marxianus是一种耐高温酵母,最高耐受温度可达52 ℃以上。然而,在苹果酒发酵过程中,当发酵温度高于45 ℃时,K.marxianus的生长和乙醇发酵都受到抑制。通常情况下,高温会诱导酵母细胞积累产生更多活性氧和乙酸,一旦这些抑制剂逐渐积累到足以抑制酒精发酵,发酵就会停止[24]。但是,苹果酒发酵是在限制氧条件下进行,这可能有助于提高它们的生存能力和耐热性[25]。因此,我们推测K.marxianus在45 ℃下发酵不能进行可能与苹果汁低pH值有关。

此外,K.marxianusFim-1在苹果酒发酵过程能分泌PGase,这可能有利于工业上的发酵后处理。与S.bayanus SAF相比,K.marxianus发酵苹果酒酯类含量更丰富,而且多酚总量高出17.5%,其中黄芩素、儿茶酚、咖啡酸都有显著提高,分别提高3.2、7.7和1.3倍。PTIO的抗氧化水平也同样表明K.marxianus发酵更有利于保留苹果汁中多酚。综上所述,K.marxianusFim-1是一种苹果酒酿造的优良酵母,可用于生产高品质的苹果酒。

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Chemical composition and antioxidant activities of apple cider fermented with non-Saccharomycesyeast Kluyveromyces marxianus

LAN Qing1, 2, ZHANG Zhiyong1, 2, YU Yao1, 2, ZHOU Jungang1, 2*, LYU Hong1, 2

1(State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China) 2(Shanghai Engineering Research Center of Industrial Microorganisms, Fudan University, Shanghai 200438, China)

ABSTRACT Non-Saccharomycesyeasts recently become promising winemakers due to the abilities to bring more varieties flavors. Kluyveromyces marxianusis a GRAS non-Saccharomycesyeast that had been used for productions of enzymes, xylitol, and aroma compounds. Using the Saccharomyces bayanusas a comparison, the ability of K. marxianusin cidermaking was evaluated and the chemical compositions and antioxidant activities of cider were analyzed. Alcoholic fermentation withK. marxianuscould be accomplished before 96 hover the temperatures ranging from 25 to 35 ℃, with approximately 56.8 g/L ethanol yield. Head space-solid phase micro exaction-gas chromatography-mass spectrometry revealed that K. marxianusproduced more contents of esters than S. bayanusduring cidermaking, such as 1-butanol-3-methyl-acetate, octanoic acid ethyl ester, and hexanoic acid ethyl ester. Liquid chromatography-mass spectrometry analyses identified 41 antioxidant components in both ciders, and the total polyphenols in theK. marxianus Fim-1 cider were 17.5% higher than that of the S. bayanuscider.

Key words Kluyveromyces marxianus; cider; volatile components; antioxygenation

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032634

引用格式：兰青,张志勇,余垚,等.马克斯克鲁维酵母发酵苹果酒的化学成分与抗氧化活性[J].食品与发酵工业,2023,49(7):80-89.LAN Qing, ZHANG Zhiyong, YU Yao, et al.Chemical composition and antioxidant activities of apple cider fermented with non-Saccharomycesyeast Kluyveromyces marxianus[J].Food and Fermentation Industries,2023,49(7):80-89.

第一作者：博士研究生(周峻岗高级工程师为通信作者,E-mail: zhoujg@fudan.edu.cn)

基金项目：上海市“科技创新行动计划”项目(21015800400,19395800600)

收稿日期：2022-06-10,改回日期:2022-06-22