粮食安全是“国之大者”,而发展木本粮油产业是缓解我国粮油供需矛盾、维护国家粮油安全的必然选择[1]。板栗(Castanea mollissima Blume),属被子植物门,双子叶植物纲,壳斗科栗属多年生落叶植物,包括6个属和大约1 000个种[2],在亚洲、美洲、非洲以及欧洲广泛分布[3]。根据粮农组织统计,我国板栗种植面积和产量均居世界首位[4],素有“木本粮食”之美称[5]。望谟板栗因其果实大,富含优质碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质等多种营养物质,而获国家地理标识产品认证[6]。同时,望谟板栗作为贵州省望谟县“一县一业”的主导产业,每年为20 000户栗农带来1.5亿元经济收入,是巩固拓展脱贫攻坚和助力乡村振兴的支柱产业。
我国板栗每年因贮藏不当而造成的损失达年总产量的50%,经济损失上亿元[7]。目前,板栗贮藏方法有可食用涂膜贮藏[8]、辐照贮藏[9]、臭氧贮藏[10]和冷藏等,其中冷藏是保鲜效果较为理想的方法之一[11]。然而,板栗果质特殊,收获后的栗果水分含量高、代谢快,在冷藏过程中极易受到致腐微生物的侵染[12]。致腐真菌侵染是导致板栗腐烂的重要原因之一[13],细菌导致板栗腐烂的报道较少,如研究发现泡囊假单胞杆菌能够导致板栗腐烂[14],其生物学特性与腐烂病害的发生和流行规律有着密切联系[15]。腐烂后的板栗常伴有苦味和霉酸味,后期逐渐干枯甚至形成空洞,导致其品质劣变、风味损失,从而失去食用价值[16]。这不仅浪费板栗资源,还会对人体健康造成一定危害,严重制约着我国板栗行业的发展[17]。
目前从腐烂板栗中分离获得的致腐真菌包括镰孢菌属、青霉菌属、链格孢属、毛霉属、聚端孢属和壳梭孢属等[18]。梁丽松等[19]在8个主要板栗产区的6个产区板栗中都分离出了镰孢菌属的致腐菌,说明镰孢菌属引起板栗腐烂的现象是普遍存在的;王海霞等[20]以北京怀柔的腐烂板栗为原料,从11个属真菌中确立链格孢属、镰刀菌属、聚端孢属和壳梭孢属为优势致腐真菌;TAN等[13]从武汉低温冷藏的腐烂板栗中确立优势致腐真菌为青霉属、根霉属、链格孢属和曲霉属。板栗因品种、种植环境和贮藏条件等因素不同,导致其致腐菌差异较大,且至今尚未见望谟板栗致腐微生物的报道。因此,为明确望谟板栗冷藏期腐烂栗果的致腐菌,本研究展开了板栗致腐菌的分离纯化、致腐性验证、形态学观察和分子生物学鉴定,并分析其生物学特性,以期为深入研究其致腐机制和有效调控板栗冷藏的方式与条件提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
板栗采自贵州光秀生态食品有限责任公司冷库,产地为贵州省望谟县,冷库温度为-2 ℃,每周喷洒1次蒸馏水保湿。采样过程用无菌采样袋装样后立即放入装有冰袋的泡沫箱中运回实验室冷库,冷藏条件与公司相同。实验中所有真菌的培养均使用马铃薯琼脂葡萄糖(potato dextrose agar,PDA)培养基。
LDZE-75KB-Ⅱ高压灭菌锅,上海申安医疗机械厂;SPX-150BⅢ生化培养箱,天津市泰斯特仪器有限公司;RO-DI-30LK优纯超纯水机,济南飞蓝水处理设备有限公司;SW-CJ-2D超净工作台,浙江苏净净化设备有限公司。
1.2 致腐菌的分离与纯化
板栗致腐菌的分离纯化采用组织分离法[18]。选取自然腐烂板栗,在无菌操作台中剥去栗壳,用已灭菌的手术刀在栗果病健交界处切5 mm×5 mm组织块,于75%乙醇中浸泡30 s,无菌水冲洗3次,用滤纸吸干表面水分,再用已灭菌的镊子将组织块放入PDA平板中,每个平板放3块。将平板放入25 ℃恒温培养箱中培养,待菌落长出后,根据其颜色、形态、大小等表型差异,挑取不同形态、颜色的菌落进行纯化培养。
1.3 致腐菌的形态学鉴定
将致腐菌在PDA平板上25 ℃培养3～5 d,根据菌落形态、色泽、生长速度以及在光学显微镜下的菌丝及孢子形态等特征,对致腐菌进行初步形态学鉴定。具体方法如下:于载玻片上滴加乳酸酚棉蓝染色液,用接种环挑取边缘处菌丝置于染色液中,盖片,用滤纸吸去盖玻片周围溢出的液体,烤片直至染色液轻微沸腾为止,置于显微镜先低倍后高倍镜检。
1.4 致腐性鉴定
采用针刺法和菌饼接种法[21]。剔除病果、虫果及裂果,选取健康板栗用75%乙醇浸泡消毒3～5 min,无菌水冲洗3次,在超净工作台中轻轻风干栗壳表面水分,剥去板栗顶芽处的外壳和种皮,用针轻刺栗仁接种部位,取7 mm活化后的菌丝块接种于伤口表面,保鲜膜固定,以脱脂棉沾无菌水为对照,于培养皿中25 ℃恒温保湿培养。24 h后去掉菌饼,对腐烂栗果的致腐菌再次进行分离纯化,与原接种菌进行比较。
1.5 致腐菌的分子生物学鉴定
从培养3～5 d的菌株上挑取适量菌丝,放入1.5 mL的灭菌离心管中,用研磨机将其磨碎,按照DNA基因组试剂盒(生工生物工程上海有限公司)说明书提取DNA。采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对致腐菌基因进行ITS扩增,PCR反应总体积25 μL,其中上下引物各1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 9.5 μL,50 mmol/L MgSO4 12.5 μL。ITS扩增程序:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30个循环,72 ℃修复延伸10 min,4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测,合格后送往生工(上海)公司测序。测序结果通过 NCBI 中的BLAST 进行同源性比对,用MEGA-X软件构建系统发育树。
1.6 致腐菌的生物学特性研究
取出4 ℃保存的菌株接种于PDA平板上,于25 ℃生化培养箱活化6 d后备用。
1.6.1 不同碳源对菌丝生长和产孢量的影响
以PDA为基础培养基,分别添加20 g/L的蔗糖、大豆多糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉置换PDA中葡萄糖,得到不同碳源培养基。将直径为5 mm的致腐菌菌饼分别接种于不同碳源培养基,3次重复,全暗条件下25 ℃恒温培养7 d后,采用十字交叉法测量菌落直径。于每个平板中加入10 mL无菌水,制成孢子悬浮液,使用血球计数板测定每毫升孢子悬浮液中孢子总数[22]。
1.6.2 不同氮源对菌丝生长和产孢量的影响
以PDA为基础培养基,分别添加5 g/L的蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、甘氨酸和尿素制备不同氮源培养基[23]。培养条件、菌丝生长和产孢量测定方法同1.6.1。
1.6.3 不同温度对菌丝生长和产孢量的影响
将5 mm直径的致腐菌菌饼接种于PDA平板,置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃全暗培养7 d,3次重复。菌丝生长和产孢量测定方法同1.6.1。
1.6.4 不同光照对菌丝生长和产孢量的影响
将5 mm直径的致腐菌菌饼接种于PDA平板,置于光照(24 h)、光暗交替(12 h)、黑暗(24 h)的25 ℃恒温培养箱中培养7 d,3次重复。菌丝生长和产孢量测定方法同1.6.1。
1.6.5 不同pH对菌丝生长和产孢量的影响
在无菌操作台中用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将PDA培养基的pH值分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0,将直径为5 mm的菌饼接种于PDA平板中央,全暗条件下25 ℃恒温培养7 d,3次重复。菌丝生长和产孢量测定方法同1.6.1。
1.7 数据处理
Origin 2018 64Bit和IBM SPSS Statistics 25进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 分离纯化结果
从腐烂栗果中共分离出46株真菌,经致腐性验证获得5株致腐性较强且满足柯赫氏法则的真菌,致腐率分别为100%、100%、53.3%、100%和73.3%,选取致腐率为100%的3株菌分别命名为WC、WK和HK。
2.2 分离菌株的菌落及形态特征
根据菌落特征、菌丝和孢子形态等对3株菌进行初步形态学鉴定,培养5 d后其菌落特征与显微结构如图1所示。WC菌丝呈棉絮状,边缘菌丝较稀薄,生长速度快。菌落正面呈白色,背面为橙黄色,能产生小型分生孢子,孢子呈长椭圆形,具有隔膜,表面光滑,分生孢子梗具分枝。WK菌落中心有脐状突起,其他部分有放射状条纹、质地绒状,菌落边缘兼有粉粒状,生长速度较慢。菌落正面边缘为白色,中部灰绿色,背面初期为黄色,后期为黄褐色。分生孢子大量产生,由蓝绿色转变至黄绿色,孢子呈现球形,较平滑,分生孢子梗呈扫帚状,排列紧密。HK菌落呈絮状,圆形,生长迅速。菌落正背面同色,但正面颜色略深于背面,初期呈黄褐色,后期呈棕褐色。菌丝及分生孢子梗为褐绿色,分生孢子倒棒状,表面具横隔和纵隔,成壁砖状结构,横隔较粗,末端喙短,排成较长的直链或斜链,大小较一致。
a-WC;b-WK;c-HK
图1 WC、WK、HK的菌落形态特征
Fig.1 Morphological characteristics of WC, WK, and HK
2.3 致腐性鉴定
利用针刺法和菌饼接种法对板栗进行致腐性验证,接种致腐菌10 d后板栗腐烂情况见图2。健康板栗接种WC菌株3 d后开始腐烂,初期病斑呈浅褐色,外缘处有黑色晕圈,中期腐烂程度加剧,病斑扩大且颜色逐渐加深至深褐色,湿度大时会出现白色或浅紫色菌丝体,有异味并分泌黏状物。深褐色湿腐,组织湿润松散,后期病斑不断扩大,腐烂程度不断加剧直至板栗完全腐烂。健康板栗接种WK菌株4 d后开始腐烂,初期病斑为深褐色,外缘处有淡黄色晕圈,中期病斑逐渐扩大,产生大量灰绿色孢子。深褐色干腐,组织干燥紧实,后期腐烂程度仍会加剧,但病斑无扩大现象。健康板栗接种HK菌株4 d后开始腐烂,初期病斑呈黑色,中期腐烂程度加剧,病斑不断扩大且颜色不断加深至黑灰色,菌丝体为黑色。黑灰色干腐,组织干燥紧实,后期腐烂程度仍会加剧,但病斑无扩大现象。对照组无腐烂现象。
a-WC;b-WK;c-HK;d-对照组
图2 致腐性鉴定
Fig.2 Corrosivity identification
2.4 分子生物学鉴定
以菌株WC、WK和HK的基因组DNA为模板,以ITS引物进行PCR扩增,WC、WK、HK分别获得535、563、535 bp条带,扩增产物测序后与BLAST进行比对,利用MEGA-X软件进行系统发育树绘制(图3)。经比对发现,WC与层出镰刀菌(Fusarium proliferatum) strain HYC1410080401处于同一分支,同源性达99%;WK与皮落青霉(Penicillium crustosum) strain DUCC5730处于同一分支,同源性达99%;HK与链格孢菌(Alternaria alternata )isolate S1处于同一分支,同源性达100%。因此,将WC、WK和HK分别鉴定为层出镰刀菌、皮落青霉和链格孢菌。
图3 WC、WK、HK的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of WC, WK, and HK
2.5 生物学特性研究
2.5.1 碳源对菌丝生长和产孢量的影响
3株菌对不同碳源的利用情况见图4。最适宜WC菌丝生长和产孢的碳源为乳糖,其次是蔗糖,而菌丝生长利用率最低的是大豆多糖,在产孢量上对大豆多糖、麦芽糖和可溶性淀粉的利用率差异不显著,研究表明百合枯萎病病原菌最适生长和产孢碳源分别为蔗糖和乳糖[24]。WK菌丝生长的最适碳源为乳糖,其他碳源处理对菌丝生长的影响区别不大,产孢的最适碳源是大豆多糖,且产孢量显著高于其他处理(P<0.05)。最利于HK菌丝生长和产孢的碳源分别是蔗糖、麦芽糖,其次是乳糖,不同碳源对HK产孢量的影响差异显著(P<0.05),有研究表明链格孢菌菌丝生长和产孢的最适碳源为蔗糖和葡萄糖[25]。这可能是由于以麦芽糖为碳源作为附加添加剂应用于固体培养基时,链格孢菌筛选出最高的糖化酶效价,可将麦芽糖水解为葡萄糖[26]。
a-WC;b-WK;c-HK
图4 碳源对菌丝生长和产孢量的影响
Fig.4 Effects of carbon source on mycelial growth and sporulation
注:不同小写字母代表差异显著(P<0.05)(下同)
2.5.2 氮源对菌丝生长和产孢量的影响
致腐菌对不同氮源的利用情况如图5所示。WC以甘氨酸为氮源时,菌丝生长最快且产孢量最大,与其他氮源相比差异较为显著,推测甘氨酸为层出镰刀菌生长的最适氮源,与翟雅鑫等[24]报道的层出镰刀菌产孢的最适氮源为甘氨酸结论一致。WK菌丝生长的最适氮源为尿素和甘氨酸,菌株产孢的最适氮源为尿素且产孢量与其他氮源具有显著差异(P<0.05)。HK菌丝生长和产孢的最适氮源为蛋白胨,其次为甘氨酸,以尿素为氮源时菌丝生长最慢且产孢量最低。王俊凤[21]、赵艳琴等[27]、刘行风等[25]研究表明链格孢菌菌丝生长和产孢的最适氮源为蛋白胨,可初步判定蛋白胨是适宜链格孢菌生长和产孢的氮源。由于望谟板栗中富含蛋白质,其中以天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸和甘氨酸为主[28],故3株致腐菌菌丝生长对甘氨酸利用率较高,说明3种致腐菌对氮源的利用情况存在相似性,因此能够同时引起板栗腐烂。
a-WC;b-WK;c-HK
图5 氮源对菌丝生长和产孢量的影响
Fig.5 Effects of nitrogen source on mycelial growth and sporulation
2.5.3 温度对菌丝生长和产孢量的影响
不同温度对WC、WK和HK菌丝生长和产孢的影响具有一定差异(图6)。WC在5～35 ℃均能生长和产孢,菌丝生长速度和产孢量在5～25 ℃与温度呈正相关,25～35 ℃呈负相关,高于40 ℃时停止生长和产孢,大量研究表明[29-31],层出镰刀菌菌丝生长和产孢的最适温度为25 ℃,故基本确定层出镰刀菌在25 ℃左右最适宜生长和产孢。WK菌丝生长及产孢的温度范围为5～30 ℃,菌丝生长和产孢的最适温度为25 ℃,超过35 ℃停止生长和产孢。HK在25 ℃时菌丝生长最快且产孢量最大,超过35 ℃菌丝生长和产孢受到明显抑制,40 ℃以上停止生长和产孢,与周英[32]对奉新猕猴桃病原菌研究结论一致。3株致腐菌菌丝生长和产孢最适温度皆为25 ℃,菌落直径和产孢量随温度升高或降低而减小,说明温度较高或较低对致腐菌生长和产孢都具有一定的抑制作用。
a-WC;b-WK;c-HK
图6 温度对菌丝生长和产孢量的影响
Fig.6 Effects of temperature on mycelial growth and sporulation
2.5.4 光照对菌丝生长和产孢量的影响
3株致腐菌在3种光照条件下均能生长(图7)。最利于WC和HK菌丝生长的光照条件为24 h黑暗,WK菌丝生长对光照不敏感;光照条件对3株菌产孢量的影响具有显著差异,不同光照条件下菌株产孢量的大小顺序为24 h黑暗>24 h光照>12 h交替(WC)、24 h黑暗>12 h交替>24 h光照(WK和HK)。研究表明层出镰刀菌菌丝生长对光照不敏感、12 h光暗交替最利于链格孢菌产孢与本研究结论存在差异[33-34],产生此现象的原因可能是由于寄主来源不同、生长环境不同导致其生物学特性存在差异。3株致腐菌株均在24 h黑暗条件下最适合菌丝生长及产孢,而板栗冷藏过程中长期处于黑暗的环境中,这为致腐菌的生长繁殖提供了优良场所。
a-WC;b-WK;c-HK
图7 光照条件对菌丝生长和产孢量的影响
Fig.7 Effects of light condition on mycelial growth and sporulation
2.5.5 pH对菌丝生长和产孢量的影响
在pH值为5.0～11.0时3株致腐菌均可生长(图8)。WC菌丝生长的最适pH值为7.0,菌落直径为7.15 cm,最适产孢的pH值为8.0,产孢量为42.6×106 CFU/mL,显著高于其他pH处理,孙万霞等[3]对板栗坏死病病原菌研究结果表明层出镰刀菌菌丝生长最适的pH值为7.0,与本研究结论一致。WK菌丝生长的最适pH值为8.0,菌落直径为3.8 cm,菌丝生长对pH不敏感,最适产孢的pH值为7.0,产孢量为74.9×106 CFU/mL。HK菌丝生长和产孢的最适pH值均为9.0,pH值在5.0～9.0时,菌落直径和产孢量随pH的增大而增大,pH>9.0时,菌落直径和产孢量随pH的增大而减小,与席军强等[35]、刘行风等[25]研究结果一致。3株致腐菌均在中性偏碱条件下菌丝生长较快且产孢量大,而在弱酸条件下菌丝生长较缓慢,尤其是产孢量显著降低,说明pH是影响菌丝生长和产孢量的原因之一。
a-WC;b-WK;c-HK
图8 pH对菌丝生长和产孢量的影响
Fig.8 Effects of pH on mycelial growth and sporulation
3 结论与讨论
板栗栗果腐烂是由多种真菌协同侵染造成,从板栗中分离出的致腐真菌包括镰孢菌属、青霉菌属、链格孢属、毛霉属和壳梭孢属等。本研究首次针对贵州望谟板栗致腐真菌展开了分离鉴定,并明确了层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、皮落青霉(Penicillium crustosum)和链格孢菌(Alternaria alternata)为冷藏期腐烂板栗的主要致腐菌。层出镰刀菌是一种重要的病原真菌,侵染作物后引起植株枯萎和腐烂,同时还产生伏马毒素、镰刀菌素C和镰刀菌酸等使食物受到污染,致使作物产量和品质造成严重的损失。陶怡[36]从板栗树上未成熟的板栗中分离出层出镰刀菌,表明层出镰刀菌可能在花期已潜伏侵入其体内,采后贮藏不当致使栗果腐烂。皮落青霉是一种潜在的食源性致病菌,极易侵染含糖量较高的食物,如柑橘、哈密瓜、玉米等,导致其腐败并产生神经毒素。新鲜的意大利板栗、发霉的陕西镇安板栗中均可分离出皮落青霉[37-38],表明皮落青霉能够适应不同环境且普遍存在于板栗中。板栗壳的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素[39],而皮落青霉可分泌果胶酶和内切葡聚糖酶EGL1[40-41],因此皮落青霉可能通过分泌酶将板栗壳降解后再侵染栗果而导致其腐烂。链格孢菌是板栗内生真菌之一,是一种能在低温环境下完成生长繁殖的致腐性丝状真菌,在板栗枝、叶、花、果中均可分离得到,且可引起板栗灰斑病[21],其多种次级代谢产物具有致突变、致癌、致畸和致死等毒性[42]。鉴于此,我们初步推断冷藏期的板栗腐败主要是由层出镰刀菌、皮落青霉和链格孢菌协同作用引发的。
通过研究不同碳源、氮源、温度、光照和pH对致腐菌菌丝生长及产孢的影响,发现层出镰刀菌菌丝生长和产孢最适碳源为乳糖、氮源为甘氨酸、温度为25 ℃、光照条件为24 h黑暗,最适菌丝生长和产孢的pH值分别为7.0和8.0;皮落青霉菌丝生长和产孢最适温度为25 ℃、氮源为尿素、光照条件为24 h黑暗,菌丝生长最适碳源为乳糖、pH值为8.0,菌株产孢最适碳源为大豆多糖、pH值为7.0;链格孢菌菌丝生长和产孢最适温度为25 ℃、氮源为蛋白胨、pH值为9.0、光照条件为24 h黑暗,以蔗糖为碳源时菌丝生长最快,麦芽糖为碳源时产孢量最大。板栗果实中淀粉含量最多,其次是游离糖,而游离糖中蔗糖含量较高,其余小部分包括葡萄糖和果糖[43]。蛋白质含量约占新鲜板栗的5.7%～10.7%,其中以天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸和甘氨酸为主。另外,板栗还富含多种矿物质、维生素和纤维素等。因此,板栗能量高、营养丰富,为层出镰刀菌、皮落青霉和链格孢菌等致腐菌生长、繁殖及代谢提供了理想基质,此外冷藏过程中潮湿黑暗的环境为致腐菌生长繁殖提供了优良场所。
本研究明确了望谟板栗冷藏期腐烂栗果的致腐菌及其生物学特性,初步了解致腐菌与环境条件的相关性,可为后期针对性防控致腐菌侵染和抑菌剂开发提供理论指导,对降低板栗腐烂率、延长贮藏期具有重要意义,且为下一步深入研究腐败菌的致腐机制提供科学依据。
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