缬氨酸是一种支链氨基酸(branch chain amino acid,BCAAs),在哺乳动物生长和代谢中发挥着重要作用[1]。在工业生产上,L-缬氨酸广泛应用于化妆品,制药,食品添加剂,动物饲料等领域[2]。尤其在动物饲料行业,L-缬氨酸被证明可以显著改善母猪和母鸡的生产性能,同时作为一种必需氨基酸,L-缬氨酸也是低粗蛋白日粮中最具限制性的4种氨基酸之一[2-3]。随着市场需求的不断扩增,进一步提高缬氨酸产量显得尤为重要。L-缬氨酸主要由微生物发酵生产,常用的生产菌株为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等,其中谷氨酸棒杆菌具有氨基酸产率高、稳定性好、生物安全等特性,是L-缬氨酸生产的主要菌株[4]。在谷氨酸棒杆菌中L-缬氨酸的合成路径较为明确,丙酮酸是L-缬氨酸合成的重要前体,丙酮酸在乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶的催化下生成L-缬氨酸,其中AHAS催化的反应是L-缬氨酸生物合成途径最具限制性的步骤之一[5-6]。目前,诱变育种是工业L-缬氨酸生产菌株的主要来源,但依靠传统诱变策略提高L-缬氨酸产量显然已经不能满足生产需要[7]。针对于L-缬氨酸合成途径使用不同强度的启动子调节关键基因的表达,采用酶工程策略改造关键酶的催化结构域和调节结构域,增强L-缬氨酸转运蛋白运输效率以及基于转录因子的生物传感器筛选高产菌株等多系统代谢工程策略已用于提高谷氨酸棒杆菌中L-缬氨酸的生产[8-11]。
菌株谷氨酸棒杆菌VHL-1为实验室诱变选育的一株L-缬氨酸生产菌株。在本研究中,使用菌株VHL-1作为底盘菌株,为进一步提高L-缬氨酸产量,对L-缬氨酸合成路径进行代谢改造(图1)。首先,为提高丙酮酸前体的利用率,敲除ldh、poxB以及pyc基因并通过插入T7终止子下调alaT基因的表达水平。其次,通过Ptuf启动子替换ilvBNC操纵子天然启动子以及增加ilvBN基因拷贝数强化L-缬氨酸的合成路径。最后,通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因brnFE和调控蛋白编码基因lrp增强L-缬氨酸胞外输出效率得到一株最佳L-缬氨酸生产菌株VHL-9。
LDH-乳酸脱氢酶; PC-丙酮酸羧化酶; POXB-丙酮酸氧化酶;AHAS-乙酰羟酸合酶; AHAIR-乙酰羟酸还原异构酶;DHAD-二羟酸脱水酶;BrnFE-支链氨基酸转运蛋白;AT-丙氨酸氨基转移酶
图1 L-缬氨酸在谷氨酸棒杆菌中的生物合成途径
Fig.1 L-valine biosynthesis pathway in Corynebacterium glutamicum
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒和引物
本研究使用的所有菌株、质粒及其相关特性见表1,引物信息见附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20221009.1613.012.html)。
表1 本研究所用质粒和菌株
Table 1 Plasmids and strains used in this study
菌株和质粒相关特征来源菌株大肠杆菌JM109recA1 end1 gyrA96 thi hsdR17 supE44 relA1 Δ(lac-proAB)/F'(traD36 proAB+lacq lacZ ΔM15)实验室保藏谷氨酸棒杆菌野生型wild type ATCC 13032实验室保藏VHL-1L-valine producing Corynebacterium glutamicum strain created by random mutagenesis实验室保藏VHL-2VHL-1ΔpoxBΔldhT7alaT本研究VHL-3VHL-2Δpyc本研究VHL-4VHL-3 /pEC-XK99E-malE本研究VHL-5VHL-3ΔPilvBNC∶∶Ptuf本研究VHL-6VHL-5ΔpoxB∶∶ilvBN本研究VHL-7VHL-6ΔbrnQ本研究VHL-8VHL-9VHL-6/ pEC-XK99EVHL-6/ pEC-XK99E-lrp-brnFE本研究质粒pEC-XK99EKanr, Expression vector with pMB1 replicon实验室保藏pk 18mobsacBKanr, Integration vector实验室保藏pK 18mobsacB-ΔldhKanr, pK 18mobsacB derivative for in-frame deletion of gene ldh本研究pK 18mobsacB-T7-alaTKanr , pK 18mobsacB derivative containing the fragment of insertion T7 terminator in front of alaT[12]pK 18mobsacB-ΔpoxBKanr, pK 18mobsacB derivative for in-frame deletion of gene poxB本研究pK 18mobsacB-ΔpycKanr, pK 18mobsacB derivative for in-frame deletion of gene pyc本研究pK 18mobsacB-ΔbrnQpK 18mobsacB- Ptuf-ilvBNCKanr, pK 18mobsacB derivative for in-frame deletion of gene brnQKanr, pK 18mobsacB derivative containing ilvBNC gene under control of the Ptufpromoter 本研究Pk 18mobsacB-ΔpoxB∶∶ilvBNKanr, pK 18mobsacB derivative for in-frame deletion of gene poxB for insertion with the whole ilvBN gene ilvBN under control of the Ptufpromoter本研究pEC-XK99E-malEKanr, pEC-XK99E derivative containing the gene malE本研究pEC-XK99E-lrp-brnFEKanr, pEC-XK99E derivative containing the gene lrp and brnFE本研究
附表1 本研究所用使用的引物
Table S1 primers used in this study
引物名称序列 (5'-3')限制性内切酶ldhU-FggaattctgagtcatcttggcagagcEcoR IldhU-RtccaccagctggaggcldhD-FgcctccagctggtggaatcatcggcgaacacgldhD-RcccaagcttcactctaaattccatccaacagtHind IIIpoxBU-FggaattcgtaactgtaacgaatggtcgEcoR IpoxBU-RccacgatcggattaaggcpoxBD-FgccttaatccgatcgtggtgcaatgtgtggcatgcpoxBD-RcccaagcttccttatgttcgaacgggcHind IIIpycU-FgctctagagtgtcgactcacacatctXbal IpycU-RgccaaggatctgcacttpycD-FaagtgcagatccttggcacgacatcccagactctpycD-RcccaagcttttaggaaacgacgacgatcaHindIIIbrnQU-FggaattcatgagtaaaaagtctgtcctgEcoRIbrnQU-RacgcactacttggctcbrnQD-FgagccaagtagtgcgtcggtgagttcgctgatbrnQD-RcccaagcttcaaagactcctcgcaatHind IIIPtuf-ilvBNCU-FggaattccacgcgaccagttattagaEcoR IPtuf-ilvBNCU-RatgattttaggcgtacccatPtuf-FatgggtacgcctaaaatcatagatcgtttagatccgaaggaPtuf-RtgtatgtcctcctggacttPtuf-ilvBNCD-FaagtccaggaggacatacagtgaatgtggcagcttctPtuf-ilvBNCD-RcccaagcttcgaccagtaatcgcgagHind IIIPtuf1-FagatcgtttagatccgaaggpoxB -Ptuf-RccttcggatctaaacgatctccacgatcggattaaggT1T2-FgctccggccaagatctaatgcgagagtagggaactPoxB-ilvBN-RttagatcttggccggagcT1T2-RcatgagcggatacatatttgaPoxB-T1T2-FtcaaatatgtatccgctcatgtgcaatgtgtggcatgcmalE-FggaattcatgaccatcgacctgcaEcoR ImalE-RgctctagattaagcgttttgcgcttcgXbal Ilrp-FggaattccacctcaactaggctattgtEcoR Ilrp-RgatcagtccttcactagatgbrnFE-FcatctagtgaaggactgatccgcaaactggcaacaaabrnFE-RgctctagattcaaattgagggcatgcXba I
注:“—”代表酶切位点
1.2 培养基、试剂和仪器
LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,pH 7.0;LBG培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,葡萄糖5,pH 7.0;EPO和LB-Brain Heart Infusion-Sorbitol(LBHIS)培养基按照参考文献[13]的方法制备;TB培养基(g/L):胰蛋白胨12,酵母提取物20,KH2PO4 2.31,K2HPO4 13.42,甘油4 mL,pH 7.0;种子培养基(g/L):葡萄糖 20,(NH4)2SO4 3,K2HPO4 0.8,MgSO4 0.4,维生素B1 350 μg/L,玉米浆 3.5,CaCO3 15,pH 7.0;发酵培养基(g/L):葡萄糖 150,(NH4)2SO4 30,KHP2O4 1.5,MgSO4·7H2O 0.7,FeSO4·7H2O 0.04,玉米浆7,CaCO3 35,pH 8.0。
基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、T4连接酶、高保真Taq酶、限制性核酸内切酶,诺唯赞生物科技(南京)股份公司;PCR引物,亦欣生物科技(上海)有限公司;其他试剂均为国产或进口试剂。
高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司;SBA-40E固定化酶生物传感器,山东省科学院生物研究所;UV-1800分光光度计,日本岛津公司。
1.3 质粒的构建
1.3.1 敲除质粒的构建
pK 18mobsacB通过两步同源重组用于所有基因序列的敲除和整合。以谷氨酸棒杆菌VHL-1的基因组作为模板以相应的引物对扩增出ldh基因上下游500 bp左右片段。通过重叠延伸PCR将ldh 基因的上游同源部分和下游同源部分连接起来。使用EcoR Ⅰ 和Hind Ⅲ双酶切pK 18 mobsacB质粒和目的片段,胶回收目的片段和质粒片段,使用T4接酶将经过相同酶切处理的质粒片段与目的片段连接起来,构建出pK 18mobsacB-Δldh质粒。以野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板以Ptuf-F和Ptuf-R引物对PCR得到Ptuf启动子。将Ptuf启动子与ilvBNC基因启动子上下游500 bp左右同源序列通过重叠延伸PCR连接起来,使用EcoR I和Sal I酶切pK 18mobsacB质粒和片段。然后通过T4连接酶进行连接构建pK 18mobsacB-Ptuf-ilvBNC质粒。pK 18mobsacB-ΔpoxB、pK 18mobsacB-Δpyc、pK 18mobsacB-ΔbrnQ、pk 18mobsacB-ΔpoxB∶∶ilvBN质粒的构建同上,所有质粒构建好后均通过酶切验证构建成功。
1.3.2 过表达质粒的构建
以谷氨酸棒杆菌VHL-1的基因组作为模板,以malE-F和malE-R引物对扩增得到malE基因片段,使用EcoR I和Xbal I酶切malE片段和pEC.XK99E质粒。随后用T4连接酶将经过相同酶切处理的pEC.XK99E质粒与目的片段连接起来构建pEC.XK99E-malE过表达质粒。pEC.XK99E-lrp-brnFE质粒的构建过程同上。
1.4 发酵方法
1.4.1 摇瓶发酵
使用接种环将保藏在甘油管中的菌株接种至固体培养基平面上进行活化,将活化好的菌种接种到10 mL LBG液体培养基30 ℃,100 r/min培养12 h,取3 mL活化好的菌液加入装有60 mL种子培养基的250 mL三角瓶中30 ℃,100 r/min培养15～18 h扩大培养至OD562值为7.8,pH 6.0左右。以5%接种量将扩培好的种子液接种至50 mL发酵培养基中30 ℃,100 r/min培养72 h。当菌株含有过表达质粒时,向培养基中加入50 μg/mL卡那霉素,并在检测发酵培养基OD562值到达0.9时添加0.5 mmol/L IPTG诱导质粒表达。
1.4.2 5 L发酵罐发酵
发酵罐的装液量为3 L,将活化好的种子液以10%的接种量接种至发酵罐中,通过流加氨水维持pH保持在7.2～7.5左右,通过控制转速和通风量使发酵罐中的溶氧保持在30%以上,通过流加700 g/L葡萄糖溶液使残糖质量浓度保持在10 g/L左右。每隔4 h取1次样,发酵时间为72 h。
1.5 检测方法
在发酵过程中,发酵液中的残糖浓度通过SBA-40E固定化酶生物传感器进行测定;取1 mL菌液用0.3 moL/L稀盐酸稀释26倍后使用分光光度计测量菌液OD562值。L-缬氨酸的含量通过HPLC进行分析,具体检测方法参考文献[14]。
2 结果与分析
2.1 提高丙酮酸前体物利用率
前体物质的补充是提高目标产物强有力的策略之一。丙酮酸是L-缬氨酸合成的重要前体,同时也是菌体碳代谢的关键节点,对丙酮酸碳通量进行再分配有利于L-缬氨酸的合成。丙酮酸节点包括一系列代谢途径,其中乳酸合成途径、醋酸合成途径以及L-丙氨酸合成途径是谷氨酸棒杆菌有氧发酵的冗余途径,对上述代谢途径中的基因进行修饰不仅有利于丙酮酸的富集也可以减少L-缬氨酸合成过程中副产物的生成[6, 15]。在菌株VHL-1中依次敲除编码丙酮酸氧化酶编码基因poxB、乳酸脱氢酶编码基因ldh并使用T7终止子弱化丙氨酸转氨酶编码基因alaT构建重组菌株VHL-2来研究上述基因缺失和修饰对于L-缬氨酸合成以及副产物生成的影响。如图2-a和图2-b所示,重组菌株VHL-2产生(30.5±2.5) g/L的L-缬氨酸,比原始菌株L-缬氨酸产量高3.9%,而在耗糖速率和菌体生长并没有明显变化。如图2-c所示,菌株VHL-1有氧发酵过程中最主要的副产物为L-丙氨酸[(3.24±0.28) g/L],其次为L-异亮氨酸[(1.43±0.27) g/L]和乳酸[(1.14±0.21) g/L],上述基因的敲除使L-丙氨酸[(2.72±0.21) g/L]和乳酸[(0.42±0.11) g/L]生成量有所下降,但造成了L-异亮氨酸生成量[(1.9±0.32) g/L]的增多。这说明丙酮酸节点处副产物合成路径相关基因的敲除使得更多丙酮酸前体流向了支链氨基酸的合成。有研究对L-缬氨酸高产菌株进行转录组学分析表明poxB基因和ldh基因以及alaT基因表达水平的下调可能对于L-缬氨酸合成具有正效作用,我们的研究结果与其一致[16]。随后我们又测试了敲除pyc基因以及过表达malE基因对于L-缬氨酸合成的影响。在谷氨酸棒杆菌中,pyc基因编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化丙酮酸生成草酰乙酸,malE基因编码苹果酸酶催化苹果酸生成丙酮酸并产生NADPH[17]。在重组菌株VHL-2中敲除pyc基因构建重组菌株VHL-3,L-缬氨酸产量为(32.1±3.1) g/L,相较于重组菌株VHL-2 L-缬氨酸产量提高了5.2%,同时生长有所下调。pyc基因的缺失似乎对于丙酮酸的富集做出了较大的贡献,重组菌株VHL-3 L-缬氨酸产量的显著提升说明阻断草酰乙酸回补路径使更多的丙酮酸流向了L-缬氨酸的合成路径。而在重组菌株VHL-3中进一步过表达malE基因构建的重组菌株VHL-4并没有显示出L-缬氨酸产量的进一步提高。这可能是因为malE基因编码的苹果酸酶是可逆催化酶,在富集丙酮酸过程中并不发挥作用。
a-菌株VHL-1、VHL-2、VHL-3和VHL-4生长情况和葡萄糖消耗比对;b-菌株VHL-1、VHL-2、VHL-3和VHL-4L-缬氨酸产量对比;c-菌株VHL-1、VHL-2副产物生成量比对
图2 菌株VHL-1、VHL-2、VHL-3和VHL-4摇瓶发酵结果
Fig.2 The fermentation results of strain VHL-1, VHL-2, VHL-3, and VHL-4
2.2 强化L-缬氨酸合成路径
ilvBN基因编码的AHAS是L-缬氨酸合成过程中的关键酶,ilvBNC操纵子在L-缬氨酸合成过程中具有重要作用。据文献报道ilvBNC操纵子的过度表达可以显著提高L-缬氨酸的产量[18]。因此我们使用强启动子Ptuf替换重组菌株VHL-3 ilvBNC原始启动子构建重组菌株VHL-5,并在重组菌株VHL-5中增加ilvBN基因的拷贝数进一步增加ilvBN基因的表达。强启动子Ptuf和ilvBN基因以及终止子构建成一个表达框插入重组菌株VHL-5 PoxB基因缺失处构建重组菌株VHL-6[19]。将构建好的重组菌株进行摇瓶发酵实验,如图3所示,重组菌株VHL-5 L-缬氨酸产量为(34.4±1.32) g/L,相较于重组菌株VHL-3 L-缬氨酸产量提高了7.1%,耗糖速率有所提高。进一步增加ilvBN基因拷贝数构建的重组菌株VHL-6 L-缬氨酸产量为(35.2±3.24) g/L相较于重组菌株VHL-5也略有提升。这说明ilvBNC基因的增强表达提高了糖摄取效率以及胞内AHAS和乙酰羟酸异构还原酶的浓度,促进更多的丙酮酸流向L-缬氨酸的合成。
a-菌株VHL-3、VHL-5和VHL-6生长情况和葡萄糖消耗比对;b-菌株VHL-3、VHL-5和VHL-6 L-缬氨酸产量对比
图3 菌株VHL-3、VHL-5和VHL-6摇瓶发酵结果
Fig.3 The fermentation results of strain VHL-3, VHL-5, and VHL-6
2.3 增强L-缬氨酸胞外运输效率
L-缬氨酸过度的胞内积累不利于L-缬氨酸生产,L-缬氨酸的外排已被证明是降低细胞内L-缬氨酸水平和缓解由L-缬氨酸累积引起的反馈抑制的有效方法[20]。brnQ基因编码转运蛋白(BrnQ)可以运输胞外的支链氨基酸进入胞内,为了减少L-缬氨酸向胞内的运输,在重组菌株VHL-6中敲除brnQ基因构建重组菌株VHL-7。对重组菌株VHL-7进行摇瓶发酵培养,L-缬氨酸产量为(34.2±2.43) g/L,菌体生长有所下调。有文献报道,BrnQ蛋白主要负责L-异亮氨酸的胞内输送,这可能是brnQ基因敲除对L-缬氨酸合成几乎无影响的原因。brnFE基因编码支链氨基酸胞外转运蛋白,同时也负责L-甲硫氨酸的胞外转运。有研究表明,lrp基因编码的Lrp因子可以调控brnFE基因的表达。同时过表达lrp基因和brnFE基因有利于L-缬氨酸生产[21]。因此我们在重组菌株VHL-6中电转入pEC.XK99E、pEC.XK99E-lrp-brnFE构建重组菌株VHL-8、VHL-9。对重组菌株进行摇瓶发酵如图4所示,L-缬氨酸产量分别为(34.8±2.74)、(36.7±3.48) g/L。结果表明,共表达lrp基因和brnFE基因可以提高L-缬氨酸胞外运输效率,减少L-缬氨酸胞内累积从而促进L-缬氨酸生产,但值得注意的是,VHL-9的OD562值(29.54±4.16)相较于VHL-8(32.28±3.76)下降了8.5%,共表达lrp和brnFE基因在提高L-缬氨酸合成的同时似乎也给菌体生长带来了一定的负担。
a-菌株VHL-7、VHL-8和VHL-9生长情况和葡萄糖消耗比对;b-菌株VHL-7、VHL-8和VHL-9 L-缬氨酸产量对比
图4 菌株VHL-7、VHL-8和VHL-9摇瓶发酵结果
Fig.4 The fermentation results of strain VHL-7, VHL-8, and VHL-9
2.4 5 L发酵罐补料分批发酵
根据上述研究结果,重组菌株VHL-6和VHL-9均具有较好的L-缬氨酸生产性能。在摇瓶发酵过程中,重组菌株VHL-9具有最佳的L-缬氨酸生产能力,但相较于VHL-6的OD562值有所降低。菌体生物量的降低可能会影响发酵过程中产物的生产稳定性,因此选取菌株VHL-6和VHL-9进行5 L发酵罐放大发酵实验进行生产性能的进一步验证。对重组菌株VHL-6和VHL-9进行5 L发酵罐补料分批发酵实验,并以出发菌株VHL-1作为对照,发酵结果如图5所示。在补料分批发酵过程中,菌株VHL-9 L-缬氨酸产量为(82.5±5.6) g/L,相较于原始菌株VHL-1(67.7±4.2) g/L提高了21.1%,重组菌株VHL-6 L-缬氨酸产量为(78.6±3.4) g/L,相较于原始菌株VHL-1(67.7±4.2) g/L提高了16.1%。从实验结果来看,菌株VHL-9在摇瓶发酵和5 L发酵罐放大发酵中均表现出最佳的L-缬氨酸生产能力且生产性能较为稳定,除此以外,重组菌株VHL-9糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖,相较于出发菌株VHL-1(0.291 g/g葡萄糖)提高了1.1%。虽然重组菌株VHL-9 OD562(42.3±2.42)相较于出发菌株VHL-1(49.7±5.21)具有一定程度的下降,但是在糖酸转化率和缬氨酸产量上均有提升,因此推测用于菌体生长的部分碳通量可能用于L-缬氨酸合成。
a-菌株VHL-1 5 L发酵罐补料分批培养结果;b-菌株VHL-6 5 L发酵罐补料分批培养结果;c-菌株VHL-9 5 L发酵罐补料分批培养结果
图5 菌株VHL-1、VHL-6、VHL-9 5 L发酵罐补料分批培养结果
Fig.5 The fermentation results of fed-batch culture of strain VHL-1, VHL-6, and VHL-9
3 结论与讨论
在本研究中,通过敲除ldh、poxB、pyc基因以及弱化alaT基因表达和过表达malE基因来实现丙酮酸前体的累积,发现ldh、poxB、pyc基因的缺失以及弱化alaT基因表达可以增加丙酮酸向L-缬氨酸合成的碳通量,但是malE基因的过表达对于L-缬氨酸生产并无影响。为了强化L-缬氨酸合成路径,本文发现强启动子Ptuf替换ilvBNC操纵子天然启动子以及增加ilvBN基因的拷贝数可以较为显著提高L-缬氨酸的产量。后续对L-缬氨酸的输出系统进行了改造,发现brnQ基因的缺失对于L-缬氨酸合成影响不大,但是共表达lrp和brnFE基因可以提高L-缬氨酸胞外输出效率,减少L-缬氨酸胞内积累引起的抑制作用从而提高L-缬氨酸的产量。最终对出发菌株VHL-1进行多步代谢改造得到了一株具有最佳L-缬氨酸生产性能的重组菌株VHL-9,对VHL-9进行5 L发酵罐分批发酵,发酵72 h后L-缬氨酸产量可达到(82.5±5.6) g/L,生产强度为1.15 g/(L·h),糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖。虽然通过多步改造显著提高了出发菌株VHL-1 L-缬氨酸生产性能但对菌体生长产生了一些影响,同时菌体中质粒的存在也会造成生产成本的增加。后续可以通过构建无抗质粒来减少生产成本以及使用适应性进化、核糖体开关等技术来平衡菌体生长和L-缬氨酸生产之间的关系,进一步提高菌体L-缬氨酸产酸水平和生产稳定性[22-23]。
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